基于液相色譜-質(zhì)譜法脂質(zhì)組學研究德州驢肌肉的脂質(zhì)組成

李孟孟，宋英華，劉寶秀，薛 鵬，任 薇，柴文瓊，劉桂芹，朱明霞，王長法*

（聊城大學農(nóng)學院，聊城毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東 聊城 252000）

驢（）屬馬屬，是許多國家重要的經(jīng)濟家畜，為人類提供皮（主要用于熬制阿膠）、奶和肉類?！疤焐淆埲猓厣象H肉”，不僅贊美驢肉的美味，更表明驢肉的營養(yǎng)價值和獨特之處。研究表明，與豬、牛和羊肉相比，驢肉不僅肉質(zhì)紅嫩鮮美、纖維細膩、口感勁道，且蛋白質(zhì)及其必需氨基酸豐富。此外，驢肉中脂肪、膽固醇含量和熱量較低，而多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）含量豐富，深受一些消費者喜愛，具有較高的開發(fā)和利用價值。驢肉是我國傳統(tǒng)飲食，特色地方驢肉小吃有河間驢肉火燒、保定驢肉卷、東阿驢肉餃子、廣饒臘驢肉、高唐驢肉和南京五香驢肉等。近年來，驢肉消費在我國越來越流行，尤其在山東、山西和河北。因此，深入解析驢肉的營養(yǎng)價值，尤其是脂質(zhì)組成，對驢肉提質(zhì)增效具有重要實際意義。

研究表明，食物中PUFA在抗炎、降脂和預防心血管疾病方面發(fā)揮重要作用。研究報道驢肉的肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）占2%～4%，且含有較高的單不飽和脂肪酸和PUFA等。另外，IMF是肉品質(zhì)的重要影響因素，與肉的風味、多汁性和嫩度直接相關(guān)。因此，研究驢肉IMF的種類、含量、分布以及優(yōu)勢脂質(zhì)等對認識其營養(yǎng)價值和優(yōu)質(zhì)肉生產(chǎn)具有重要實際意義。然而，目前缺乏驢肉脂質(zhì)組成的系統(tǒng)報道，特別是中國地方特色驢種，如德州驢。德州驢主要分為三粉驢和烏頭驢2 個品種，在產(chǎn)皮、肉和奶方面表現(xiàn)出巨大潛力。此外，德州驢由于適應性和抗病能力強、耐粗飼等特點，在我國已廣泛飼養(yǎng)。鑒于此，本實驗以德州三粉驢和烏頭驢為研究對象，基于液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法脂質(zhì)組學對驢肉脂質(zhì)和脂肪酸組成、差異脂質(zhì)、潛在生物標記物和代謝途徑進行系統(tǒng)研究，旨在為清晰認識德州驢肉營養(yǎng)價值和開發(fā)其肉制品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在山東省聊城市當?shù)剞r(nóng)戶養(yǎng)殖場選擇體質(zhì)量相近、飼養(yǎng)管理一致的2 歲齡左右德州三粉和烏頭公驢各5 頭。全部驢饑餓12 h后被轉(zhuǎn)運到當?shù)赝涝讏觯ㄉ綎|東阿天龍食品有限公司），按照常規(guī)屠宰程序進行屠宰。屠宰后，取背最長肌立即置于液氮中速凍，貯存在－80 ℃冰箱中用于脂肪酸組成和脂質(zhì)組學分析。三粉驢和烏頭驢樣品分別記作SF和WT。

氯仿、甲醇、氫氧化鉀、乙腈和甲酸銨 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；三氟化硼-甲醇溶液 上海安譜實驗科技股份有限公司；CRM47885 37 種C～C混合標準品 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；0.22 μm濾膜 生工生物工程（上海）股份有限公司；異丙醇 天津祥瑞鑫化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；FD5-3T GOLD-SIM冷凍干燥機 美國金西盟國際集團；7890B氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測器）、CP7487毛細管柱（60 mh0.25 mm，0.20 μm）、氣相化學工作站軟件、1290 LC儀 美國安捷倫有限公司；Scientz-48高通量組織研磨儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；5305真空濃縮儀、5424冷凍離心機 德國艾本德股份公司；Kinetex C色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm） 美國飛諾美公司；TripleTOF 6600 plus MS儀 美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸測定

