杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代花青苷變異特征

楊美英，李建賓，張 瑩，李辛雷＊，劉信凱，鐘乃盛，黎艷玲

（1.云南農業(yè)大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；3.廣州棕科園藝開發(fā)有限公司，廣東 廣州 511316）

山茶花（Camellias）是我國傳統(tǒng)名花，花色為其重要觀賞性狀[1]?；ㄇ嘬諡樯讲杌ɑㄉ纬傻奈镔|基礎，總花青苷及主要花青苷含量決定其花色[2-4]。研究還表明，花青苷具有抑制腫瘤[5-6]、降血糖[7]和抗氧化[8-9]等作用，可用于醫(yī)藥、保健和化妝等產品的開發(fā)。Li等[10-11]利用核磁共振、質譜和紫外可見光譜等技術研究了山茶花花青苷，分別在滇山茶（Camellia reticulata Lindl.）中鑒定出5種含2-O-β-木糖基及其相應不含2-O-β-木糖基的花青苷，滇山茶園藝品種‘大理茶’中鑒定出10種含2-O-β-木糖基花青苷。李辛雷等[2,4]應用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測和超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用技術，從山茶（C.japonica L.）不同花色品種中鑒定了出7種花青苷，且其花色隨總花青苷及主要花青苷含量增加而加深。

杜鵑紅山茶（C.azalea Wei）四季開花，是培育四季茶花的優(yōu)良親本[12]，廣州棕科園藝開發(fā)有限公司通過杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交，已培育出新品種50余個[13]。已有杜鵑紅山茶研究主要集中于種群結構[14]、生理特性[15]、生物學特性[16]和繁殖[17-18]等方面，李辛雷等[19]對其色素成分進行了初步研究，但其花青苷從親本到雜交后代的變異特征尚不清楚。鑒于此，本試驗應用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測（HPLC-DAD）和超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLCQ-TOF-MS），對杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其雜交后代花青苷成分與含量進行研究，明確其花青苷變異特征，以期為高花青苷含量山茶花新品種選育提供科學依據，進一步為其花青苷功能產品的開發(fā)利用提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其35個雜交F1代。杜鵑紅山茶和山茶‘媚麗’分別標記為D和M，以山茶‘媚麗’為母本，杜鵑紅山茶為父本的27個雜交后代標記為MD系列，以杜鵑紅山茶為母本，山茶‘媚麗’為父本的8個雜交后代標記為DM系列。杜鵑紅山茶花色為鮮紅色，單瓣型，山茶‘媚麗’花色為玫瑰紅色，花瓣邊緣帶有白邊，半重瓣型至牡丹型。杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代花色深紅至淺紅不等，花型有單瓣型、半重瓣型和托桂型等（圖1）。所有材料采自廣州棕科園藝開發(fā)有限公司。選取生長環(huán)境相同，長勢一致的植株5株，對盛開期的花朵進行隨機采樣，每個植株采3朵，裝入密封袋后置于有保鮮冰袋的保鮮箱中保存。樣品帶回實驗室后，?80 ℃冰箱中保存。

圖1 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’及代表性雜交后代Fig.1 C.azalea ,C.japonica 'Meili' and their representative hybrids

1.2 試驗方法

1.2.1 花青苷定性分析 使用液氮研磨花瓣，稱取2 g倒入試管中，加入5 mL提取液（三氟醋酸:甲酸:水:甲醇，體積比1:2:27:70），搖勻，封口膜封口，常溫下浸提24 h。浸提結束后，經脫脂棉和0.22 μm的濾膜依次過濾，濾液倒入2 mL棕色進樣瓶中密封保存，最后置于?20 ℃冰箱中備用[20-21]。

應用Waters（Waters Alliance 2 695，USA）的高效液相色譜-光電二極管陣列檢測（HPLCDAD）分析系統(tǒng)進行色素分析。色譜柱為TSK gel ODS-100Z（150 mm×4.6 mm，柱內直徑為5 μm，Tosoh，Japan）。分析條件：柱溫40 ℃，流速1 mL·min?1，進樣量 20 μL，檢測波長 525 nm。流動相A為水:磷酸（體積比98.5:1.5）；流動相B為水:乙腈:甲酸:四氫呋喃:磷酸（體積比48.5:25:20:5:1.5），配制的溶液在減壓條件下用0.22 μm的微孔濾膜過濾，超聲脫氣后備用。梯度洗脫程序：0～15 min，B液濃度從22%上升至28%；15～35 min，B液從28%上升至68%[22]。

