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    跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合CRISPR/Cas12a定量檢測(cè)海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌

    2022-08-02 03:11:08董換哲張?zhí)N哲
    食品科學(xué) 2022年14期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

    董換哲,苑 寧,張?zhí)N哲,楊 倩,3,*,盧 鑫,郭 威,張 偉,4,5,*

    (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北 保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院,河北 滄州 061100;3.河北大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,河北 保定 071002;4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071001;5.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071001)

    副溶血性弧菌()是一種廣泛存在于各種海產(chǎn)品中的食源性致病菌。在我國沿海地區(qū),副溶血性弧菌是發(fā)生細(xì)菌性食源性疾病的主要致病菌。食用受副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海產(chǎn)品,可能會(huì)引起人類患胃腸道疾病,其臨床癥狀包括腹瀉、腹部痙攣、嘔吐、發(fā)燒或發(fā)冷。此外,副溶血性弧菌也可通過開放性傷口傳播,甚至可導(dǎo)致敗血癥,嚴(yán)重時(shí)可危及生命。根據(jù)GB 29921ü2013《食品中致病菌限量》規(guī)定,海產(chǎn)品中副溶血性弧菌含量應(yīng)低于10CFU/g,從而降低由副溶血性弧菌引起的感染風(fēng)險(xiǎn)。因此,為有效監(jiān)測(cè)食品安全問題,開發(fā)快速且靈敏的副溶血性弧菌定量檢測(cè)方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

    傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法、核酸擴(kuò)增技術(shù)等是目前國內(nèi)外檢測(cè)副溶血性弧菌的主要方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)準(zhǔn)確、可靠,但至少需要3~5 d才能獲得最終結(jié)果,且靈敏度低,在快速檢測(cè)中應(yīng)用受限;免疫學(xué)檢測(cè)方法易受食品基質(zhì)影響,從而導(dǎo)致該方法靈敏度較低、特異性較差;核酸擴(kuò)增技術(shù)中的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在同一溫度下對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行快速擴(kuò)增,對(duì)儀器要求較低,通過金屬浴、水浴鍋等簡(jiǎn)單的設(shè)備即可完成反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)基于酶擴(kuò)增DNA的一種新特性,創(chuàng)建了跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(saltatory rolling circle amplification,SRCA)。SRCA無需人為環(huán)化模板,在等溫條件下僅需1 對(duì)引物便可完成對(duì)線性DNA的擴(kuò)增,是一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

    成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相關(guān)蛋白(CRISPR associated protein,Cas)組成了CRISPR/Cas系統(tǒng),是細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種獲得性免疫機(jī)制。最近的研究發(fā)現(xiàn),Cas12a可在CRISPR RNA(crRNA)引導(dǎo)下靶向結(jié)合雙鏈DNA,產(chǎn)生對(duì)單鏈DNA(single strand DNA,ssDNA)的非特異切割活性。由于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)特異性識(shí)別以及裂解DNA序列的能力,近年來被用于開發(fā)新型核酸檢測(cè)平臺(tái)。

    基于此,本研究將SRCA擴(kuò)增反應(yīng)與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)結(jié)合,建立一種檢測(cè)副溶血性弧菌的新方法。檢測(cè)原理如圖1所示,首先利用SRCA反應(yīng)進(jìn)行核酸擴(kuò)增,產(chǎn)生許多串聯(lián)重復(fù)的靶標(biāo)序列;然后利用設(shè)計(jì)的crRNA特異性識(shí)別擴(kuò)增靶標(biāo),從而使Cas12a產(chǎn)生對(duì)ssDNA的切割活性。利用此特性切割體系內(nèi)ssDNA報(bào)告探針,使得修飾在探針兩端的熒光基因和猝滅基團(tuán)遠(yuǎn)離發(fā)出熒光信號(hào),最后通過熒光信號(hào)變化判定結(jié)果,從而建立SRCACas12a檢測(cè)方法,并將該方法應(yīng)用到海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的定量檢測(cè)。

    圖1 SRCA-Cas12a檢測(cè)副溶血性弧菌原理圖Fig.1 Schematic illustration of the principle of SRCA-Cas12a for the detection of V.parahaemolyticus

