跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合CRISPR/Cas12a定量檢測(cè)海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌

董換哲，苑 寧，張?zhí)N哲，楊 倩,3,*，盧 鑫，郭 威，張 偉,4,5,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北 滄州 061100；3.河北大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 保定 071002；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；5.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001）

副溶血性弧菌（）是一種廣泛存在于各種海產(chǎn)品中的食源性致病菌。在我國沿海地區(qū)，副溶血性弧菌是發(fā)生細(xì)菌性食源性疾病的主要致病菌。食用受副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海產(chǎn)品，可能會(huì)引起人類患胃腸道疾病，其臨床癥狀包括腹瀉、腹部痙攣、嘔吐、發(fā)燒或發(fā)冷。此外，副溶血性弧菌也可通過開放性傷口傳播，甚至可導(dǎo)致敗血癥，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。根據(jù)GB 29921ü2013《食品中致病菌限量》規(guī)定，海產(chǎn)品中副溶血性弧菌含量應(yīng)低于10CFU/g，從而降低由副溶血性弧菌引起的感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，為有效監(jiān)測(cè)食品安全問題，開發(fā)快速且靈敏的副溶血性弧菌定量檢測(cè)方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法、核酸擴(kuò)增技術(shù)等是目前國內(nèi)外檢測(cè)副溶血性弧菌的主要方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)準(zhǔn)確、可靠，但至少需要3～5 d才能獲得最終結(jié)果，且靈敏度低，在快速檢測(cè)中應(yīng)用受限；免疫學(xué)檢測(cè)方法易受食品基質(zhì)影響，從而導(dǎo)致該方法靈敏度較低、特異性較差；核酸擴(kuò)增技術(shù)中的核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在同一溫度下對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行快速擴(kuò)增，對(duì)儀器要求較低，通過金屬浴、水浴鍋等簡(jiǎn)單的設(shè)備即可完成反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)基于酶擴(kuò)增DNA的一種新特性，創(chuàng)建了跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（saltatory rolling circle amplification，SRCA）。SRCA無需人為環(huán)化模板，在等溫條件下僅需1 對(duì)引物便可完成對(duì)線性DNA的擴(kuò)增，是一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPR associated protein，Cas）組成了CRISPR/Cas系統(tǒng)，是細(xì)菌和古細(xì)菌中的一種獲得性免疫機(jī)制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Cas12a可在CRISPR RNA（crRNA）引導(dǎo)下靶向結(jié)合雙鏈DNA，產(chǎn)生對(duì)單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）的非特異切割活性。由于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)特異性識(shí)別以及裂解DNA序列的能力，近年來被用于開發(fā)新型核酸檢測(cè)平臺(tái)。

基于此，本研究將SRCA擴(kuò)增反應(yīng)與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)結(jié)合，建立一種檢測(cè)副溶血性弧菌的新方法。檢測(cè)原理如圖1所示，首先利用SRCA反應(yīng)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，產(chǎn)生許多串聯(lián)重復(fù)的靶標(biāo)序列；然后利用設(shè)計(jì)的crRNA特異性識(shí)別擴(kuò)增靶標(biāo)，從而使Cas12a產(chǎn)生對(duì)ssDNA的切割活性。利用此特性切割體系內(nèi)ssDNA報(bào)告探針，使得修飾在探針兩端的熒光基因和猝滅基團(tuán)遠(yuǎn)離發(fā)出熒光信號(hào)，最后通過熒光信號(hào)變化判定結(jié)果，從而建立SRCACas12a檢測(cè)方法，并將該方法應(yīng)用到海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的定量檢測(cè)。

圖1 SRCA-Cas12a檢測(cè)副溶血性弧菌原理圖Fig.1 Schematic illustration of the principle of SRCA-Cas12a for the detection of V.parahaemolyticus

