乙型肝炎病毒耐藥突變位點與基因型及肝硬化相關性研究

鄭璟 彭燕燕

目前核苷(酸)類似物(NA)是治療慢性乙型肝炎主要藥物，強效低耐藥藥物如恩替卡韋(ETV)、替諾福韋酯(TDF)、丙酚替諾福韋(TAF)等已經(jīng)作為臨床初治患者的首選。NA在臨床應用中嚴重不良反應較為少見，但HBV可在抗病毒藥物壓力下獲得適應性變異，誘導HBV聚合酶基因反轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)域的耐藥突變，使抗病毒藥物敏感性下降，導致治療失敗[1]。研究表明耐藥突變位點與基因型可能存在一定關聯(lián)[2,3]，但尚無明確定論。本研究通過檢測RT區(qū)域的耐藥突變位點，分析其與不同HBV基因型、疾病進程(慢性乙型肝炎與肝硬化)的相關性，為臨床病情分析及抗病毒藥物的選擇提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

2015年10月至2019年10月汕頭市中心醫(yī)院門診及住院乙型肝炎患者391例，男290例，女101例。其中慢性乙型肝炎患者342例，肝硬化患者43例，肝衰竭患者4例和肝癌患者2例。診斷符合2015版《慢性乙型肝炎防治指南》，排除甲、丙、丁、戊、庚等其他類型肝炎病毒感染、藥物性肝炎、酒精性肝炎及自身免疫性肝炎等可導致肝臟病變的疾病。入組患者均經(jīng)過NA治療。本研究通過汕頭市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

二、研究方法

(一) HBV基因型及耐藥突變位點檢測 清晨抽取患者靜脈血，4 000 r/min離心5 min分離血漿，置4℃冰箱保存。外送至廣州達安臨檢中心檢測，采用HBV耐藥基因突變檢測試劑盒(深圳亞能生物技術有限公司)進行核酸提取、擴增，最后在深圳亞能YN-H16分子雜交儀上進行雜交顯色。

(二)HBV基因型及耐藥位點結(jié)果判讀 按照試劑盒說明書進行基因型及耐藥位點顯色結(jié)果分析，包括常見基因型B、C、D型及6種NAs常見耐藥突變位點(野生型：rt180L、rt204M、rt207M、rt207V、rt181A、rt236N；突變型：rt180 M、rt204V、rt204I、rt207I、rt181V、rt236T)。

三、統(tǒng)計學處理

使用SPSS V19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。不同基因型組之間、慢性乙型肝炎與肝硬化組之間不同耐藥位點突變率的比較采用卡方檢驗進行分析，若1≤理論頻數(shù)<5時，采用連續(xù)校正卡方檢驗；當理論頻數(shù)<1時，用Fisher確切概率法計算概率。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、基因型與耐藥突變位點的關系

391例乙型肝炎患者中B基因型345例，其中103例有耐藥位點突變，C基因型46例，13例有耐藥位點突變；D基因型為0例。在HBV常見6個耐藥位點中C基因型的rtL180M耐藥突變率高于B基因型，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而兩種基因型的其他耐藥位點突變率差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。進一步分析116例聯(lián)合突變模式的構(gòu)成比，rtL180M+rtM204V在基因型C中的比例(6/13)顯著高于基因型B(16.5%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 HBV常見六個耐藥位點突變率與不同基因型的關系[例(%)]

表2 B和C基因型中聯(lián)合突變模式構(gòu)成比[例(%)]

二、HBV常見6個耐藥位點突變率與慢性乙型肝炎、肝硬化的關系

選取慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者進行統(tǒng)計分析，位點rtA181V在肝硬化患者中的突變率(7.0%)顯著高于慢性乙型肝炎患者(0.3%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他突變位點rtL180M、rtM204V、rtM204I、rtV207I、rtN236T在突變型與野生型之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 HBV常見6個耐藥位點突變率與慢性乙型肝炎、肝硬化關系[例(%)]