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    副溶血性弧菌(CICC 21617、CICC 21528、ATCC 17802)、溶藻弧菌(CICC 21664)、創(chuàng)傷弧菌(CICC21615)、大腸埃希氏菌(CMCC 44103)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50115)、腸炎沙門氏菌(CMCC 50041)、單核細(xì)胞性李斯特菌(CMCC 54001)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)、福氏志賀菌(ATCC 12022)、宋內(nèi)氏志賀菌(CMCC 51334)、銅綠假單胞桿菌(CICC 21636)均由本實(shí)驗(yàn)室提供保藏;本研究所用序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(并通過聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行純化);細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA聚合酶、Cas12a蛋白 美國NEB有限公司;dNTPs、無酶無菌水 北京博邁德基因技術(shù)有限公司;所有溶液均采用無酶無菌水配制。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Nanodrop 2000分光光度計(jì) 美國Thermo Scientific有限公司;DXY-33A型電泳儀 北京六一儀器廠;JY04S-3E凝膠成像儀 北京君意電泳設(shè)備有限公司;F-320熒光分光光度計(jì) 天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及核酸提取

    副溶血性弧菌在3%氯化鈉堿性蛋白胨水中培養(yǎng),其他菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),過夜培養(yǎng)得到菌懸液,按照細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒說明書,取1 mL菌懸液提取DNA。

    1.3.2 引物設(shè)計(jì)

    選取副溶血性弧菌的基因?yàn)樘禺愋园谢?,通過BLAST同源性比對(duì)后,選取的副溶血性弧菌GenBank序列號(hào)為L(zhǎng)11929.1。利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件設(shè)計(jì)SRCA反應(yīng)的正向引物和反向引物,引物序列信息見表1。

    表1 序列信息Table 1 Sequence information of primers used in this study

    1.3.3 SRCA擴(kuò)增反應(yīng)

    SRCA預(yù)反應(yīng)體系為20.0 mmol/L Mg3.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL、10hThermoPol Reaction Buffer 2.0 μL、模板DNA 1.0 μL、10.0 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、DNA聚合酶(8 000 U/mL)1.0 μL,添加無酶無菌水將體系補(bǔ)足至20.0 μL,62 ℃反應(yīng)50 min。反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

    1.3.4 crRNA以及ssDNA報(bào)告分子的合成

    crRNA由直接重復(fù)序列和間隔序列組成,在CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中,形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的直接重復(fù)序列為UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU,間隔序列與檢測(cè)序列互補(bǔ)。在副溶血性弧菌檢測(cè)序列中找到一個(gè)用于激活Cas12a蛋白的富含T核苷酸的原間隔鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)(TTTN,N代表A、T、G或C),crRNA的間隔序列與PAM的下游序列(約21 bp)相同,其中T被U取代。ssDNA報(bào)告分子選用FAM和BHQ1探針分別修飾兩端。crRNA及ssDNA的序列信息見表1。

    1.3.5 CRISPR/Cas12a剪切反應(yīng)

    CRISPR/Cas12a檢測(cè)體系包括1.0 μmol/L Cas12a 1.0 μL、1hNEBuffer 5.0 μL、1.0 μmol/L crRNA 5.0 μL、1.5 μmol/L ssDNA報(bào)告分子5.0 μL、SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL,添加無酶無菌水將體系補(bǔ)足至50.0 μL,37 ℃反應(yīng)15 min,反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)樣品移至熒光比色皿中,熒光分光光度計(jì)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為492 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為510~700 nm,進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)。以有靶標(biāo)時(shí)的熒光強(qiáng)度與無靶標(biāo)時(shí)的熒光強(qiáng)度的比值表示。

    1.3.6 SRCA-Cas12a條件優(yōu)化

    為進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)性能,分別優(yōu)化ssDNA探針濃度、Cas12a/crRNA濃度比、Cas12a剪切反應(yīng)時(shí)間。ssDNA探針濃度設(shè)置6 個(gè)梯度,依次為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μmol/L。固定Cas12a濃度為1 μmol/L,Cas12a/crRNA濃度比設(shè)置8 個(gè)梯度,依次為2∶1、4∶3、1∶1、4∶5、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3。Cas12a剪切反應(yīng)時(shí)間依次設(shè)置為5、10、15、20、25、30 min。

    1.3.7 SRCA-Cas12a檢測(cè)靈敏度

    將培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋,同時(shí)取各稀釋度菌液1 mL提取基因組DNA,利用SRCACas12a方法對(duì)各稀釋度的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè),確定方法的靈敏度。

    1.3.8 SRCA-Cas12a特異性

    使用細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒提取3 株副溶血性弧菌以及10 株非副溶血性弧菌的DNA。采用SRCACas12a方法進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)以無酶無菌水作為空白對(duì)照,分析方法的特異性。