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血性弧菌（CICC 21617、CICC 21528、ATCC 17802）、溶藻弧菌（CICC 21664）、創(chuàng)傷弧菌（CICC21615）、大腸埃希氏菌（CMCC 44103）、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50115）、腸炎沙門氏菌（CMCC 50041）、單核細(xì)胞性李斯特菌（CMCC 54001）、金黃色葡萄球菌（CMCC 26003）、福氏志賀菌（ATCC 12022）、宋內(nèi)氏志賀菌（CMCC 51334）、銅綠假單胞桿菌（CICC 21636）均由本實(shí)驗(yàn)室提供保藏；本研究所用序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（并通過聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行純化）；細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA聚合酶、Cas12a蛋白 美國NEB有限公司；dNTPs、無酶無菌水 北京博邁德基因技術(shù)有限公司；所有溶液均采用無酶無菌水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Nanodrop 2000分光光度計(jì) 美國Thermo Scientific有限公司；DXY-33A型電泳儀 北京六一儀器廠；JY04S-3E凝膠成像儀 北京君意電泳設(shè)備有限公司；F-320熒光分光光度計(jì) 天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及核酸提取

副溶血性弧菌在3%氯化鈉堿性蛋白胨水中培養(yǎng)，其他菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)得到菌懸液，按照細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒說明書，取1 mL菌懸液提取DNA。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

選取副溶血性弧菌的基因?yàn)樘禺愋园谢?，通過BLAST同源性比對(duì)后，選取的副溶血性弧菌GenBank序列號(hào)為L(zhǎng)11929.1。利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件設(shè)計(jì)SRCA反應(yīng)的正向引物和反向引物，引物序列信息見表1。

表1 序列信息Table 1 Sequence information of primers used in this study

1.3.3 SRCA擴(kuò)增反應(yīng)

SRCA預(yù)反應(yīng)體系為20.0 mmol/L Mg3.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL、10hThermoPol Reaction Buffer 2.0 μL、模板DNA 1.0 μL、10.0 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、DNA聚合酶（8 000 U/mL）1.0 μL，添加無酶無菌水將體系補(bǔ)足至20.0 μL，62 ℃反應(yīng)50 min。反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.3.4 crRNA以及ssDNA報(bào)告分子的合成

crRNA由直接重復(fù)序列和間隔序列組成，在CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的直接重復(fù)序列為UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU，間隔序列與檢測(cè)序列互補(bǔ)。在副溶血性弧菌檢測(cè)序列中找到一個(gè)用于激活Cas12a蛋白的富含T核苷酸的原間隔鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）（TTTN，N代表A、T、G或C），crRNA的間隔序列與PAM的下游序列（約21 bp）相同，其中T被U取代。ssDNA報(bào)告分子選用FAM和BHQ1探針分別修飾兩端。crRNA及ssDNA的序列信息見表1。

1.3.5 CRISPR/Cas12a剪切反應(yīng)

CRISPR/Cas12a檢測(cè)體系包括1.0 μmol/L Cas12a 1.0 μL、1hNEBuffer 5.0 μL、1.0 μmol/L crRNA 5.0 μL、1.5 μmol/L ssDNA報(bào)告分子5.0 μL、SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，添加無酶無菌水將體系補(bǔ)足至50.0 μL，37 ℃反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)樣品移至熒光比色皿中，熒光分光光度計(jì)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為492 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510～700 nm，進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)。以有靶標(biāo)時(shí)的熒光強(qiáng)度與無靶標(biāo)時(shí)的熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.3.6 SRCA-Cas12a條件優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)性能，分別優(yōu)化ssDNA探針濃度、Cas12a/crRNA濃度比、Cas12a剪切反應(yīng)時(shí)間。ssDNA探針濃度設(shè)置6 個(gè)梯度，依次為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μmol/L。固定Cas12a濃度為1 μmol/L，Cas12a/crRNA濃度比設(shè)置8 個(gè)梯度，依次為2∶1、4∶3、1∶1、4∶5、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3。Cas12a剪切反應(yīng)時(shí)間依次設(shè)置為5、10、15、20、25、30 min。

1.3.7 SRCA-Cas12a檢測(cè)靈敏度

將培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，同時(shí)取各稀釋度菌液1 mL提取基因組DNA，利用SRCACas12a方法對(duì)各稀釋度的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，確定方法的靈敏度。

1.3.8 SRCA-Cas12a特異性

使用細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒提取3 株副溶血性弧菌以及10 株非副溶血性弧菌的DNA。采用SRCACas12a方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以無酶無菌水作為空白對(duì)照，分析方法的特異性。

