董換哲,苑 寧,張?zhí)N哲,楊 倩,3,*,盧 鑫,郭 威,張 偉,4,5,*
(1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,河北 保定 071001;2.河北農(nóng)業(yè)大學理工學院,河北 滄州 061100;3.河北大學公共衛(wèi)生學院,河北 保定 071002;4.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,河北 保定 071001;5.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點實驗室,河北 保定 071001)
副溶血性弧菌()是一種廣泛存在于各種海產(chǎn)品中的食源性致病菌。在我國沿海地區(qū),副溶血性弧菌是發(fā)生細菌性食源性疾病的主要致病菌。食用受副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海產(chǎn)品,可能會引起人類患胃腸道疾病,其臨床癥狀包括腹瀉、腹部痙攣、嘔吐、發(fā)燒或發(fā)冷。此外,副溶血性弧菌也可通過開放性傷口傳播,甚至可導致敗血癥,嚴重時可危及生命。根據(jù)GB 29921ü2013《食品中致病菌限量》規(guī)定,海產(chǎn)品中副溶血性弧菌含量應低于10CFU/g,從而降低由副溶血性弧菌引起的感染風險。因此,為有效監(jiān)測食品安全問題,開發(fā)快速且靈敏的副溶血性弧菌定量檢測方法具有重要現(xiàn)實意義。
傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學方法、核酸擴增技術(shù)等是目前國內(nèi)外檢測副溶血性弧菌的主要方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對副溶血性弧菌的檢測準確、可靠,但至少需要3~5 d才能獲得最終結(jié)果,且靈敏度低,在快速檢測中應用受限;免疫學檢測方法易受食品基質(zhì)影響,從而導致該方法靈敏度較低、特異性較差;核酸擴增技術(shù)中的核酸等溫擴增反應在同一溫度下對靶標進行快速擴增,對儀器要求較低,通過金屬浴、水浴鍋等簡單的設備即可完成反應。本實驗室研究團隊基于酶擴增DNA的一種新特性,創(chuàng)建了跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)(saltatory rolling circle amplification,SRCA)。SRCA無需人為環(huán)化模板,在等溫條件下僅需1 對引物便可完成對線性DNA的擴增,是一種新型核酸等溫擴增技術(shù)。
成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相關(guān)蛋白(CRISPR associated protein,Cas)組成了CRISPR/Cas系統(tǒng),是細菌和古細菌中的一種獲得性免疫機制。最近的研究發(fā)現(xiàn),Cas12a可在CRISPR RNA(crRNA)引導下靶向結(jié)合雙鏈DNA,產(chǎn)生對單鏈DNA(single strand DNA,ssDNA)的非特異切割活性。由于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)特異性識別以及裂解DNA序列的能力,近年來被用于開發(fā)新型核酸檢測平臺。
基于此,本研究將SRCA擴增反應與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)結(jié)合,建立一種檢測副溶血性弧菌的新方法。檢測原理如圖1所示,首先利用SRCA反應進行核酸擴增,產(chǎn)生許多串聯(lián)重復的靶標序列;然后利用設計的crRNA特異性識別擴增靶標,從而使Cas12a產(chǎn)生對ssDNA的切割活性。利用此特性切割體系內(nèi)ssDNA報告探針,使得修飾在探針兩端的熒光基因和猝滅基團遠離發(fā)出熒光信號,最后通過熒光信號變化判定結(jié)果,從而建立SRCACas12a檢測方法,并將該方法應用到海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的定量檢測。
圖1 SRCA-Cas12a檢測副溶血性弧菌原理圖Fig.1 Schematic illustration of the principle of SRCA-Cas12a for the detection of V.parahaemolyticus
