陜西省典型冷凍食品中大腸桿菌的分子特征及耐藥性檢測(cè)

徐 旭，楊 靜，張鵬飛，張鈺嘉，阮傅倩，王 婷，李 雯，萬(wàn)陽(yáng)麗，常冠紅，張 瑤，王 新,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.楊凌質(zhì)量技術(shù)檢測(cè)檢驗(yàn)所，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

大腸桿菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道中的共生菌群，屬于條件致病菌，少數(shù)獲得特殊毒力因子的大腸桿菌可引起人畜患病。致病性大腸桿菌攜帶毒力因子眾多，如血清抗性蛋白iss、外膜蛋白、耐熱腸毒素、黏附相關(guān)蛋白等。這些毒力因子是大腸桿菌引起人類食源性疾病的主要原因，能導(dǎo)致腸外感染（尿路感染、各種腹內(nèi)、肺部、皮膚和軟組織感染等）或腸道疾?。ǜ鞣N形式的腹瀉，包括溶血性和尿毒癥綜合征）。根據(jù)它們的毒力因子和引起的臨床癥狀，將其區(qū)分為腸外致病性大腸桿菌（extraintestinal pathogenic，ExPEC）和致瀉性大腸桿菌（diarrheagenic，DEC），DEC根據(jù)感染癥狀進(jìn)一步劃分以下5 類：腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic，EPEC）、腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic，EHEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（enterotoxigenic，ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（enteric invasive，EIEC）和腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative，EAEC）。食用被致病大腸桿菌污染的食物可導(dǎo)致食源性疾病的發(fā)生。2008ü2015年、2017年，我國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)歷年發(fā)布的《全國(guó)食物中毒事件情況的通報(bào)》中，由大腸桿菌引發(fā)的食物中毒事件占微生物食物中毒事件總數(shù)的5%～11%。

細(xì)菌耐藥性已成為威脅全球動(dòng)物和公共衛(wèi)生的一個(gè)重大問(wèn)題。大腸桿菌的耐藥性逐年上升，在世界衛(wèi)生組織所描述的12 種抗生素耐藥“優(yōu)先病原體”名單中，目前排名第3。世界各地已發(fā)現(xiàn)對(duì)-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑和四環(huán)素類具有高耐藥水平的大腸桿菌的流行，對(duì)人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)都構(gòu)成了潛在的高風(fēng)險(xiǎn)。此外，大腸桿菌獲得抗生素耐藥性的基因庫(kù)增加，并且已被證明可以在不同細(xì)菌物種、宿主和環(huán)境中進(jìn)行交換，耐藥基因能夠進(jìn)行水平和垂直傳播。已有報(bào)道表明耐藥大腸桿菌可通過(guò)直接或間接接觸（如食用受污染的食物和水）從環(huán)境傳播給人類。

隨著人們生活節(jié)奏的加快，冷凍食品因其方便快捷的優(yōu)點(diǎn)受到廣大消費(fèi)者的青睞。冷凍保藏能夠一定程度抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，但冷凍食品并非絕對(duì)安全，許多病原微生物在冷凍條件下保持代謝活性和致病能力，如在低溫條件下，大腸桿菌可長(zhǎng)期處于亞致死狀態(tài)，待條件恢復(fù)適宜后能夠進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)并大量繁殖。我國(guó)已出現(xiàn)冰淇淋、速凍食品中大腸菌群超標(biāo)的先例，比利時(shí)也報(bào)道了由冰淇淋中大腸桿菌引發(fā)的感染事件。目前，關(guān)于冷凍食品中大腸桿菌的流行及菌株分子特征及抗菌素耐藥性情況的信息有限。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)陜西地區(qū)冷凍食品（速凍水餃和冰淇淋）進(jìn)行采樣調(diào)查，分析大腸桿菌的污染、毒力基因、耐藥性及種群分型情況，旨在為有效控制冷凍食品中大腸桿菌的污染提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

