跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)結(jié)合CRISPR/Cas12a定量檢測海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌

董換哲，苑 寧，張?zhí)N哲，楊 倩,3,*，盧 鑫，郭 威，張 偉,4,5,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學理工學院，河北 滄州 061100；3.河北大學公共衛(wèi)生學院，河北 保定 071002；4.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北 保定 071001；5.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點實驗室，河北 保定 071001）

副溶血性弧菌（）是一種廣泛存在于各種海產(chǎn)品中的食源性致病菌。在我國沿海地區(qū)，副溶血性弧菌是發(fā)生細菌性食源性疾病的主要致病菌。食用受副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海產(chǎn)品，可能會引起人類患胃腸道疾病，其臨床癥狀包括腹瀉、腹部痙攣、嘔吐、發(fā)燒或發(fā)冷。此外，副溶血性弧菌也可通過開放性傷口傳播，甚至可導致敗血癥，嚴重時可危及生命。根據(jù)GB 29921ü2013《食品中致病菌限量》規(guī)定，海產(chǎn)品中副溶血性弧菌含量應低于10CFU/g，從而降低由副溶血性弧菌引起的感染風險。因此，為有效監(jiān)測食品安全問題，開發(fā)快速且靈敏的副溶血性弧菌定量檢測方法具有重要現(xiàn)實意義。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學方法、核酸擴增技術(shù)等是目前國內(nèi)外檢測副溶血性弧菌的主要方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對副溶血性弧菌的檢測準確、可靠，但至少需要3～5 d才能獲得最終結(jié)果，且靈敏度低，在快速檢測中應用受限；免疫學檢測方法易受食品基質(zhì)影響，從而導致該方法靈敏度較低、特異性較差；核酸擴增技術(shù)中的核酸等溫擴增反應在同一溫度下對靶標進行快速擴增，對儀器要求較低，通過金屬浴、水浴鍋等簡單的設備即可完成反應。本實驗室研究團隊基于酶擴增DNA的一種新特性，創(chuàng)建了跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)（saltatory rolling circle amplification，SRCA）。SRCA無需人為環(huán)化模板，在等溫條件下僅需1 對引物便可完成對線性DNA的擴增，是一種新型核酸等溫擴增技術(shù)。

成簇規(guī)律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPR associated protein，Cas）組成了CRISPR/Cas系統(tǒng)，是細菌和古細菌中的一種獲得性免疫機制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Cas12a可在CRISPR RNA（crRNA）引導下靶向結(jié)合雙鏈DNA，產(chǎn)生對單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）的非特異切割活性。由于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)特異性識別以及裂解DNA序列的能力，近年來被用于開發(fā)新型核酸檢測平臺。

基于此，本研究將SRCA擴增反應與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)結(jié)合，建立一種檢測副溶血性弧菌的新方法。檢測原理如圖1所示，首先利用SRCA反應進行核酸擴增，產(chǎn)生許多串聯(lián)重復的靶標序列；然后利用設計的crRNA特異性識別擴增靶標，從而使Cas12a產(chǎn)生對ssDNA的切割活性。利用此特性切割體系內(nèi)ssDNA報告探針，使得修飾在探針兩端的熒光基因和猝滅基團遠離發(fā)出熒光信號，最后通過熒光信號變化判定結(jié)果，從而建立SRCACas12a檢測方法，并將該方法應用到海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的定量檢測。

圖1 SRCA-Cas12a檢測副溶血性弧菌原理圖Fig.1 Schematic illustration of the principle of SRCA-Cas12a for the detection of V.parahaemolyticus

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副溶血性弧菌（CICC 21617、CICC 21528、ATCC 17802）、溶藻弧菌（CICC 21664）、創(chuàng)傷弧菌（CICC21615）、大腸埃希氏菌（CMCC 44103）、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50115）、腸炎沙門氏菌（CMCC 50041）、單核細胞性李斯特菌（CMCC 54001）、金黃色葡萄球菌（CMCC 26003）、福氏志賀菌（ATCC 12022）、宋內(nèi)氏志賀菌（CMCC 51334）、銅綠假單胞桿菌（CICC 21636）均由本實驗室提供保藏；本研究所用序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（并通過聚丙烯酰氨凝膠電泳進行純化）；細菌全基因組DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA聚合酶、Cas12a蛋白 美國NEB有限公司；dNTPs、無酶無菌水 北京博邁德基因技術(shù)有限公司；所有溶液均采用無酶無菌水配制。