副溶血性弧菌(CICC 21617、CICC 21528、ATCC 17802)、溶藻弧菌(CICC 21664)、創(chuàng)傷弧菌(CICC21615)、大腸埃希氏菌(CMCC 44103)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50115)、腸炎沙門氏菌(CMCC 50041)、單核細胞性李斯特菌(CMCC 54001)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)、福氏志賀菌(ATCC 12022)、宋內(nèi)氏志賀菌(CMCC 51334)、銅綠假單胞桿菌(CICC 21636)均由本實驗室提供保藏;本研究所用序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(并通過聚丙烯酰氨凝膠電泳進行純化);細菌全基因組DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA聚合酶、Cas12a蛋白 美國NEB有限公司;dNTPs、無酶無菌水 北京博邁德基因技術(shù)有限公司;所有溶液均采用無酶無菌水配制。
DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;Nanodrop 2000分光光度計 美國Thermo Scientific有限公司;DXY-33A型電泳儀 北京六一儀器廠;JY04S-3E凝膠成像儀 北京君意電泳設備有限公司;F-320熒光分光光度計 天津港東科技發(fā)展股份有限公司。
1.3.1 細菌培養(yǎng)及核酸提取
副溶血性弧菌在3%氯化鈉堿性蛋白胨水中培養(yǎng),其他菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),過夜培養(yǎng)得到菌懸液,按照細菌全基因組DNA提取試劑盒說明書,取1 mL菌懸液提取DNA。
1.3.2 引物設計
選取副溶血性弧菌的基因為特異性靶基因,通過BLAST同源性比對后,選取的副溶血性弧菌GenBank序列號為L11929.1。利用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件設計SRCA反應的正向引物和反向引物,引物序列信息見表1。
表1 序列信息Table 1 Sequence information of primers used in this study
1.3.3 SRCA擴增反應
SRCA預反應體系為20.0 mmol/L Mg3.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL、10hThermoPol Reaction Buffer 2.0 μL、模板DNA 1.0 μL、10.0 μmol/L正、反向引物各1.0 μL、DNA聚合酶(8 000 U/mL)1.0 μL,添加無酶無菌水將體系補足至20.0 μL,62 ℃反應50 min。反應產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
1.3.4 crRNA以及ssDNA報告分子的合成
crRNA由直接重復序列和間隔序列組成,在CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中,形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的直接重復序列為UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU,間隔序列與檢測序列互補。在副溶血性弧菌檢測序列中找到一個用于激活Cas12a蛋白的富含T核苷酸的原間隔鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)(TTTN,N代表A、T、G或C),crRNA的間隔序列與PAM的下游序列(約21 bp)相同,其中T被U取代。ssDNA報告分子選用FAM和BHQ1探針分別修飾兩端。crRNA及ssDNA的序列信息見表1。
1.3.5 CRISPR/Cas12a剪切反應
CRISPR/Cas12a檢測體系包括1.0 μmol/L Cas12a 1.0 μL、1hNEBuffer 5.0 μL、1.0 μmol/L crRNA 5.0 μL、1.5 μmol/L ssDNA報告分子5.0 μL、SRCA擴增產(chǎn)物5 μL,添加無酶無菌水將體系補足至50.0 μL,37 ℃反應15 min,反應結(jié)束后取出反應樣品移至熒光比色皿中,熒光分光光度計設置激發(fā)波長為492 nm,發(fā)射波長為510~700 nm,進行熒光光譜檢測。以有靶標時的熒光強度與無靶標時的熒光強度的比值表示。
1.3.6 SRCA-Cas12a條件優(yōu)化
為進一步優(yōu)化檢測性能,分別優(yōu)化ssDNA探針濃度、Cas12a/crRNA濃度比、Cas12a剪切反應時間。ssDNA探針濃度設置6 個梯度,依次為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μmol/L。固定Cas12a濃度為1 μmol/L,Cas12a/crRNA濃度比設置8 個梯度,依次為2∶1、4∶3、1∶1、4∶5、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3。Cas12a剪切反應時間依次設置為5、10、15、20、25、30 min。
1.3.7 SRCA-Cas12a檢測靈敏度