緩沖蛋白胨水、麥康凱瓊脂、LB（Luria-Bertani）瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；所用15 種抗生素 北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）所用2hMaster Mix、DNA Marker DL2000 南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VD-850型桌上式潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；T100型梯度PCR儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9132A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物技術(shù)有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DH-11L無(wú)菌拍打均質(zhì)機(jī) 寧波洛尚智能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及處理

2011年8 月—2015年9月，于陜西省4 市（寶雞、咸陽(yáng)、西安和渭南）采集典型冷凍食品樣本，共360 份，其中速凍水餃120 份和冰淇淋240 份。速凍水餃和冰淇淋均在－20 ℃冷藏銷售。所有樣本在低溫條件下運(yùn)送至本實(shí)驗(yàn)室，并在4 h內(nèi)進(jìn)行處理。具體采樣信息見表1。

表1 冷凍食品采集地點(diǎn)、類型和數(shù)量Table 1 Sample collection locations, types and quantities

樣本處理具體操作如下：按料液比1∶10（g/mL），將3 個(gè)速凍水餃（17 g/個(gè)）和完整冰淇淋（70 g/個(gè)）樣本分別于450 mL和630 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)機(jī)拍打制成樣品勻漿。為防止在樣本處理時(shí)造成交叉污染，每更換一次樣本更換一雙滅菌筷。

1.3.2 大腸菌群計(jì)數(shù)、大腸桿菌分離及鑒定

大腸菌群的計(jì)數(shù)參照GB 4789.3ü2010《食品微生物檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》進(jìn)行。每個(gè)樣本挑取2 個(gè)大腸菌群鑒定為陽(yáng)性的菌落至LB平板活化，并通過(guò)PCR擴(kuò)增大腸桿菌管家基因作進(jìn)一步鑒定，并將鑒定為陽(yáng)性的菌株于－80 ℃冰箱中保存，備用。每個(gè)樣本隨機(jī)挑選1 株分離株進(jìn)行耐藥、毒力和種群分型實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 DNA模板制備

采用煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA模板。具體操作方法如下：將分離得到的大腸桿菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h。挑取2～3 個(gè)菌落至500 μL ddHO中，100 ℃加熱20 min，12 000h離心3 min，吸取400 μL上清液于另一無(wú)菌EP管，即為DNA模板。所有模板保存于－20 ℃冰箱，備用。

1.3.4 毒力基因及耐藥基因檢測(cè)

采用PCR技術(shù)對(duì)大腸桿菌分離株21 種毒素基因和23 種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。其中21 種毒素基因包括12 種ExPEC相關(guān)毒力基因（、、、、、、、、、、、）、1 種EPEC毒力基因（）、1 種EIEC毒力基因（）、1 種EAEC毒力基因（）、2 種EHEC毒力基因（、）、4 種ETEC毒力基因（、、、）；23 種耐藥基因包括：四環(huán)素耐藥基因（、、）、磺胺類耐藥基因（、、）、-內(nèi)酰胺類耐藥基因（、、）、喹諾酮類耐藥基因（、、、、）、多黏菌素耐藥基因（、）、氯霉素類耐藥基因（）以及氨基糖苷類耐藥基因（、、、、、、’VI）。

1.3.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦的瓊脂稀釋法，對(duì)49 株大腸桿菌分離株進(jìn)行15 種抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)。多黏菌素B的耐藥判斷根據(jù)歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。15 種抗生素及其耐藥折點(diǎn)見表2。

表2 藥敏測(cè)定用抗生素及耐藥折點(diǎn)Table 2 Resistance breakpoints for antibiotics

表3 四重基因型劃分大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群Table 3 Quadruplex genotypes for assigning E.coli isolates to phylo-groups