1.2 儀器與設備

DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司；Nanodrop 2000分光光度計 美國Thermo Scientific有限公司；DXY-33A型電泳儀 北京六一儀器廠；JY04S-3E凝膠成像儀 北京君意電泳設備有限公司；F-320熒光分光光度計 天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌培養(yǎng)及核酸提取

副溶血性弧菌在3%氯化鈉堿性蛋白胨水中培養(yǎng)，其他菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)得到菌懸液，按照細菌全基因組DNA提取試劑盒說明書，取1 mL菌懸液提取DNA。

1.3.2 引物設計

選取副溶血性弧菌的基因為特異性靶基因，通過BLAST同源性比對后，選取的副溶血性弧菌GenBank序列號為L11929.1。利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件設計SRCA反應的正向引物和反向引物，引物序列信息見表1。

表1 序列信息Table 1 Sequence information of primers used in this study

1.3.3 SRCA擴增反應

SRCA預反應體系為20.0 mmol/L Mg3.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL、10hThermoPol Reaction Buffer 2.0 μL、模板DNA 1.0 μL、10.0 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、DNA聚合酶（8 000 U/mL）1.0 μL，添加無酶無菌水將體系補足至20.0 μL，62 ℃反應50 min。反應產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.3.4 crRNA以及ssDNA報告分子的合成

crRNA由直接重復序列和間隔序列組成，在CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的直接重復序列為UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU，間隔序列與檢測序列互補。在副溶血性弧菌檢測序列中找到一個用于激活Cas12a蛋白的富含T核苷酸的原間隔鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）（TTTN，N代表A、T、G或C），crRNA的間隔序列與PAM的下游序列（約21 bp）相同，其中T被U取代。ssDNA報告分子選用FAM和BHQ1探針分別修飾兩端。crRNA及ssDNA的序列信息見表1。

1.3.5 CRISPR/Cas12a剪切反應

CRISPR/Cas12a檢測體系包括1.0 μmol/L Cas12a 1.0 μL、1hNEBuffer 5.0 μL、1.0 μmol/L crRNA 5.0 μL、1.5 μmol/L ssDNA報告分子5.0 μL、SRCA擴增產(chǎn)物5 μL，添加無酶無菌水將體系補足至50.0 μL，37 ℃反應15 min，反應結(jié)束后取出反應樣品移至熒光比色皿中，熒光分光光度計設置激發(fā)波長為492 nm，發(fā)射波長為510～700 nm，進行熒光光譜檢測。以有靶標時的熒光強度與無靶標時的熒光強度的比值表示。

1.3.6 SRCA-Cas12a條件優(yōu)化

為進一步優(yōu)化檢測性能，分別優(yōu)化ssDNA探針濃度、Cas12a/crRNA濃度比、Cas12a剪切反應時間。ssDNA探針濃度設置6 個梯度，依次為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μmol/L。固定Cas12a濃度為1 μmol/L，Cas12a/crRNA濃度比設置8 個梯度，依次為2∶1、4∶3、1∶1、4∶5、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3。Cas12a剪切反應時間依次設置為5、10、15、20、25、30 min。

1.3.7 SRCA-Cas12a檢測靈敏度

將培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液進行10 倍梯度稀釋，同時取各稀釋度菌液1 mL提取基因組DNA，利用SRCACas12a方法對各稀釋度的基因組DNA進行檢測，確定方法的靈敏度。

1.3.8 SRCA-Cas12a特異性

使用細菌全基因組DNA提取試劑盒提取3 株副溶血性弧菌以及10 株非副溶血性弧菌的DNA。采用SRCACas12a方法進行檢測，同時以無酶無菌水作為空白對照，分析方法的特異性。