將培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液進行10 倍梯度稀釋,同時取各稀釋度菌液1 mL提取基因組DNA,利用SRCACas12a方法對各稀釋度的基因組DNA進行檢測,確定方法的靈敏度。
1.3.8 SRCA-Cas12a特異性
使用細菌全基因組DNA提取試劑盒提取3 株副溶血性弧菌以及10 株非副溶血性弧菌的DNA。采用SRCACas12a方法進行檢測,同時以無酶無菌水作為空白對照,分析方法的特異性。
1.3.9 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測
將培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌液進行10 倍梯度稀釋,選擇適宜稀釋度進行平板計數(shù),每個稀釋度3 個平行。分別取不含副溶血性弧菌的蝦肉樣品和牡蠣樣品5 g,接入不同稀釋度的副溶血性弧菌。將接種后的樣品加入45 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻,取1 mL均質(zhì)液提取DNA后使用SRCA-Cas12a方法進行檢測。
1.3.10 實際樣品檢測
從超市采集水產(chǎn)品36 份,樣品清單見表2。分別采用GB 4789.7ü2013《食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》方法以及SRCA-Cas12a方法進行檢測,驗證SRCACas12a方法在實際樣品檢測中的應用能力。分別根據(jù)式(1)~(3)確定敏感性、特異性和符合率:
表2 36 份實際樣品清單Table 2 List of 36 actual samples tested in this study
分別取25 g實際樣品加入225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中混合均勻,按照GB 4789.7ü2013方法經(jīng)增菌、選擇性分離、純培養(yǎng)及生化鑒定后判定結(jié)果。
取1 mL上述增菌液提取基因組DNA,所提取的基因組DNA作為SRCA-Cas12a方法的檢測模板,根據(jù)熒光信號判定所構(gòu)建熒光傳感器的檢測結(jié)果。
根據(jù)實驗原理,可行性驗證主要分為SRCA擴增反應和剪切反應。
SRCA擴增產(chǎn)物為靶標序列和添加序列的串聯(lián)重復序列,所設計的SRCA目的序列長度為80 bp,如圖2a所示,SRCA擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果與反應原理一致。
Cas12a剪切反應的完整體系包括:Cas12a、crRNA、ssDNA報告分子以及靶標,只有當體系完整時才能檢測到熒光信號,因此設置各組分分別缺失的對照,即Cas12a+crRNA+靶標、Cas12a+靶標+ssDNA、Cas12a+crRNA+ssDNA、crRNA+靶標+ssDNA以及完整體系Cas12a+crRNA+靶標+ssDNA共5 組反應體系進行熒光檢測。如圖2b所示,只有在體系完整的情況下,才能形成Cas12a-crRNA-靶標三元復合物,從而觀察到較強的熒光信號。因此,SRCA擴增反應和Cas12a剪切反應的結(jié)果表明,所設計的SRCA-Cas12a方法可以用于副溶血性弧菌的檢測。
圖2 可行性驗證Fig.2 Feasibility verification
探針是觀察熒光強度的關(guān)鍵因素,因此,本研究對ssDNA探針濃度進行優(yōu)化,從而保證探針的使用效率。如圖3a所示,當ssDNA探針濃度從0.5 μmol/L增加到1.5 μmol/L時,/變化明顯;當ssDNA探針濃度從1.5 μmol/L增加到3.0 μmol/L時,/變化緩慢。因此,本研究選取1.5 μmol/L為探針的最優(yōu)反應濃度。
反應時間的長短會影響檢測速率的快慢。如圖3b所示,當反應時間為5~15 min時,/逐漸增加;當反應時間為15~30 min時,反應進入平臺期。綜上,本研究選取15 min為最優(yōu)反應時間。
在Cas12a剪切反應中,Cas12a-crRNA二元復合物形成量決定了剪切反應的速率。二元復合物形成量過少,影響剪切反應效率,不利于實驗進行;二元復合物形成量過多,增加實驗成本,造成不必要的浪費。如圖3c所示,當Cas12a與crRNA濃度比為1∶1時,/最大。綜合考慮,本研究中Cas12a/crRNA最優(yōu)濃度比為1∶1。
圖3 反應條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction conditions
通過平板計數(shù)得出副溶血性弧菌初始菌液濃度為1.7h10CFU/mL。使用SRCA-Cas12a對不同稀釋度的副溶血性弧菌進行檢測,如圖4所示,熒光信號強度隨著菌液濃度的降低而降低。當副溶血性弧菌菌液濃度為1.7h10~1.7h10CFU/mL時,菌液濃度的對數(shù)與熒光信號強度變化(/)存在線性關(guān)系,線性方程為=1.847 2+2.473 8(=0.986 6),線性關(guān)系良好,檢出限為3.6 CFU/mL(=3)。結(jié)果表明,SRCA-Cas12a可實現(xiàn)對副溶血性弧菌的定量檢測。