1.3.9 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測(cè)

將培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，選擇適宜稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度3 個(gè)平行。分別取不含副溶血性弧菌的蝦肉樣品和牡蠣樣品5 g，接入不同稀釋度的副溶血性弧菌。將接種后的樣品加入45 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻，取1 mL均質(zhì)液提取DNA后使用SRCA-Cas12a方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.10 實(shí)際樣品檢測(cè)

從超市采集水產(chǎn)品36 份，樣品清單見表2。分別采用GB 4789.7ü2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》方法以及SRCA-Cas12a方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證SRCACas12a方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用能力。分別根據(jù)式（1）～（3）確定敏感性、特異性和符合率：

表2 36 份實(shí)際樣品清單Table 2 List of 36 actual samples tested in this study

分別取25 g實(shí)際樣品加入225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻，按照GB 4789.7ü2013方法經(jīng)增菌、選擇性分離、純培養(yǎng)及生化鑒定后判定結(jié)果。

取1 mL上述增菌液提取基因組DNA，所提取的基因組DNA作為SRCA-Cas12a方法的檢測(cè)模板，根據(jù)熒光信號(hào)判定所構(gòu)建熒光傳感器的檢測(cè)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 可行性驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，可行性驗(yàn)證主要分為SRCA擴(kuò)增反應(yīng)和剪切反應(yīng)。

SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物為靶標(biāo)序列和添加序列的串聯(lián)重復(fù)序列，所設(shè)計(jì)的SRCA目的序列長(zhǎng)度為80 bp，如圖2a所示，SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果與反應(yīng)原理一致。

Cas12a剪切反應(yīng)的完整體系包括：Cas12a、crRNA、ssDNA報(bào)告分子以及靶標(biāo)，只有當(dāng)體系完整時(shí)才能檢測(cè)到熒光信號(hào)，因此設(shè)置各組分分別缺失的對(duì)照，即Cas12a＋crRNA＋靶標(biāo)、Cas12a＋靶標(biāo)＋ssDNA、Cas12a＋crRNA＋ssDNA、crRNA＋靶標(biāo)＋ssDNA以及完整體系Cas12a＋crRNA＋靶標(biāo)+ssDNA共5 組反應(yīng)體系進(jìn)行熒光檢測(cè)。如圖2b所示，只有在體系完整的情況下，才能形成Cas12a-crRNA-靶標(biāo)三元復(fù)合物，從而觀察到較強(qiáng)的熒光信號(hào)。因此，SRCA擴(kuò)增反應(yīng)和Cas12a剪切反應(yīng)的結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的SRCA-Cas12a方法可以用于副溶血性弧菌的檢測(cè)。

圖2 可行性驗(yàn)證Fig.2 Feasibility verification

2.2 條件優(yōu)化

探針是觀察熒光強(qiáng)度的關(guān)鍵因素，因此，本研究對(duì)ssDNA探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，從而保證探針的使用效率。如圖3a所示，當(dāng)ssDNA探針濃度從0.5 μmol/L增加到1.5 μmol/L時(shí)，/變化明顯；當(dāng)ssDNA探針濃度從1.5 μmol/L增加到3.0 μmol/L時(shí)，/變化緩慢。因此，本研究選取1.5 μmol/L為探針的最優(yōu)反應(yīng)濃度。

反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響檢測(cè)速率的快慢。如圖3b所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5～15 min時(shí)，/逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為15～30 min時(shí)，反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期。綜上，本研究選取15 min為最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。

在Cas12a剪切反應(yīng)中，Cas12a-crRNA二元復(fù)合物形成量決定了剪切反應(yīng)的速率。二元復(fù)合物形成量過少，影響剪切反應(yīng)效率，不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行；二元復(fù)合物形成量過多，增加實(shí)驗(yàn)成本，造成不必要的浪費(fèi)。如圖3c所示，當(dāng)Cas12a與crRNA濃度比為1∶1時(shí)，/最大。綜合考慮，本研究中Cas12a/crRNA最優(yōu)濃度比為1∶1。