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，其中大腸菌群計(jì)數(shù)結(jié)果為同一稀釋度下兩次平行計(jì)數(shù)的均值，菌株耐藥表型檢測(cè)為3 個(gè)平行中至少2 個(gè)平行一致的結(jié)果。繪圖工具使用Origin 2021軟件（OriginLab公司）。使用SPSS 18.0軟件檢驗(yàn)進(jìn)行不同樣品類別、地區(qū)、包裝方式及月份之間的大腸桿菌檢出結(jié)果的差異顯著性分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌檢出、計(jì)數(shù)結(jié)果

如表4所示，360 份冷凍食品中49 份檢測(cè)為大腸桿菌陽(yáng)性（13.6%，49/360），包括速凍水餃樣本42 份（35.0%，42/120）和冰淇淋樣本7 份（2.9%，7/240）。42 份速凍水餃陽(yáng)性樣本中，大腸菌群數(shù)小于10 CFU/g有25 份（20.8%），大腸菌群數(shù)為10～100 CFU/g有12 份（10.0%）和大腸菌群數(shù)大于100 CFU/g有5 份（4.2%）。7 份冰淇淋陽(yáng)性樣本中，大腸菌群數(shù)小于10 CFU/g有5 份（2.1%）和大腸菌群數(shù)為10～100 CFU/g有2 份（0.8%）。此外，速凍水餃大腸桿菌陽(yáng)性樣本數(shù)顯著高于冰淇淋樣本（＜0.05）。

表4 冷凍食品中分離的大腸桿菌流行情況及大腸菌群計(jì)數(shù)Table 4 Prevalence of E.coli and coliform counts in frozen foods

如表5所示，4 市速凍水餃樣品大腸桿菌污染較為嚴(yán)重，受污染最高的地區(qū)為西安市（43.3%，13/30），其次為咸陽(yáng)市（40.0%，12/30）、寶雞市（33.3%，10/30）和渭南市（23.3%，7/30）。按照不同餡料進(jìn)行分類，速凍水餃中大腸桿菌污染率最高的為肉餡水餃（包括羊肉和豬肉）（36.2%，34/94）、其次是海鮮餡（33.3%，4/12）和蔬菜餡水餃（28.6%，4/14）。此外，對(duì)不同采樣地點(diǎn)及不同餡料速凍水餃陽(yáng)性樣本數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，速凍水餃大腸桿菌陽(yáng)性樣本數(shù)不存在顯著差異（＞0.05）。

表5 速凍水餃中大腸桿菌流行情況Table 5 Prevalence of E.coli isolated from quick-frozen dumplings

如表6所示，冰淇淋樣本中大腸桿菌檢出率較低，其中咸陽(yáng)市和西安市檢出最高，均為3.8%（3/79），其次為寶雞市（1.2%，1/82）。對(duì)不同采樣地區(qū)便利店和超市進(jìn)行分類，便利店大腸桿菌的檢出率（5.2%，6/116）高于超市（0.8%，1/124）。對(duì)不同包裝方式進(jìn)行分類，袋裝冰淇淋樣本的大腸桿菌檢出率（3.2%，5/156）高于盒裝樣本（2.4%，2/84）。對(duì)采集月份進(jìn)行分類，7月份樣品（6.7%，4/60）中大腸桿菌檢出率高于6月份樣品（5.1%，3/59），8月和9月采集樣本中沒(méi)有分離到大腸桿菌。對(duì)不同采樣地點(diǎn)、超市規(guī)模、包裝方式和采集月份冰淇淋大腸桿菌檢出陽(yáng)性樣本數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，超市規(guī)模對(duì)冰淇淋中大腸桿菌污染影響顯著（＜0.05），其余分類中冰淇淋大腸桿菌陽(yáng)性樣本數(shù)不存在顯著差異（＞0.05）。

表6 不同包裝方式和月份的便利店和超市冰淇淋中大腸桿菌的流行率Table 6 Prevalence of E.coli in ice cream sold at retail stores and supermarkets, in ice cream packaged with different packaging methods and in ice cream collected in different months