利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLC-Q-TOF-MS），結合混合標準品Cy3Ga和Cy3G共洗脫試驗，進行花青苷結構鑒定。設備為ACQUITYTM UPLCⅠ-Class 超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters Corporation，Milford，MA，USA），Xevo G2-XS QTof MS質譜系統(tǒng)（Waters Corporation，Manchester，UK），UNIFI 1.8 軟件系統(tǒng)。色譜條件與上述色素定性分析條件一致。質譜分析條件：電噴霧電離離子源（ESI），正離子模式，全離子掃描，掃描范圍（m/z）：50～1 200 u。脫溶劑氣體為高純度氮氣，溫度450 ℃，流速600 L·h?1，毛細管電壓為1 kV，錐孔電壓為40 V。低能量掃描電壓為6 eV，高能量掃描電壓為20～45 eV。

1.2.2 花青苷定量分析 標準品矢車菊素-3-O-β-葡萄糖苷（Cy3G）和矢車菊素-3-O-β-半乳糖苷（Cy3Ga）購于上海源葉生物科技有限公司（純度≥98%）。根據朱滿蘭等[23]方法，采用標準品半定量法計算各樣品每克新鮮花瓣中含有的相對于標準品的花青苷含量（μg·g?1），重復3次。

2 結果與分析

2.1 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代花素青苷鑒定

根據UPLC-Q-TOF-MS圖譜，對杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其雜交后代花瓣中花青苷成分進行鑒定，共檢測到14種花青苷（圖2），其紫外-可見光譜及質譜數(shù)據見表1。根據Cy糖苷在513～520 nm有特征吸收峰及碎片離子m/z 287，推定14種花青苷均為Cy型花青苷[24]；花青苷在440 nm與λvis-max兩處吸收值之比A440/Avis-max變化范圍為32%～34%，確定14種花青苷均為3-O-糖苷類型[25-26]。根據290～340 nm波長下肩峰的出現(xiàn)推定化合物被芳香酸?；痆27]，峰P5～P14在310～316 nm波長下肩峰的出現(xiàn)推定其花青苷被芳香酸酰化。

圖2 杜鵑紅山茶與‘媚麗’雜交品種花青苷成分的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of anthocyanin components in hybrids of C.azalea and C.japonica 'Meili'

表1 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代花青苷的紫外–可見吸收光譜與質譜數(shù)據Table 1 Chromatographic and spectral data of anthocyanins in hybrids of C.azalea and C.japonica 'Meili'

峰P2和P4質譜數(shù)據為分子離子m/z 449，碎片離子m/z 287，其中，m/z 287為Cy苷元特征質荷比，其裂解釋放162 u對應一分子己糖；根據峰P2和峰P4與標準品Cy3Ga和Cy3G共洗脫特性以及花青素半乳糖洗脫時間小于花青素葡萄糖苷特性[24]，確定峰P2為矢車菊素-3-O-β-半乳糖苷，峰P4為矢車菊素-3-O-β-葡萄糖苷[28-29]。峰P1和P3質譜數(shù)據為分子離子m/z 581，碎片離子m/z 449、287，m/z 581到m/z 449丟失132 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u，參考Li等[10-11]文獻，推定其分別為矢車菊素-3-O-（2-O-β-木糖基）-β-半乳糖苷（Cy3GaX）、矢車菊素-3-O-（2-O-β-木糖基）-β-葡萄糖苷（Cy3GX）。

峰P5和P10質譜數(shù)據為分子離子m/z 611，碎片離子m/z 449、287，m/z 611到m/z 449丟失162 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u，判定其為矢車菊素-3-O-[6-O-（E）-咖啡酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaECaf）和矢車菊素-3-O-[6-O-（E）-咖啡酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GECaf）[2-4]。峰P6和P9質譜數(shù)據為分子離子m/z 743，碎片離子m/z 611、449、287，m/z 743到m/z 611丟失132 u，m/z 611到m/z 449丟失162 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u，推定其為矢車菊素-3-O-（2-O-β-木糖基-6-O-（E）-咖啡酰）-β-半乳糖苷（Cy3GaECafX）和矢車菊素-3-O-（2-O-β-木糖基-6-O-（E）-咖啡酰）-β-葡萄糖苷（Cy3GECafX）。

峰P8、P11和P14質譜數(shù)據為分子離子m/z 595，碎片離子m/z 449、287，m/z 595到m/z 449丟失146 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u；根據其A440/Avis-max（34%）及在310、313 nm波長下肩峰的出現(xiàn)，推定其為Cy-3-O-芳香酸酰化型糖苷而排除鼠李糖苷[30]；根據順式花青苷洗脫時間小于反式花青苷[31-32]及花青素半乳糖苷洗脫時間小于花青素葡萄糖苷的特性，判定峰P8、P11和P14分別為矢車菊素-3-O-[6-O-（Z）-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaZpC）、矢車菊素-3-O-[6-O-（E）-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaEpC）和矢車菊素-3-O-[6-O-（E）-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GEpC）。

