染色體易位攜帶者的胚胎基因組拷貝數(shù)變異分析

李哲濤，李伍高，唐永梅，秦祖興，唐妮，何萍，唐寧

染色體平衡易位是人群中最常見染色體結(jié)構(gòu)異常，在產(chǎn)前診斷樣本及新生兒中攜帶率分別為0.40%和0.19%[1]，其中包括相互易位和羅氏易位。染色體的平衡易位可以產(chǎn)生平衡和不平衡兩種分離方式，平衡的分離方式不會產(chǎn)生異常個體，除非斷點處伴隨有重要基因的缺失，而不平衡的分離可能導(dǎo)致不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子代發(fā)育遲緩、智力低下和出生缺陷等[2]。若夫妻雙方一方攜帶有染色體平衡易位，其流產(chǎn)風(fēng)險會增高，同時活產(chǎn)率也會降低。胚胎植入前染色體結(jié)構(gòu)重排遺傳學(xué)檢測(Preimplantation genetic testing for structural rearrangements，PGT-SR)是一種有效的改善易位攜帶者生育問題的一種方式，已廣泛在臨床上應(yīng)用[3]。本研究通過對PGT-SR結(jié)果的分析，進一步探討染色體平衡易位對胚胎染色體組成的影響因素及分離特點，為易位攜帶者遺傳咨詢提供更準確的數(shù)據(jù)支持和更有效的風(fēng)險評估。

1 資料和方法

1.1 研究對象

研究納入柳州市婦幼保健院2018年1月至2019年11月在本中心進行第三代輔助生殖患者，共收集140個PGT-SR周期病例，其中相互易位96個周期，羅氏易位44個周期。夫妻雙方均進行了外周血核型分析，且其中一方為染色體易位攜帶者。該項目通過柳州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者行PGT-SR前簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 囊胚活檢 采用常規(guī)長方案促排，于取卵后4 h采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)進行受精，16～18 h后檢查受精情況，胚胎培養(yǎng)至囊胚期參考Gardner評級系統(tǒng)進行評估，囊胚選擇標準為囊胚分期到達3～5期之間，囊胚內(nèi)細胞團達到C以上，外滋養(yǎng)層達到C以上，認為是可進行囊胚活檢。

1.2.2 PGT-SR檢測方法 將囊胚活檢的3～5個細胞轉(zhuǎn)移至PCR管中，活檢細胞全基因組擴增采用植入前胚胎染色體非整倍體檢測試劑盒(貝瑞和康，中國)。胚胎高通量測序檢測使用CN500測序平臺(Illumina公司，美國)，通過科孕安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(貝瑞和康，中國)對測序原始數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，質(zhì)控要求文庫濃度檢測濃度不小于10 ng/μL，原始數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾后的reads數(shù)≥2.7 M，質(zhì)量值Q30的堿基百分比≥80%，分析標準為Uniq reads≥1.5 M，對染色體進行整倍體、微缺失及微重復(fù)的判讀。

1.2.3 分析指標 根據(jù)高通量測序結(jié)果，胚胎存在≥10 M的拷貝數(shù)異常視為非整倍體胚胎。異常位置發(fā)生在易位的染色體處判為親緣易位的染色體，發(fā)生在非易位的染色體處判為非親緣易位的染色體異常，同時發(fā)生在易位和非易位的染色體處則判定為混合型異常。根據(jù)相互易位攜帶者性別、是否有近端著絲粒染色體及染色體斷裂點位置的不同，分別分析5種理論分離模式(2∶2對位分離、2∶2鄰近-1分離、2∶2鄰近-2分離、3∶1分離、4∶0分離或其他 )[4]所占的比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用例(%)表示，行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共納入染色體相互易位夫婦96個周期，女方平均年齡(31.68±3.96)歲，共培養(yǎng)囊胚637枚，檢測成功率為96.70%(616/637)，其中男性攜帶者57個周期，成功檢測350枚囊胚，女性攜帶者39個周期，成功檢測266枚囊胚。羅氏易位夫婦44個周期，女方平均年齡(31.02±3.67)歲，培養(yǎng)囊胚316枚，檢測成功率為94.94%(300/316)，其中男性攜帶者29個周期，成功檢測215枚囊胚，女性攜帶者15個周期，成功檢測85枚囊胚。

2.2 PGT-SR胚胎染色體異常情況分析

相互易位攜帶者胚胎染色體非整倍體率為81.8%(504/616)，顯著高于羅氏易位攜帶者(65.7%,197/300)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.300，P<0.001)。進一步分析攜帶者性別和女性年齡對胚胎染色體拷貝數(shù)異常的影響，發(fā)現(xiàn)在相互易位和羅氏易位中，男性攜帶者整倍體胚胎率均顯著高于女性攜帶者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而胚胎非整倍體率在不同女方年齡段中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表1。