2.2 毒力基因檢出結(jié)果

如表7所示，對(duì)49 株大腸桿菌進(jìn)行21 種毒力基因檢測(cè)，共9 種毒力基因被檢出，包括7 種ExPEC相關(guān)毒力基因（、、、、、和）、2 種DEC毒力基因（和）。其中基因和的檢出率最高為14.3%，其次是（12.2%）、（10.2%）、（8.2%）、（4.1%）、（4.1%），和的檢出率均為2.0%。根據(jù)和這兩種特異性基因，DEC菌株被分為以下兩類：EPEC（=4）和EIEC（=2）。

表7 大腸桿菌分離株毒力基因檢出結(jié)果Table 7 Results of detection of virulence genes of E.coli

續(xù)表7

2.3 耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表8所示，49 株大腸桿菌分離株對(duì)阿莫西林/克拉維酸鉀和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（98.0%，48/49）耐藥最為普遍，其次為四環(huán)素（20.4%，10/49）、氨芐西林（16.3%，8/49）和氯霉素（8.2%，4/49），對(duì)慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、頭孢曲松、頭孢噻污、頭孢哌酮、頭孢他啶的耐藥率較低（2.0%，1/49）。此外，受試菌株對(duì)頭孢西丁和多黏菌素敏感。

表8 不同冷凍食品中大腸桿菌分離株耐藥情況Table 8 Resistance rates of E.coli isolates from different frozen foods

如圖1所示，49 株分離株共表現(xiàn)為8 種耐藥譜。所有分離株至少耐受1 種所測(cè)抗生素，最常見的耐藥譜為A/C-T/S（71.4%，35/49），其次為TET-A/C-T/S（10.2%，5/49）。20.4%（10/49）的菌株為多重耐藥菌株，均至少耐受3 種所測(cè)抗生素。此外，1 株分離自蔬菜水餃的菌株對(duì)13 種抗生素表現(xiàn)出耐藥。

圖1 冷凍食品中大腸桿菌耐藥表型譜Fig.1 Antimicrobial resistance profile of E.coli isolates from frozen foods

對(duì)7 類抗生素耐藥相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果如表9所示。-內(nèi)酰胺類抗性基因檢出（14.3%）、（8.2%）和（2.0%）；氨基糖苷類抗性基因檢出（8.2%）、（6.1%）、（2.0%）和（2.0%）；四環(huán)素類抗性基因檢出（12.2%）和（4.1%），未檢出；磺胺類抗性基因檢出（10.2%）、（8.2%）和（2.0%）；喹諾酮類抗性基因檢出（6.1%）、（2.0%）、（2.0%）和（2.0%）和多黏菌素類抗性基因檢出（2.0%）。此外，氯霉素類耐藥基因未檢出。

表9 大腸桿菌分離株耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Table 9 Results of detection of resistance genes of E.coli

2.4 大腸桿菌耐藥表型與耐藥基因相關(guān)性

如圖2所示，統(tǒng)計(jì)49 株大腸桿菌分離菌株的耐藥表型和基因型發(fā)現(xiàn)，除四環(huán)素類抗生素的耐藥基因型和表型基本吻合外，其余5 類抗生素的耐藥表型和基因型不完全一致。本實(shí)驗(yàn)未檢出氯霉素相關(guān)耐藥基因，但有4 株分離株對(duì)氯霉素表現(xiàn)為耐藥；攜帶-內(nèi)酰胺類耐藥基因的菌株有9 株，但98.0%（48/49）的受試菌株對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)為耐藥。

圖2 大腸桿菌耐藥表型和基因型相關(guān)性Fig.2 Correlation between antibiotic resistant phenotypes and genotypes of E.coli isolates