峰P7、P12和P13質譜數(shù)據為分子離子m/z 727，碎片離子m/z 595、449、287，m/z 727到m/z 595丟失 132 u，m/z 595到m/z 449丟失146 u，m/z 449到m/z 287丟失162 u，推定其分別為矢車菊素-3-O-[2-O-β-木糖基-6-O-（Z）-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaZpCX）、矢車菊素-3-O-[2-O-β-木糖基-6-O-（E）-p-香豆酰]-β-半乳糖苷（Cy3GaEpCX）和矢車菊素-3-O-[2-O-β-木糖基-6-O-（E）-p-香豆酰]-β-葡萄糖苷（Cy3GEpCX）[10-11]。

2.2 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷變異特征

杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其35個雜交后代中，‘媚麗’檢測到7種花青苷，其中Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC含量較高，Cy3GaECaf、Cy3GaZpC和Cy3GECaf含量均低于 10 μg·g?1。杜鵑紅山茶中檢測到14種花青苷，除與山茶‘媚麗’相同的7種外，還包括其相應的含2-O-β-木糖基的花青苷；含量較高的花青苷有8種（表2），分別為Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC以及相應的含2-O-β-木糖基的Cy3GX、Cy3GaX、Cy3GEpCX和Cy3GaEpCX，其余成分均低于 1 μg·g?1。杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’35個雜交后代除MD78外，均檢測到8種主要相關花青苷，其余成分含量均較低或未檢測到。

表2 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷含量Table 2 Content of main anthocyanins in hybrids of C.azalea and C.japonica 'Meili' μg·g?1

杜鵑紅山茶主要花青苷含量為 735.81 μg·g?1，山茶‘媚麗’主要花青苷含量為 526.61 μg·g?1，杜鵑紅山茶主要花青苷含量為‘媚麗’的1.40倍；雜交后代中主要花青苷含量高于杜鵑紅山茶的占11.43%，低于山茶‘媚麗’的占37.14%，雙親之間的占51.43%。雜交后代中Cy3GX、Cy3GaX、Cy3GEpCX和Cy3GaEpCX均來源于杜鵑紅山茶，其中Cy3GX、Cy3GaX含量低于杜鵑紅山茶，而Cy3GEpCX、Cy3GaEpCX含量大部分高于杜鵑紅山茶；Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC主要來源于山茶‘媚麗’，含量大部分介于雙親之間。山茶‘媚麗’中含葡萄糖苷的花青苷含量遠高于相應含半乳糖苷的花青苷；杜鵑紅山茶及雜交后代中含2-O-β-木糖基的花青苷含量基本上高于相應不含2-O-β-木糖基的花青苷，含葡萄糖苷的花青苷（除個別雜交后代外）含量也高于相應含半乳糖苷的花青苷。

2.3 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷比例的遺傳變異

杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷比例見表3。杜鵑紅山茶花瓣中主要花青苷Cy3GX、Cy3GaX分別占63.14%、19.17%，合計82.30%；其次為Cy3G、Cy3GEpCX和Cy3GaEpCX，分別占6.08%、5.42%和3.17%。山茶‘媚麗’主要成分Cy3GEpC、Cy3G分別占44.76%、40.26%，合計85.02%；其次為Cy3GaEpC、Cy3Ga，分別占8.18%、5.27%。雜交后代中，Cy3GX、Cy3GaX所占比例均低于杜鵑紅山茶，而Cy3GaEpCX（除MD72外）所占比例均高于杜鵑紅山茶；Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC所占比例大部分介于雙親之間，其中，Cy3GX、Cy3GEpCX平均比例分別為31.24%、22.18%，合計53.42%；Cy3G、Cy3GEpC平均比例分別為15.37%和14.20%，合計29.57%?？梢?，杜鵑紅山茶花青苷主要成分為Cy3GX和Cy3GaX，山茶‘媚麗’為Cy3GEpC和Cy3G，雜交后代主要成分為Cy3GX和Cy3GEpCX，其次為Cy3G和Cy3GEpC。

表3 杜鵑紅山茶與山茶‘媚麗’雜交后代主要花青苷比例Table 3 Proportion of main anthocyanins in hybrids of C.azalea and C.japonica 'Meili' %

3 討論

植物花色是多種因子協(xié)同作用的結果，細胞內特定色素的存在是根本內因[33-35]。山茶花的花瓣中色素主要為類黃酮，其中，黃色系山茶花主要為黃酮醇類[36-37]；紅色系山茶花主要為矢車菊素類[2]。本試驗應用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器和超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用技術，從杜鵑紅山茶及其雜交后代中鑒定出14種花青苷，7種不含2-O-β-木糖基的花青苷與山茶花研究結果相符[2-4]，7種含2-O-β-木糖基的花青苷與滇山茶品種‘大理茶’研究一致[11]；8種組分含量較高，即Cy3GX、Cy3GaX、Cy3GEpCX和Cy3GaEpCX以及相應不含2-O-β-木糖基的Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC；山茶‘媚麗’中未檢測到含2-O-β-木糖基花青苷，表明雜交后代中含2-O-β-木糖基花青苷主要遺傳自杜鵑紅山茶。