表1 不同易位類型中攜帶者性別和女方年齡對胚胎非整倍體率的影響[例(%)]

2.3 胚胎異常染色體來源分析

將胚胎異常染色體來源分為3組，分別為親緣易位的染色體異常(胚胎異常的染色體來自于父方或母方易位染色體)，非親緣易位的染色體異常(胚胎異常的染色體不來自于父方或母方易位染色體，可能涉及一條或多條染色體異常)和混合型異常(胚胎異常的染色體來自于父方或母方易位染色體同時也發(fā)生在非親緣易位的染色體上)。女方年齡<35歲組的親緣性易位胚胎高于女方年齡≥35歲組(P<0.05)。相互易位組胚胎發(fā)生親緣易位的染色體異常率顯著高于羅氏易位組(χ2=17.082,P<0.001)，而羅氏易位組胚胎中非親緣易位的染色體異常高于相互易位組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=34.917,P<0.001)。相互易位組與羅氏易位組男性攜帶者胚胎產(chǎn)生非親緣易位的染色體異常比例高于女性攜帶者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 不同女方年齡和攜帶者性別對胚胎異常染色體來源的影響[例(%)]

非親緣易位的染色體異常與混合型異常占了很大比例，而這些異常都是新發(fā)變異引起的，為進一步分析在相互易位和羅氏易位攜帶者胚胎中新發(fā)變異的類型分布情況，將兩組新發(fā)異常的染色體分為：單體、三體、片段缺失/重復(fù)及嵌合4種情況進行比較。結(jié)果顯示各新發(fā)異常類型在相互易位和羅氏易位組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見下頁表3。

表3 不同指征患者間新發(fā)染色體異常類型分布情況[例(%)]

2.4 不同因素下的胚胎染色體分離模式分析

理論上相互易位的異常分離模式可分為：2∶2對位分離、2∶2鄰近-1分離、2∶2鄰近-2分離、3∶1分離和4∶0分離或其他5種，為探究這些分離模式的影響因素，分別對攜帶者性別，是否攜帶近端著絲粒染色體和斷裂點位置進行了分組比較。在不同攜帶者性別下，男方攜帶染色體易位組產(chǎn)生的配子在5種分離模式下所占的比例分布與女方攜帶者組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。進一步對各類型分離模式進行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)男方攜帶者產(chǎn)生正常/平衡配子的比例顯著高于女方攜帶者(χ2=4.777,P=0.029)，在女方攜帶者異常配子中，2∶2鄰近-2分離與3∶1分離的比例均高于男方攜帶者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將易位發(fā)生在近端著絲粒染色體的患者納入近端著絲粒染色體參與組，反之則納入非近端著絲粒參與組，兩組患者配子的分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，進一步兩兩比較分析發(fā)現(xiàn)，盡管兩組在產(chǎn)生正常/平衡的配子率上比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但有近端著絲粒染色體參與的分離，配子發(fā)生3∶1分離的比例高于非近端著絲粒染色體參與(P=0.001)。以易位的斷裂點位置是否在染色體末端分組，分為末端斷裂組與非末端斷裂組，兩組進行對比分析，發(fā)現(xiàn)斷裂點所在的位置對胚胎整倍體率及分離模式?jīng)]有影響。詳見表4。

表4 不同攜帶者性別、染色體種類及斷裂點位置下的胚胎染色體分離模式[例(%)]

3 討論

染色體易位攜帶者臨床上所表現(xiàn)的不孕不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、出生缺陷和死胎畸胎的不良妊娠結(jié)局等，主要原因是由于染色體不平衡分離，導(dǎo)致胚胎染色體拷貝數(shù)異常所造成的[5]。根據(jù)孟德爾遺傳定律，染色體相互易位攜帶者異常配子率為16/18，遠高于羅氏易位攜帶者4/6的異常配子率，與本研究的結(jié)果一致。對于攜帶者性別是否影響胚胎染色體分離，既往研究呈現(xiàn)出不一致的結(jié)論，Lledó B等[6]人分析了118枚第3天卵裂球結(jié)果發(fā)現(xiàn)，易位男性攜帶者與女性攜帶者產(chǎn)生的配子，正常/平衡的胚胎率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而Mateu-Brull E等[7]對易位攜帶者第3天的胚胎研究中發(fā)現(xiàn)女性攜帶者異常胚胎率更高，在第5天囊胚中染色體不平衡率沒有性別差異。本研究在對易位攜帶者第5天的胚胎分析中顯示，無論是在相互易位攜帶者中還是在羅氏易位攜帶者中，女性攜帶者胚胎非整倍體率均高于男性攜帶者，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，該結(jié)論與Zhang S[8]及其團隊的研究結(jié)果一致。隨著女方年齡的增長，胚胎染色體異常比例隨之增高[9]。在本研究中，相互易位和羅氏易位的高齡女性(≥35歲)，胚胎非整倍體率略高于<35歲的女性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同樣的結(jié)果，在Zhang S[8]和Ko DS[10]等團隊的研究中得到了驗證?？紤]是因為染色體結(jié)構(gòu)重組是影響易位攜帶者胚胎不平衡狀態(tài)的主要因素，不同于正常核型下其他因素所導(dǎo)致的染色體拷貝數(shù)異常，因此年齡的因素被弱化了。