肌肉樣品在－80 ℃冷凍干燥機中冷凍干燥后，使用粉碎機研磨成肉粉，放在－80 ℃冰箱中備用。樣品總脂質(zhì)提取采用氯仿-甲醇法（2∶1，/），肌肉脂肪酸測定方法依據(jù)前期研究報道的方法。脂質(zhì)使用0.50 mol/L KOH-甲醇溶液和15%三氟化硼-甲醇溶液在70 ℃水浴下轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯，待氣相色譜分析。進樣1 μL，柱烘箱溫度在140 ℃保持5 min，并以4 ℃/min升高到220 ℃，保持10 min。通過與37 種C～C混合標準品對比鑒定樣品中各種脂肪酸。最后使用氣相化學工作站軟件對脂肪酸進行分析，各種脂肪酸以占總脂肪酸含量的百分比表示。

1.3.2 LC-MS分析

樣品脂質(zhì)提取前處理依據(jù)前期相關(guān)研究報道的方法，并稍作修改。取約100 mg樣品于2 mL勻漿管中，加入750 μL氯仿-甲醇混合溶液（2∶1，/）和1 顆3 mm鋼珠，放入高通量組織研磨儀中60 Hz研磨120 s；樣品在冰上提取2 h，每30 min渦旋振蕩30 s；在4 ℃、10 000h離心15 min，所得上清液在真空濃縮至干；樣品溶解于200 μL異丙醇，0.22 μm濾膜過濾后于－20 ℃冰箱中貯藏備用。

LC條件：C色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）；自動進樣器溫度8 ℃；柱溫55 ℃；流動相A：乙腈-水（40∶60，/，含10 mmol/L甲酸銨）；流動相B：異丙醇-乙腈（90∶10，/，含10 mmol/L甲酸銨）；流速0.30 mL/min。梯度洗脫程序：0～1.5 min，60% A、40% B；1.5～10.5 min，60%～15% A、40%～85% B；10.5～14 min，15% A、85% B；14～14.1 min，15%～0% A、85%～100% B；14.1～15 min，0% A、100% B；15～15.2 min，0%～60% A、100%～40% B；15.2～18 min，60% A、40% B。

MS條件：電噴霧離子源；正模式進樣體積2 μL，負模式進樣體積6 μL；離子源霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi，氣簾氣壓力30 psi，離子源溫度600 ℃，正、負模式電壓分別為5 000 V和－4 500 V；去簇電位100 V。采用數(shù)據(jù)相關(guān)采集方法，每個采集周期包括一個快速飛行時間質(zhì)譜（time of flight mass spectrometry，TOF MS）掃描（200 ms），然后連續(xù)采集11 個子離子掃描（每個50 ms）。TOF MS掃描質(zhì)量范圍為200～2 000 Da，碰撞能量10 eV。子離子掃描范圍100～2 000 Da，碰撞能量（45f25）eV。采用動態(tài)背景排除法去除無必要的MS/MS信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 德州三粉驢和烏頭驢肌肉脂質(zhì)和脂肪酸組成

由圖1可知，將原始數(shù)據(jù)通過脂質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫/進行檢索，2 種驢肉均鑒定出1 101 種脂質(zhì)分子屬于13 個亞類，包括20.65%（脂質(zhì)分子數(shù)量占比，下同）甘油三酯（triglyceride，TG）、5.91%甘油二酯（diacylglycerol，DG）、0.09%甘油一酯（monoglyceride，MG）、26.64%磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、16.74%磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、7.91%磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、6.41%磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、2.83%磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、1.35%磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、5.83%神經(jīng)酰胺（ceramides，Cer）、4.08%鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、0.26%鞘氨醇（sphingosine，Sph）和0.42%磺胺肽（sulfatide，ST）。分析德州三粉驢和烏頭驢肌肉中主要脂質(zhì)發(fā)現(xiàn)，TG為優(yōu)勢脂質(zhì)，其次是磷脂（PC、PE、PG和PI）；TG、PC、PE、PG、PI、PS、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）和SM的相對含量在2 種驢肌肉中均無顯著差異（＞0.05）；而DG相對含量在三粉驢肌肉中顯著高于烏頭驢（＜0.001）（圖1B）。另外，脂肪酸C、C和C分別為2 種驢肌肉最主要的飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）、單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）和PUFA；2 種驢肌肉中脂肪酸C、C、C、SFA、C、C、C、MUFA、C、C、C和PUFA的相對含量均無顯著差異（＞0.05）。