本試驗中杜鵑紅山茶8種主要花青苷總量高于山茶‘媚麗’，雜交后代主要花青苷總量大部分介于雙親之間，少量高于杜鵑紅山茶或低于山茶‘媚麗’，表明其雜交后代花青苷總量存在較大的變異。雜交后代中Cy3GX、Cy3GaX含量均低于杜鵑紅山茶，Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC含量基本上介于雙親之間；但Cy3GEpCX、Cy3GaEpCX含量基本上高于杜鵑紅山茶，這可能由于存在雜種優(yōu)勢，具體原因有待于進一步研究。杜鵑紅山茶及其雜交后代中，含葡萄糖苷花青苷高于相應含半乳糖苷花青苷，相關結果與已有山茶花青苷研究一致[2-4]；含2-O-β-木糖基花青苷含量高于相應不含2-O-β-木糖基花青苷，與滇山茶品種研究結果相符[11,38]，表明含2-O-β-木糖基花青苷遺傳能力大于相應不含2-O-β-木糖基花青苷。

杜鵑紅山茶主要花青苷為Cy3GX和Cy3GaX，二者合計占其花青苷總量的82%以上；山茶‘媚麗’主要為Cy3GEpC和Cy3G，合計占85%以上；雜交后代中主要花青苷Cy3GX和Cy3GEpCX占50%以上，其次是Cy3G和Cy3GEpC約占30%，含2-O-β-木糖基的花青苷所占比例遠高于相應不含2-O-β-木糖基的花青苷，也表明含2-O-β-木糖基的花青苷具較強的遺傳能力。雜交后代中Cy3GX、Cy3GaX比例降低，Cy3GEpCX、Cy3GaEpCX比例升高，具體原因有待于進一步研究。林艷等[39]對仙客來（Cyclamen persicum Mill）、李曉麗等[40]對月季（Rosa chinensis Jacq.）和陳和明等[41]對秋石斛蘭（Dendrobium spp.）的研究結果表明，白色花與紅色花雜交后得到的絕大部分是紅色花，紅色的花色遺傳能力強于白色；本試驗中杜鵑紅山茶鮮紅色，山茶‘媚麗’玫瑰紅色帶白邊，其雜交后代大部分花色為紅色，少量帶白邊或零星白斑，也表明其紅色遺傳能力強于白色。李辛雷等[2-4]研究表明，山茶花的花青苷成分含量與比例均影響其花色，本試驗中杜鵑紅山茶雜交后代花青苷成分含量與比例對花色的影響不明顯，具體原因有待于進一步研究。

本試驗中11.43%的雜交后代主要花青苷總量高于杜鵑紅山茶，最高為其近2倍（1 406.15 μg·g?1），表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢，其花瓣中花青苷具有開發(fā)利用價值。通過利用花青苷含量高的雜交后代與杜鵑紅山茶回交，有望增加其花青苷的積累，進一步選育出高花青苷含量的新品種。此外，杜鵑紅山茶雜交后代具有四季開花的特性，為其花青苷利用提供了穩(wěn)定的材料，具有良好的開發(fā)前景。

4 結論

本試驗應用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器和超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯(lián)用技術，對杜鵑紅山茶、山茶‘媚麗’及其雜交后代中花青苷進行分析，從杜鵑紅山茶及其雜交后代中鑒定出14種花青苷，7種含2-O-β-木糖基的花青苷來源于杜鵑紅山茶。杜鵑紅山茶主要花青苷總量高于山茶‘媚麗’，雜交后代花青苷總量存在較大的變異，Cy3GX、Cy3GaX含量均低于杜鵑紅山茶，Cy3GEpCX、Cy3GaEpCX含量總體上高于杜鵑紅山茶，Cy3G、Cy3Ga、Cy3GEpC和Cy3GaEpC含量基本上介于雙親之間。杜鵑紅山茶及其雜交后代中含2-O-β-木糖基的花青苷含量高于相應不含2-O-β-木糖基花青苷，含葡萄糖苷花青苷高于相應含半乳糖苷花青苷。杜鵑紅山茶主要花青苷為Cy3GX和Cy3GaX，山茶‘媚麗’為Cy3GEpC和Cy3G，雜交后代主要為Cy3GX和Cy3GEpCX，其次為Cy3G和Cy3GEpC，含2-O-β-木糖基的花青苷所占比例高于相應不含2-O-β-木糖基的花青苷，表明含2-O-β-木糖基的花青苷具較強的遺傳能力。