圖4 SRCA-Cas12a方法的靈敏度Fig.4 Sensitivity of SRCA-Cas12a
為驗證SRCA-Cas12a檢測副溶血性弧菌的特異性,選取3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進行特異性實驗。如圖5所示,副溶血性弧菌產(chǎn)生的熒光信號強度明顯高于其他食源性致病菌產(chǎn)生的熒光強度。結(jié)果表明,所設計的crRNA可以特異性識別SRCA擴增產(chǎn)物,從而使Cas12a產(chǎn)生對ssDNA的非特異切割活性,ssDNA兩端的熒光基團和猝滅基團遠離,熒光強度增強。相反,其他食源性致病菌不能激活Cas12a的切割活性,熒光猝滅不會恢復。因此,SRCA-Cas12a該方法具有良好的特異性。
圖5 SRCA-Cas12a方法的特異性Fig.5 Specificity of SRCA-Cas12a
為驗證SRCA-Cas12a方法檢測的準確性,測定蝦肉和牡蠣空白樣品的加標回收率。由表3可知,人工污染樣品的加標回收率在95.5%~104.4%之間,相對標準偏差為1.7%~5.2%,表明該方法檢測結(jié)果準確可靠。
表3 人工污染樣品中副溶血性弧菌的檢測(n=5)Table 3 Results of determination of V.parahaemolyticus in artificially contaminated samples (n = 5)
使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對采集的36 份海產(chǎn)品進行檢測,并比較這2 種方法,檢測結(jié)果如表4所示。GB 4789.7ü2013方法陽性樣品檢出數(shù)為15 個,陰性樣品檢出數(shù)為21 個;SRCA-Cas12a方法陽性樣品檢出數(shù)為16 個,陰性樣品檢出數(shù)為20 個。以GB 4789.7ü2013方法檢測結(jié)果為標準,SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率達到97.2%。因此,SRCA-Cas12a方法在實際樣品檢測中有一定的應用能力。
表4 實際樣品檢測結(jié)果Table 4 Results of detection of actual samples by SRCA-Cas12a and conventional culture method
將SRCA擴增反應與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)相結(jié)合,建立了一種檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的新方法。SRCA作為一種新型核酸等溫擴增技術(shù),可對靶標序列快速擴增實現(xiàn)信號放大,同時也可作為對靶標序列的第1重識別。CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中crRNA通過PAM序列與SRCA擴增產(chǎn)物中大量重復的靶標序列結(jié)合,從而對靶標序列二次識別,激活Cas12a的非特異切割活性。研究表明Cas12a的切割速率達到250 次/s。因此,將CRISPR/Cas12a系統(tǒng)與SRCA結(jié)合提高了檢測的靈敏度和特異性。該方法對副溶血性弧菌的線性檢測范圍為1.7h10~1.7h10CFU/mL,檢出限為3.6 CFU/mL。對3 株副溶血性弧菌和10 株非副溶血性弧菌進行特異性實驗的結(jié)果表明,該方法具有良好的特異性。利用SRCA-Cas12a方法進行加標回收率實驗,樣品的加標回收率在95.5%~104.4%之間。使用GB 4789.7ü2013方法以及SRCA-Cas12a方法分別對采集的36 份海產(chǎn)品進行檢測,結(jié)果可得SRCA-Cas12a方法的敏感性為100.0%、特異性為95.2%、符合率為97.2%。此外,由于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的可編程性,該檢測方法可針對不同靶標分子設計引物和crRNA,從而實現(xiàn)對其他食源性致病菌的檢測。并且該方法在現(xiàn)場檢測時可以選擇小型的熒光觀察裝置,通過肉眼觀察結(jié)果。同時,在今后研究中探索基于SRCA-Cas12a方法的多重核酸檢測方法,有望使CRISPR/Cas系統(tǒng)在多重核酸檢測領(lǐng)域得到應用。
綜上所述,SRCA-Cas12a方法具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點,為副溶血性弧菌的快速定量檢測提供了一種新策略,也為其他食源性致病菌的檢測提供新思路,對保障食品安全具有重要的現(xiàn)實意義和參考價值。