圖3 反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction conditions

2.3 線性范圍與檢出限結(jié)果

通過平板計(jì)數(shù)得出副溶血性弧菌初始菌液濃度為1.7h10CFU/mL。使用SRCA-Cas12a對(duì)不同稀釋度的副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)，如圖4所示，熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著菌液濃度的降低而降低。當(dāng)副溶血性弧菌菌液濃度為1.7h10～1.7h10CFU/mL時(shí)，菌液濃度的對(duì)數(shù)與熒光信號(hào)強(qiáng)度變化（/）存在線性關(guān)系，線性方程為=1.847 2＋2.473 8（=0.986 6），線性關(guān)系良好，檢出限為3.6 CFU/mL（=3）。結(jié)果表明，SRCA-Cas12a可實(shí)現(xiàn)對(duì)副溶血性弧菌的定量檢測(cè)。

圖4 SRCA-Cas12a方法的靈敏度Fig.4 Sensitivity of SRCA-Cas12a

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證SRCA-Cas12a檢測(cè)副溶血性弧菌的特異性，選取3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，副溶血性弧菌產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于其他食源性致病菌產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的crRNA可以特異性識(shí)別SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物，從而使Cas12a產(chǎn)生對(duì)ssDNA的非特異切割活性，ssDNA兩端的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。相反，其他食源性致病菌不能激活Cas12a的切割活性，熒光猝滅不會(huì)恢復(fù)。因此，SRCA-Cas12a該方法具有良好的特異性。

圖5 SRCA-Cas12a方法的特異性Fig.5 Specificity of SRCA-Cas12a

2.5 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測(cè)

為驗(yàn)證SRCA-Cas12a方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性，測(cè)定蝦肉和牡蠣空白樣品的加標(biāo)回收率。由表3可知，人工污染樣品的加標(biāo)回收率在95.5%～104.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～5.2%，表明該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測(cè)（n=5）Table 3 Results of determination of V.parahaemolyticus in artificially contaminated samples (n = 5)

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對(duì)采集的36 份海產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，并比較這2 種方法，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。GB 4789.7ü2013方法陽性樣品檢出數(shù)為15 個(gè)，陰性樣品檢出數(shù)為21 個(gè)；SRCA-Cas12a方法陽性樣品檢出數(shù)為16 個(gè)，陰性樣品檢出數(shù)為20 個(gè)。以GB 4789.7ü2013方法檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率達(dá)到97.2%。因此，SRCA-Cas12a方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中有一定的應(yīng)用能力。

表4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of detection of actual samples by SRCA-Cas12a and conventional culture method

3 討 論

將SRCA擴(kuò)增反應(yīng)與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)相結(jié)合，建立了一種檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的新方法。SRCA作為一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可對(duì)靶標(biāo)序列快速擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，同時(shí)也可作為對(duì)靶標(biāo)序列的第1重識(shí)別。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中crRNA通過PAM序列與SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物中大量重復(fù)的靶標(biāo)序列結(jié)合，從而對(duì)靶標(biāo)序列二次識(shí)別，激活Cas12a的非特異切割活性。研究表明Cas12a的切割速率達(dá)到250 次/s。因此，將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)與SRCA結(jié)合提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。該方法對(duì)副溶血性弧菌的線性檢測(cè)范圍為1.7h10～1.7h10CFU/mL，檢出限為3.6 CFU/mL。對(duì)3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性。利用SRCA-Cas12a方法進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，樣品的加標(biāo)回收率在95.5%～104.4%之間。使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對(duì)采集的36 份海產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果可得SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率為97.2%。此外，由于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程性，該檢測(cè)方法可針對(duì)不同靶標(biāo)分子設(shè)計(jì)引物和crRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其他食源性致病菌的檢測(cè)。并且該方法在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)時(shí)可以選擇小型的熒光觀察裝置，通過肉眼觀察結(jié)果。同時(shí)，在今后研究中探索基于SRCA-Cas12a方法的多重核酸檢測(cè)方法，有望使CRISPR/Cas系統(tǒng)在多重核酸檢測(cè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。

綜上所述，SRCA-Cas12a方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，為副溶血性弧菌的快速定量檢測(cè)提供了一種新策略，也為其他食源性致病菌的檢測(cè)提供新思路，對(duì)保障食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和參考價(jià)值。