1.3.9 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測

將培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液進行10 倍梯度稀釋，選擇適宜稀釋度進行平板計數(shù)，每個稀釋度3 個平行。分別取不含副溶血性弧菌的蝦肉樣品和牡蠣樣品5 g，接入不同稀釋度的副溶血性弧菌。將接種后的樣品加入45 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻，取1 mL均質(zhì)液提取DNA后使用SRCA-Cas12a方法進行檢測。

1.3.10 實際樣品檢測

從超市采集水產(chǎn)品36 份，樣品清單見表2。分別采用GB 4789.7ü2013《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》方法以及SRCA-Cas12a方法進行檢測，驗證SRCACas12a方法在實際樣品檢測中的應用能力。分別根據(jù)式（1）～（3）確定敏感性、特異性和符合率：

表2 36 份實際樣品清單Table 2 List of 36 actual samples tested in this study

分別取25 g實際樣品加入225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻，按照GB 4789.7ü2013方法經(jīng)增菌、選擇性分離、純培養(yǎng)及生化鑒定后判定結(jié)果。

取1 mL上述增菌液提取基因組DNA，所提取的基因組DNA作為SRCA-Cas12a方法的檢測模板，根據(jù)熒光信號判定所構(gòu)建熒光傳感器的檢測結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 可行性驗證

根據(jù)實驗原理，可行性驗證主要分為SRCA擴增反應和剪切反應。

SRCA擴增產(chǎn)物為靶標序列和添加序列的串聯(lián)重復序列，所設計的SRCA目的序列長度為80 bp，如圖2a所示，SRCA擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果與反應原理一致。

Cas12a剪切反應的完整體系包括：Cas12a、crRNA、ssDNA報告分子以及靶標，只有當體系完整時才能檢測到熒光信號，因此設置各組分分別缺失的對照，即Cas12a＋crRNA＋靶標、Cas12a＋靶標＋ssDNA、Cas12a＋crRNA＋ssDNA、crRNA＋靶標＋ssDNA以及完整體系Cas12a＋crRNA＋靶標+ssDNA共5 組反應體系進行熒光檢測。如圖2b所示，只有在體系完整的情況下，才能形成Cas12a-crRNA-靶標三元復合物，從而觀察到較強的熒光信號。因此，SRCA擴增反應和Cas12a剪切反應的結(jié)果表明，所設計的SRCA-Cas12a方法可以用于副溶血性弧菌的檢測。

圖2 可行性驗證Fig.2 Feasibility verification

2.2 條件優(yōu)化

探針是觀察熒光強度的關(guān)鍵因素，因此，本研究對ssDNA探針濃度進行優(yōu)化，從而保證探針的使用效率。如圖3a所示，當ssDNA探針濃度從0.5 μmol/L增加到1.5 μmol/L時，/變化明顯；當ssDNA探針濃度從1.5 μmol/L增加到3.0 μmol/L時，/變化緩慢。因此，本研究選取1.5 μmol/L為探針的最優(yōu)反應濃度。

反應時間的長短會影響檢測速率的快慢。如圖3b所示，當反應時間為5～15 min時，/逐漸增加；當反應時間為15～30 min時，反應進入平臺期。綜上，本研究選取15 min為最優(yōu)反應時間。

在Cas12a剪切反應中，Cas12a-crRNA二元復合物形成量決定了剪切反應的速率。二元復合物形成量過少，影響剪切反應效率，不利于實驗進行；二元復合物形成量過多，增加實驗成本，造成不必要的浪費。如圖3c所示，當Cas12a與crRNA濃度比為1∶1時，/最大。綜合考慮，本研究中Cas12a/crRNA最優(yōu)濃度比為1∶1。

圖3 反應條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction conditions

2.3 線性范圍與檢出限結(jié)果

通過平板計數(shù)得出副溶血性弧菌初始菌液濃度為1.7h10CFU/mL。使用SRCA-Cas12a對不同稀釋度的副溶血性弧菌進行檢測，如圖4所示，熒光信號強度隨著菌液濃度的降低而降低。當副溶血性弧菌菌液濃度為1.7h10～1.7h10CFU/mL時，菌液濃度的對數(shù)與熒光信號強度變化（/）存在線性關(guān)系，線性方程為=1.847 2＋2.473 8（=0.986 6），線性關(guān)系良好，檢出限為3.6 CFU/mL（=3）。結(jié)果表明，SRCA-Cas12a可實現(xiàn)對副溶血性弧菌的定量檢測。