2.5 大腸桿菌種群分型檢測(cè)結(jié)果

如圖3所示，根據(jù)不同進(jìn)化群攜帶的標(biāo)志基因?qū)⒋竽c桿菌分為8 個(gè)進(jìn)化群，本實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌分離株系統(tǒng)發(fā)育群分別為A群、B1群、C群和F群。其中以A群占比最多，為63.3%（31/49），其后依次為C群（18.4%，9/49）、B1群（16.3%，8/49）和F群（2.0%，1/49）。EPEC和EIEC菌株均屬于A群。冰淇淋樣品分離株全部屬于A群系，速凍水餃樣品分離株以A群（24/42）為優(yōu)勢(shì)群，其次為C群（9/42）、B1群（8/42）、F群（1/42）。

圖3 大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群Fig.3 Phylogenetic group distribution of E.coli

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，由大腸桿菌引發(fā)的食物安全事件層出不窮。據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，2000ü 2008年間大腸桿菌導(dǎo)致了203 000 例食源性疾病。大腸桿菌作為食品糞便污染指標(biāo)，其存在通常與不衛(wèi)生、不適當(dāng)?shù)氖称诽幚矸绞?、交叉污染或不?dāng)?shù)氖称焚A藏條件有關(guān)，是引起食源性疾病的重要原因之一。

本研究對(duì)我國(guó)陜西省4 市（寶雞、咸陽(yáng)、西安和渭南）冷凍食品進(jìn)行大腸桿菌監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌檢出率為13.6%（49/360）。這一結(jié)果低于羅娟、史輝、只帥等分別對(duì)新疆、成都和陜西即食食品和零售肉類中大腸桿菌檢出率，表明低溫能一定程度限制食品中微生物的生長(zhǎng)繁殖。方夢(mèng)漁等對(duì)市場(chǎng)上銷售的冷凍食品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)21.56%的樣品中存在大腸菌群超標(biāo)現(xiàn)象。King等曾報(bào)道因食用受大腸桿菌污染的冷凍牛肉產(chǎn)品，導(dǎo)致18 名兒童出現(xiàn)小兒溶血尿毒綜合征。因此，不能忽視冷凍食品中大腸桿菌的污染。速凍水餃中大腸桿菌檢出率顯著高于冰淇淋樣本，其中以肉餡（包括羊肉和豬肉）水餃的大腸桿菌檢出率最高（36.2%，34/94）。導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是由于肉餡填料的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)更適宜微生物的生長(zhǎng)繁殖。所有樣品中有5 份速凍水餃樣品大腸菌群數(shù)量超過(guò)100 CFU/g。目前我國(guó)尚未對(duì)速凍水餃（生制品）中大腸菌群作出限量規(guī)定，但根據(jù)GB 19295ü2011《速凍面米制品》對(duì)速凍熟制品的要求，大腸菌群數(shù)的最高安全限量應(yīng)小于100 CFU/g。速凍水餃若加熱不徹底或存在不能被加熱有效滅活的毒素（如STa），所導(dǎo)致的安全隱患不容忽視。STa是由ETEC產(chǎn)生的耐熱型腸毒素，攝入被其污染的食物將導(dǎo)致急性腹瀉。

對(duì)于冰淇淋樣本，便利店（5.2%，6/116）樣本大腸桿菌檢出率高于超市（0.8%，1/124），袋裝樣本（3.2%，5/156）冰淇淋的大腸桿菌檢出率高于盒裝樣本（2.4%，2/84）。這可能是由于便利店在銷售過(guò)程中的冷鏈保存環(huán)節(jié)不完善以及袋裝樣品更容易受到溫度波動(dòng)的影響，導(dǎo)致冷凍食品的凍融引起微生物的生長(zhǎng)繁殖。冰淇淋樣本中大腸菌群數(shù)未超過(guò)GB 2759ü2015《冷凍飲品和制作料》的限量標(biāo)準(zhǔn)，但冰淇淋作為即食食品，一些致病性強(qiáng)的大腸桿菌的低水平污染也可能構(gòu)成重大風(fēng)險(xiǎn)。2007年比利時(shí)曾暴發(fā)一起由某農(nóng)場(chǎng)生產(chǎn)銷售的冰淇淋引發(fā)的大腸桿菌感染事件，涉及12 人感染。綜上，冷凍食品中大腸桿菌的污染對(duì)消費(fèi)者的健康具有潛在威脅。