    1.3.9 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測(cè)

    將培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋,選擇適宜稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù),每個(gè)稀釋度3 個(gè)平行。分別取不含副溶血性弧菌的蝦肉樣品和牡蠣樣品5 g,接入不同稀釋度的副溶血性弧菌。將接種后的樣品加入45 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻,取1 mL均質(zhì)液提取DNA后使用SRCA-Cas12a方法進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3.10 實(shí)際樣品檢測(cè)

    從超市采集水產(chǎn)品36 份,樣品清單見表2。分別采用GB 4789.7ü2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》方法以及SRCA-Cas12a方法進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證SRCACas12a方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用能力。分別根據(jù)式(1)~(3)確定敏感性、特異性和符合率:

    表2 36 份實(shí)際樣品清單Table 2 List of 36 actual samples tested in this study

    分別取25 g實(shí)際樣品加入225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻,按照GB 4789.7ü2013方法經(jīng)增菌、選擇性分離、純培養(yǎng)及生化鑒定后判定結(jié)果。

    取1 mL上述增菌液提取基因組DNA,所提取的基因組DNA作為SRCA-Cas12a方法的檢測(cè)模板,根據(jù)熒光信號(hào)判定所構(gòu)建熒光傳感器的檢測(cè)結(jié)果。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 可行性驗(yàn)證

    根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理,可行性驗(yàn)證主要分為SRCA擴(kuò)增反應(yīng)和剪切反應(yīng)。

    SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物為靶標(biāo)序列和添加序列的串聯(lián)重復(fù)序列,所設(shè)計(jì)的SRCA目的序列長(zhǎng)度為80 bp,如圖2a所示,SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果與反應(yīng)原理一致。

    Cas12a剪切反應(yīng)的完整體系包括:Cas12a、crRNA、ssDNA報(bào)告分子以及靶標(biāo),只有當(dāng)體系完整時(shí)才能檢測(cè)到熒光信號(hào),因此設(shè)置各組分分別缺失的對(duì)照,即Cas12a+crRNA+靶標(biāo)、Cas12a+靶標(biāo)+ssDNA、Cas12a+crRNA+ssDNA、crRNA+靶標(biāo)+ssDNA以及完整體系Cas12a+crRNA+靶標(biāo)+ssDNA共5 組反應(yīng)體系進(jìn)行熒光檢測(cè)。如圖2b所示,只有在體系完整的情況下,才能形成Cas12a-crRNA-靶標(biāo)三元復(fù)合物,從而觀察到較強(qiáng)的熒光信號(hào)。因此,SRCA擴(kuò)增反應(yīng)和Cas12a剪切反應(yīng)的結(jié)果表明,所設(shè)計(jì)的SRCA-Cas12a方法可以用于副溶血性弧菌的檢測(cè)。

    圖2 可行性驗(yàn)證Fig.2 Feasibility verification

    2.2 條件優(yōu)化

    探針是觀察熒光強(qiáng)度的關(guān)鍵因素,因此,本研究對(duì)ssDNA探針濃度進(jìn)行優(yōu)化,從而保證探針的使用效率。如圖3a所示,當(dāng)ssDNA探針濃度從0.5 μmol/L增加到1.5 μmol/L時(shí),/變化明顯;當(dāng)ssDNA探針濃度從1.5 μmol/L增加到3.0 μmol/L時(shí),/變化緩慢。因此,本研究選取1.5 μmol/L為探針的最優(yōu)反應(yīng)濃度。

    反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響檢測(cè)速率的快慢。如圖3b所示,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5~15 min時(shí),/逐漸增加;當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15~30 min時(shí),反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期。綜上,本研究選取15 min為最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。

    在Cas12a剪切反應(yīng)中,Cas12a-crRNA二元復(fù)合物形成量決定了剪切反應(yīng)的速率。二元復(fù)合物形成量過少,影響剪切反應(yīng)效率,不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行;二元復(fù)合物形成量過多,增加實(shí)驗(yàn)成本,造成不必要的浪費(fèi)。如圖3c所示,當(dāng)Cas12a與crRNA濃度比為1∶1時(shí),/最大。綜合考慮,本研究中Cas12a/crRNA最優(yōu)濃度比為1∶1。