圖1 德州三粉驢和烏頭驢背最長肌脂質(zhì)和脂肪酸組成Fig.1 Lipid and fatty acid profiles in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

2.2 德州三粉驢和烏頭驢肌肉差異脂質(zhì)分子

由圖2可知，OPLS-DA評估德州三粉驢和烏頭驢肌肉的脂質(zhì)組結(jié)果具有明顯的區(qū)別；置換檢驗圖的和截距值在離子模式下分別為（0.0，0.93）和（0.0，0.04）。如表1所示，共篩選出37 種差異脂質(zhì)分子（VIP＞1和＜0.05），包括5 種TG、8 種DG、10 種PC、6 種PE、2 種LPE、2 種PG、2 種PI、1 種PS和1 種SM；其中三粉驢與烏頭驢相比，32 種上調(diào)，5 種下調(diào)（圖3A）。對差異脂質(zhì)分子進行ROC分析，結(jié)果表明，11 種脂質(zhì)分子的ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）、特異性和敏感性均分別為1、100%和100%（圖3B），包括1 種PC（PC(19:2)）、3 種TG（TG(18:3_18:2_16:0)、TG(16:0_16:0_16:0)和TG(20:1_20:1_17:0)）、7 種DG（DG(18:2_18:1)、DG(18:1_16:0)、DG(18:2_16:0)、DG(18:1_18:1)、DG(18:1_18:0)、DG(18:2_18:0)和DG(18:2_18:2)）；其中三粉驢的PC(19:2)和TG(16:0_16:0_16:0)的含量顯著低于烏頭驢，而其他9 種脂質(zhì)分子表現(xiàn)為相反的趨勢（圖3C）。

圖2 德州三驢粉和烏頭驢背最長肌的脂質(zhì)組學數(shù)據(jù)的OPLS-DA評估（A）和置換檢驗圖（B）Fig.2 OPLS-DA score plot (A) and permutation test plot (B) of lipidomic data of longissimus dorsi of SF and WT donkeys

圖3 德州三粉驢和烏頭驢背最長肌差異脂質(zhì)分子和潛在脂質(zhì)標記物Fig.3 Differential lipid molecules and potential lipid markers in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

表1 德州三粉和烏頭驢背最長肌差異脂質(zhì)分子的詳細信息Table 1 Information on differential lipid molecules in longissimus dorsi of SF and WT donkeys

續(xù)表1

2.3 脂質(zhì)代謝途徑

由圖4可知，37 種差異脂質(zhì)分子主要富集在14 條代謝途徑，包括花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、逆行內(nèi)源性大麻素信號、糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成途徑、阿米巴病、癌癥中膽堿代謝、利什曼病、自噬-動物、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自噬-其他。其中，獲得5 條與脂質(zhì)代謝最相關(guān)的途徑，包括甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成途徑、-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝。

圖4 德州三粉驢和烏頭驢背最長肌差異脂質(zhì)分子功能富集Fig.4 Functional enrichment of differential lipid molecules in longissimus dorsi muscle of SF and WT donkeys

3 討 論

關(guān)于驢肉中脂質(zhì)組成的研究甚少，但對豬、雞、羊肉的研究較多。本研究表明，德州三粉驢和烏頭驢肉均鑒定出1 101 種脂質(zhì)分子，屬于13 個亞類。這些結(jié)果與豬肉（1 180 種脂質(zhì)）和雞肉（1 127 種脂質(zhì)）脂質(zhì)分子的結(jié)果基本一致，卻遠多于驢乳中的335 種脂質(zhì)。值得注意的是，驢肉中磷脂分子數(shù)量（680多種）占總脂質(zhì)分子的61.87%，其占比顯著高于豬肉（38.31%）和雞肉（30.90%），這表明驢肉含有豐富種類的磷脂分子。本研究中，德州驢肌肉中TG為優(yōu)勢脂質(zhì)，占總脂質(zhì)的75%以上，其次是磷脂（PC、PE、PI、PG和PS）；DG相對含量在三粉驢肌肉中顯著高于烏頭驢，這可能對于提高肌內(nèi)脂肪沉積具有重要潛力，由于肌內(nèi)脂肪主要由TG和磷脂組成，而DG是合成TG和磷脂的重要中間產(chǎn)物。此外，本研究表明，德州驢2 個品種肌肉中，脂肪酸C、C和C分別為其最主要的SFA、MUFA和PUFA，與前期報道的德州三粉驢公驢肌肉具有相似的結(jié)論。然而，三粉驢和烏頭驢肌肉中所有脂肪酸組成均無顯著差異，這可能是由于2 種驢均屬于德州驢品系，且實驗驢喂食飼料和飼養(yǎng)管理條件一致。