大腸桿菌的致病能力與其攜帶的毒力因子密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)分離株的ExPEC相關(guān)基因檢出率較高，包括鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（、、、）、黏附基因（、）和抗血清存活因子相關(guān)基因。已有研究證明鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因能夠顯著增強(qiáng)大腸桿菌在宿主體內(nèi)的存活能力，Aslam等從冷凍肉中分離的大腸桿菌中和基因檢出率較高，與本研究結(jié)果一致，推測(cè)攝鐵能力可能增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)低溫條件的抵抗能力。此外，在本研究中與常同時(shí)存在于1 株菌中，是耶爾森菌強(qiáng)毒力島標(biāo)志基因，能夠在幾乎所有攜帶的大腸桿菌中表達(dá)，增強(qiáng)大腸桿菌的致病性。國(guó)外相關(guān)研究已將鐵載體合成基因（、）作為鑒定ExPEC菌株的參考指標(biāo)之一。本次調(diào)查也證實(shí)了本地區(qū)冷凍食品存在ExPEC污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，根據(jù)和這2 種特異性基因，DEC分離株被區(qū)分為EPEC（8.2%，4/49）和EIEC（4.1%，2/49）。付宇和Lima等報(bào)道食源致病性大腸桿菌主要以EPEC和EIEC為主。EPEC是發(fā)展中國(guó)家嬰兒腹瀉的主要原因；EIEC與志賀氏菌屬密切相關(guān)，可引起人類細(xì)菌性痢疾。由于冰淇淋在食用前無(wú)需加熱，其中致病性大腸桿菌的檢出意味著對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成潛在威脅。結(jié)果還顯示，來(lái)自肉餡速凍水餃的大腸桿菌的毒力基因攜帶率較高（30.6%，15/49）。這一結(jié)果與Badri和Badi等對(duì)動(dòng)物源食品中攜帶毒力基因的大腸桿菌檢出率相似。這表明動(dòng)物源食品可能是引起相關(guān)食源性疾病的主要載體，受污染的生肉或未煮熟的肉類在食源性病原體的傳播過(guò)程中尤為重要。

本研究中大腸桿菌分離株對(duì)阿莫西林/克拉維酸、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、四環(huán)素和氨芐西林的耐藥率較高。歐洲食品安全局報(bào)告稱，-內(nèi)酰胺類抗生素、四環(huán)素和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑是食品中大腸桿菌多重耐藥模式中最常見的抗生素，這些抗生素的高耐藥率可能與其在畜牧業(yè)和人類中的普遍使用有關(guān)，導(dǎo)致耐藥率較高。本研究中DEC菌株至少耐受1 種所測(cè)抗生素。耐藥致病性大腸桿菌對(duì)食品的污染，尤其是即食食品，會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成威脅。這些菌株可能在腸道內(nèi)將抗性基因轉(zhuǎn)移給其他病原微生物或共生細(xì)菌，從而導(dǎo)致選擇或使用合適的治療方法變得困難。一株分離自蔬菜水餃的菌株對(duì)13 種抗生素表現(xiàn)出耐藥，其屬于B1群系。速凍水餃生產(chǎn)工藝復(fù)雜，大腸桿菌的污染可能發(fā)生在食品生產(chǎn)鏈的多個(gè)環(huán)節(jié)，包括原料、加工、銷售等。動(dòng)物源大腸桿菌優(yōu)勢(shì)群系為B1群系，人源大腸桿菌優(yōu)勢(shì)群系為B2群。Araújo等也曾報(bào)道有機(jī)肥的使用導(dǎo)致來(lái)自蔬菜的菌株具有較高的多重耐藥水平。因此推測(cè)是原料受到來(lái)自動(dòng)物源多重耐藥大腸桿菌污染。研究結(jié)果還顯示耐藥菌株的表型和基因型并不完全一致。大腸桿菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸的耐藥性通常由介導(dǎo)，與Karmele等報(bào)道不同的是，本研究中僅有1 株對(duì)阿莫西林/克拉維酸耐藥的菌株攜帶基因。這表明可能存在其他因素介導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥性。目前，普遍認(rèn)為主動(dòng)外排作用是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，Kumar等報(bào)道大腸桿菌中的抗性結(jié)節(jié)細(xì)胞分離超家族能夠促使大腸桿菌主動(dòng)外排氯霉素、-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素等抗生素。因此，分離菌株耐藥但不攜帶耐藥基因可能是由于大腸桿菌能夠通過(guò)主動(dòng)外排泵將藥物從菌體內(nèi)排出；而敏感菌株攜帶耐藥基因則可能是耐藥基因或相關(guān)酶活性被抑制。此外，從速凍水餃樣品中分離得到1 株攜帶的菌株，但對(duì)多黏菌素并未表現(xiàn)出耐藥性。多黏菌素目前用于治療人類和家畜由多重耐藥病原體引起的感染，是一種重要的抗生素。能夠降低大腸桿菌對(duì)多黏菌素的敏感性，被多黏菌素誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生耐藥性，需要嚴(yán)格監(jiān)測(cè)其潛在傳播?；蛲ǔＮ挥谫|(zhì)粒，能夠在細(xì)菌間進(jìn)行快速轉(zhuǎn)移。需考慮到食源性大腸桿菌耐藥基因可能通過(guò)食物鏈傳遞給人類嚴(yán)重威脅人體健康。