    圖3 反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction conditions

    2.3 線性范圍與檢出限結(jié)果

    通過平板計(jì)數(shù)得出副溶血性弧菌初始菌液濃度為1.7h10CFU/mL。使用SRCA-Cas12a對(duì)不同稀釋度的副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè),如圖4所示,熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著菌液濃度的降低而降低。當(dāng)副溶血性弧菌菌液濃度為1.7h10~1.7h10CFU/mL時(shí),菌液濃度的對(duì)數(shù)與熒光信號(hào)強(qiáng)度變化(/)存在線性關(guān)系,線性方程為=1.847 2+2.473 8(=0.986 6),線性關(guān)系良好,檢出限為3.6 CFU/mL(=3)。結(jié)果表明,SRCA-Cas12a可實(shí)現(xiàn)對(duì)副溶血性弧菌的定量檢測(cè)。

    圖4 SRCA-Cas12a方法的靈敏度Fig.4 Sensitivity of SRCA-Cas12a

    2.4 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    為驗(yàn)證SRCA-Cas12a檢測(cè)副溶血性弧菌的特異性,選取3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。如圖5所示,副溶血性弧菌產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于其他食源性致病菌產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明,所設(shè)計(jì)的crRNA可以特異性識(shí)別SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物,從而使Cas12a產(chǎn)生對(duì)ssDNA的非特異切割活性,ssDNA兩端的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)遠(yuǎn)離,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。相反,其他食源性致病菌不能激活Cas12a的切割活性,熒光猝滅不會(huì)恢復(fù)。因此,SRCA-Cas12a該方法具有良好的特異性。

    圖5 SRCA-Cas12a方法的特異性Fig.5 Specificity of SRCA-Cas12a

    2.5 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測(cè)

    為驗(yàn)證SRCA-Cas12a方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性,測(cè)定蝦肉和牡蠣空白樣品的加標(biāo)回收率。由表3可知,人工污染樣品的加標(biāo)回收率在95.5%~104.4%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%~5.2%,表明該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

    表3 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測(cè)(n=5)Table 3 Results of determination of V.parahaemolyticus in artificially contaminated samples (n = 5)

    2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

    使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對(duì)采集的36 份海產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),并比較這2 種方法,檢測(cè)結(jié)果如表4所示。GB 4789.7ü2013方法陽性樣品檢出數(shù)為15 個(gè),陰性樣品檢出數(shù)為21 個(gè);SRCA-Cas12a方法陽性樣品檢出數(shù)為16 個(gè),陰性樣品檢出數(shù)為20 個(gè)。以GB 4789.7ü2013方法檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率達(dá)到97.2%。因此,SRCA-Cas12a方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中有一定的應(yīng)用能力。

    表4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of detection of actual samples by SRCA-Cas12a and conventional culture method

    3 討 論

    將SRCA擴(kuò)增反應(yīng)與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)相結(jié)合,建立了一種檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的新方法。SRCA作為一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),可對(duì)靶標(biāo)序列快速擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大,同時(shí)也可作為對(duì)靶標(biāo)序列的第1重識(shí)別。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中crRNA通過PAM序列與SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物中大量重復(fù)的靶標(biāo)序列結(jié)合,從而對(duì)靶標(biāo)序列二次識(shí)別,激活Cas12a的非特異切割活性。研究表明Cas12a的切割速率達(dá)到250 次/s。因此,將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)與SRCA結(jié)合提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。該方法對(duì)副溶血性弧菌的線性檢測(cè)范圍為1.7h10~1.7h10CFU/mL,檢出限為3.6 CFU/mL。對(duì)3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,該方法具有良好的特異性。利用SRCA-Cas12a方法進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),樣品的加標(biāo)回收率在95.5%~104.4%之間。使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對(duì)采集的36 份海產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果可得SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率為97.2%。此外,由于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程性,該檢測(cè)方法可針對(duì)不同靶標(biāo)分子設(shè)計(jì)引物和crRNA,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其他食源性致病菌的檢測(cè)。并且該方法在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)可以選擇小型的熒光觀察裝置,通過肉眼觀察結(jié)果。同時(shí),在今后研究中探索基于SRCA-Cas12a方法的多重核酸檢測(cè)方法,有望使CRISPR/Cas系統(tǒng)在多重核酸檢測(cè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。

    綜上所述,SRCA-Cas12a方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),為副溶血性弧菌的快速定量檢測(cè)提供了一種新策略,也為其他食源性致病菌的檢測(cè)提供新思路,對(duì)保障食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和參考價(jià)值。

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