圖4 SRCA-Cas12a方法的靈敏度Fig.4 Sensitivity of SRCA-Cas12a

2.4 特異性實驗結(jié)果

為驗證SRCA-Cas12a檢測副溶血性弧菌的特異性，選取3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進行特異性實驗。如圖5所示，副溶血性弧菌產(chǎn)生的熒光信號強度明顯高于其他食源性致病菌產(chǎn)生的熒光強度。結(jié)果表明，所設計的crRNA可以特異性識別SRCA擴增產(chǎn)物，從而使Cas12a產(chǎn)生對ssDNA的非特異切割活性，ssDNA兩端的熒光基團和猝滅基團遠離，熒光強度增強。相反，其他食源性致病菌不能激活Cas12a的切割活性，熒光猝滅不會恢復。因此，SRCA-Cas12a該方法具有良好的特異性。

圖5 SRCA-Cas12a方法的特異性Fig.5 Specificity of SRCA-Cas12a

2.5 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測

為驗證SRCA-Cas12a方法檢測的準確性，測定蝦肉和牡蠣空白樣品的加標回收率。由表3可知，人工污染樣品的加標回收率在95.5%～104.4%之間，相對標準偏差為1.7%～5.2%，表明該方法檢測結(jié)果準確可靠。

表3 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測（n=5）Table 3 Results of determination of V.parahaemolyticus in artificially contaminated samples (n = 5)

2.6 實際樣品檢測結(jié)果

使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對采集的36 份海產(chǎn)品進行檢測，并比較這2 種方法，檢測結(jié)果如表4所示。GB 4789.7ü2013方法陽性樣品檢出數(shù)為15 個，陰性樣品檢出數(shù)為21 個；SRCA-Cas12a方法陽性樣品檢出數(shù)為16 個，陰性樣品檢出數(shù)為20 個。以GB 4789.7ü2013方法檢測結(jié)果為標準，SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率達到97.2%。因此，SRCA-Cas12a方法在實際樣品檢測中有一定的應用能力。

表4 實際樣品檢測結(jié)果Table 4 Results of detection of actual samples by SRCA-Cas12a and conventional culture method

3 討 論

將SRCA擴增反應與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)相結(jié)合，建立了一種檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的新方法。SRCA作為一種新型核酸等溫擴增技術(shù)，可對靶標序列快速擴增實現(xiàn)信號放大，同時也可作為對靶標序列的第1重識別。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中crRNA通過PAM序列與SRCA擴增產(chǎn)物中大量重復的靶標序列結(jié)合，從而對靶標序列二次識別，激活Cas12a的非特異切割活性。研究表明Cas12a的切割速率達到250 次/s。因此，將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)與SRCA結(jié)合提高了檢測的靈敏度和特異性。該方法對副溶血性弧菌的線性檢測范圍為1.7h10～1.7h10CFU/mL，檢出限為3.6 CFU/mL。對3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進行特異性實驗的結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性。利用SRCA-Cas12a方法進行加標回收率實驗，樣品的加標回收率在95.5%～104.4%之間。使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對采集的36 份海產(chǎn)品進行檢測，結(jié)果可得SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率為97.2%。此外，由于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程性，該檢測方法可針對不同靶標分子設計引物和crRNA，從而實現(xiàn)對其他食源性致病菌的檢測。并且該方法在現(xiàn)場檢測時可以選擇小型的熒光觀察裝置，通過肉眼觀察結(jié)果。同時，在今后研究中探索基于SRCA-Cas12a方法的多重核酸檢測方法，有望使CRISPR/Cas系統(tǒng)在多重核酸檢測領(lǐng)域得到應用。

綜上所述，SRCA-Cas12a方法具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，為副溶血性弧菌的快速定量檢測提供了一種新策略，也為其他食源性致病菌的檢測提供新思路，對保障食品安全具有重要的現(xiàn)實意義和參考價值。