本研究確定了從冷凍食品中分離的49 株大腸桿菌分離菌株系統(tǒng)發(fā)育群，優(yōu)勢(shì)群系為A群系，其次為C群。Koo等報(bào)道了食源性大腸桿菌大多屬于A和B1群，與本研究中分離菌株多屬于A和C群系的結(jié)果存在差異，出現(xiàn)這種差異的原因是A和C群具有高度相關(guān)性，在三重基因型劃分系統(tǒng)發(fā)育群中常一同被歸類為A群。已有報(bào)道稱大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育群與毒力及致病性之間存在相關(guān)性。Duriez等研究表明腸道致病型及共生型大腸桿菌優(yōu)勢(shì)群系為A、B1或D，其攜帶毒力基因較少，致病能力較弱；ExPEC多屬于B2和D組。這與本實(shí)驗(yàn)中DEC菌株優(yōu)勢(shì)群系為A群的結(jié)果相符。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中多重耐藥性及攜帶毒力基因的菌株多屬于A和B1群，且基因是B1群菌株中觀察到的最常見基因，其能夠增強(qiáng)菌株引起感染的能力。因此需要重視A和B1群系對(duì)公共健康的影響。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還分離出1 株F群系多重耐藥菌株，該群系與B2群具有高度相關(guān)性和幾乎相當(dāng)?shù)闹虏摿?。該菌株攜帶4 個(gè)ExPEC相關(guān)基因，增強(qiáng)了其在腸道外引起感染的能力，目前已有研究報(bào)道F群系菌株可能引起尿路感染。

通過(guò)對(duì)陜西省冷凍食品大腸桿菌的監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明預(yù)包裝冷凍食品不可避免存在大腸桿菌的污染風(fēng)險(xiǎn)。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)冷凍食品中分離得到EPEC和EIEC的菌株，且存在ExPEC菌株污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為防止大腸桿菌對(duì)冷凍食品的污染，食品加工、運(yùn)輸和貯藏環(huán)境需要加以改善。此外，對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的使用加以干預(yù)，對(duì)于防止細(xì)菌抗生素耐藥性的傳播十分必要。由于食品生產(chǎn)鏈中存在來(lái)自環(huán)境和人類的交叉污染，需要進(jìn)一步的流行病學(xué)研究，以確定不同食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)的潛在污染源。