對染色體間相互作用(inter-chromosomal effect,ICE)的研究一直存在爭議[11]，首次提出是在1963年，認為是由于染色體的易位，會影響其他正常染色體的分離從而導(dǎo)致配子染色體非整倍體的產(chǎn)生[12]。在排除女方年齡因素影響之后，我們發(fā)現(xiàn)相互易位攜帶者比羅氏易位攜帶者更容易產(chǎn)生親緣易位的染色體異常，而羅氏易位攜帶者產(chǎn)生非親緣易位的染色體異常(即新發(fā)異常)的配子比例更高，因為從理論上分析，相互易位攜帶者配子親緣異常的比例就比羅氏易位高，因此會導(dǎo)致兩種易位親緣和非親緣異常率存在著一定差異。進一步對攜帶者性別因素分析，男性易位攜帶者產(chǎn)生非親緣易位的染色體異常配子風(fēng)險高于女性易位攜帶者，與黃秋香等[13]的研究結(jié)果一致。分析差異的原因可能是精子數(shù)量龐大，在受精過程中會篩選掉部分親緣異常攜帶的精子，同時也有可能會產(chǎn)生一些新發(fā)異常的精子與卵子結(jié)合，從而導(dǎo)致非親緣性異常配子率增高，但是否與ICE相關(guān)仍需要進一步研究。對異常配子來源的分析發(fā)現(xiàn)，非親緣易位的染色體異常及混合型異常所占的異常比例較高，而這兩組異常均是由于新發(fā)異常引起的，這些新發(fā)異常的類型在相互易位和羅氏易位攜帶者胚胎中的分布并無差異，可見易位染色體有可能影響其他染色體的分離，但在分離類型上并沒有傾向性。

相互易位染色體異常配子分離的模式可以分為2：2對位分離、2∶2鄰近-1分離、2∶2鄰近-2分離、3：1分離和4∶0分離等，而只有2∶2對位分離的分離方式才能形成正常/平衡的可移植胚胎。本研究基于高通量測序的平臺上分析胚胎全基因組的拷貝數(shù)情況，有助分析胚胎的分離特點。而實際在分析囊胚期樣本時，4∶0分離模式下的產(chǎn)物很少見，在4∶0或其他分離組中，幾乎都是一些混亂分離的形式。為了進一步分析減數(shù)分裂分離模式的影響因素，分別對攜帶者性別，是否攜帶近端著絲粒染色體和斷裂點位置進行分析，發(fā)現(xiàn)女方易位攜帶者發(fā)生2∶2鄰近-2分離和3∶1分離模式明顯高于男方攜帶者，而男方易位攜帶者配子發(fā)生2∶2鄰近-1分離的比例略高于女方攜帶者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果與Zhang S等[8]的研究趨勢一致。在減數(shù)分裂時期，易位的近端著絲粒染色體容易形成不穩(wěn)定的四射體，Lim CK[14]的研究團隊報道了有近端著絲粒染色體參與的相互易位，其產(chǎn)生正常/平衡的配子比例低于非近端著絲粒染色體參與的易位，而本研究兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是在3∶1分離模式下，近端著絲粒染色體參與組產(chǎn)生配子的比例要高于非近端著絲粒組，結(jié)果與Lim CK等[14]的研究是一致的。同時在對斷裂點位置的分析中發(fā)現(xiàn)，斷裂點位置位于染色體末端的易位攜帶者，其胚胎正常率與非末端組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，產(chǎn)生2∶2鄰近-2分離的配子比例低于非末端組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，研究結(jié)果與Wang J等[15]相似。

本研究通過二代測序平臺，分析了染色體平衡易位攜帶者共916枚囊胚的基因組拷貝數(shù)情況。結(jié)果表明，胚胎染色體非整倍體的發(fā)生率與染色體平衡易位的類型及攜帶者的性別有關(guān)，相互易位攜帶者胚胎以親緣易位的染色體異常為主，羅氏易位攜帶者更容易產(chǎn)生新發(fā)的染色體異常，在男方攜帶中更為明顯。易位染色體中是否有近端著絲粒參與和易位斷裂點的位置是否在染色體末端影響減數(shù)分裂期間配子的分離模式，但與胚胎整倍體的比例不相關(guān)。