討 論

由于HBV復制極其活躍并缺乏反轉(zhuǎn)錄酶校對功能，具有高變異性，在藥物選擇下產(chǎn)生的耐藥突變?nèi)菀讓е虏∏榉磸停斐膳R床治療困難。HBV RT區(qū)基因位點的突變與基因型、不同病程的關系錯綜復雜[4]。

本研究結(jié)果表明，基因型C型HBV的位點rtL180M和rtM204V+rtL180M的突變率高于基因型B型，與以往研究相一致。 Zhang等[5]報道，相比基因型B型，基因型C型中rtL180M具有更高的突變率(54.7%比36.1%,P=0.002)。Ma等[2]報道，rtL180M和rtM204V+rtL180M突變在基因型C型中更為常見。研究表明，HBV RT區(qū)核苷酸類似物耐藥相關位點突變對HBV基因型具有偏向性。HBV基因組由不完全環(huán)狀雙鏈DNA構(gòu)成，包括P區(qū)、S區(qū)、C區(qū)與X區(qū)四個開放閱讀框，P區(qū)主要包括反轉(zhuǎn)錄酶(RT)、末端蛋白、非編碼間隔區(qū)及RNA酶H區(qū)。由于RT區(qū)和S基因具有相同的DNA序列，RT區(qū)的變異也可以引起S基因的改變。有研究顯示，rt180的沉默突變導致了S基因的錯義突變，即RT區(qū)中rt180位點的突變會導致HBsAg中172 Trp>Ser (W172S)的突變[6]。而S突變可能通過不同的途徑引起肝臟疾病，導致包膜蛋白和病毒顆粒的積聚和誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而促進HBV免疫逃逸和原發(fā)性肝癌的發(fā)展。本研究中rtM204V+rtL180M互補突變組合在基因型C型中的比例顯著高于B 型。有報道顯示rtL180M能作為補償性突變與rtM204V共同作用而增強病毒的復制能力，增加機體罹患肝細胞癌的風險[7,8]。因此，相對于基因型B型，對基因型C型患者的突變位點檢測及病情進程監(jiān)測可能更顯重要。

目前國內(nèi)外報道了較多的rtA181V/T與肝細胞癌關系研究[9,10]，而對rt181位點與肝硬化關系研究較少。有文獻報道，rt181位點突變的出現(xiàn)不僅增加了慢性乙型肝炎轉(zhuǎn)變成為肝細胞癌的風險，而且肝硬化是這一突變發(fā)生的獨立預測因子[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，rtA181V在使用過NA治療肝硬化患者中的突變率顯著高于慢性乙型肝炎患者，提示rtA181V的出現(xiàn)與肝硬化風險的增加密切相關。rtA181T突變和rtA181V突變的變異存在不同之處：rtA181T突變導致S區(qū)sW172*取代，提前產(chǎn)生終止密碼子，具有HBsAg和病毒粒子分泌缺陷可能導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，最終導致肝臟疾病[12-15]；而rtA181V變異后可引起表面抗原出現(xiàn)氨基酸的置換，S基因173位亮氨酸被置換變異為苯丙氨酸，并不引起表面抗原的截短或缺失[16]，該位點對于肝硬化發(fā)生機制的影響還需要進一步驗證?？共《局委熀蟀l(fā)生肝硬化的患者肝細胞癌發(fā)生率更高，因此，及時監(jiān)測慢性乙型肝炎經(jīng)治患者中rtA181V突變，對于調(diào)整臨床治療策略降低病情惡化概率具有一定臨床意義。

綜上所述，HBV基因不同位點的耐藥突變率與不同基因型和肝硬化相關。在病情早期檢測不同耐藥突變位點和基因型，能為臨床病情監(jiān)測及選擇合適藥物提供參考，有助于減少因耐藥而導致治療效果不佳的情況，最終使患者受益。