采用OPLS-DA評估德州三粉驢和烏頭驢肌肉的脂質(zhì)數(shù)據(jù)，二者呈明顯分離。OPLS-DA在建模型時對樣本進行指定和分組，所得結(jié)果可能存在過擬合現(xiàn)象。為進一步闡明OPLS-DA評估的可行性，應用置換檢驗圖評估當前模型是否過擬合，和截距值在離子模式下分別為（0.0，0.93）和（0.0，0.04）。此結(jié)果均符合：所有均低于最右原始；回歸線縱軸截距小于等于0；OPLS-DA未發(fā)生過擬合。這也證實基于LC-MS的脂質(zhì)組學方法適用于驢肉脂質(zhì)組成的全面分析。

通過VIP＞1和＜0.05，共篩選出37 種差異脂質(zhì)分子；三粉驢與烏頭驢相比，32 種脂質(zhì)上調(diào)，5 種下調(diào)。其中，8 個DG分子相對含量在三粉驢中顯著高于烏頭驢，這與DG相對含量在三粉驢肌肉中顯著高于烏頭驢的結(jié)果一致。這表明差異DG分子對DG含量起決定作用，在脂質(zhì)分子水平揭示了三粉驢高DG的機制。DG是生物體內(nèi)脂肪代謝的內(nèi)源中間產(chǎn)物，為脂質(zhì)亞類之一，是多種細胞活動的第二信使，已被證明能加速脂肪酸-氧化，影響脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達，從而降低血清和肝臟中TG水平，加速脂質(zhì)體內(nèi)代謝。此外，DG協(xié)同增強PS降低膽固醇含量的能力，可用于預防和輔助治療動脈粥樣硬化。本研究共鑒定出65 種DG，三粉驢肌肉富含8 種（脂肪酸組成主要為C、C、C和C），這為驢肉功能脂質(zhì)開發(fā)提供了基礎(chǔ)。為進一步篩選區(qū)分三粉驢和烏頭驢肉的脂質(zhì)標記物，對37 種差異脂質(zhì)分子進行ROC分析，共計11 種脂質(zhì)分子AUC均為1，包括1 種PC、3 種TG和7 種DG。三粉驢中2 種TG（TG(18:3_18:2_16:0)和TG(20:1_20:1_17:0)）和7 種DG（(DG(18:2_18:1)、DG(18:1_16:0)、DG(18:2_16:00)、DG(18:1_18:1)、DG(18:1_18:0)、DG(18:2_18:0)和DG(18:2_18:2)）的含量均顯著高于烏頭驢，PC(19:2)和TG(16:0_16:0_16:0)的含量顯著低于烏頭驢。這為2 個品種德州驢肉的區(qū)分提供了參考。

基于脂質(zhì)組學途徑分析發(fā)現(xiàn)，37 種差異脂質(zhì)主要富集在14 條代謝途徑。花生四烯酸代謝是最顯著的代謝途徑，其次是甘油磷脂代謝和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。根據(jù)差異脂質(zhì)對代謝途徑的影響程度，確定甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、糖基磷脂酰肌醇-錨定生物合成途徑、-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝是最關(guān)鍵的5 條代謝途徑。這些相關(guān)通路可能與不同品系德州驢肌肉脂質(zhì)代謝差異最相關(guān)。研究報道，豬肉中脂質(zhì)差異和代謝途徑與豬品種有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。此外，研究表明豬肌內(nèi)沉脂的差異可能由脂肪酸、甘油脂質(zhì)和甘油磷脂代謝途徑差異引起。因此，本研究結(jié)果表明驢品種不同導致肌肉脂質(zhì)代謝途徑差異，引起相關(guān)脂質(zhì)分子含量變化，尤其是DG、PC和PE等。

本研究基于LC-MS脂質(zhì)組學分析不同品種德州驢肌肉脂質(zhì)組成。在三粉驢和烏頭驢肌肉中均鑒定出1 101 種脂質(zhì)分子屬于13 個亞類。德州驢肌肉TG為優(yōu)勢脂質(zhì)，其次是磷脂（PC、PE和PI），且三粉驢肌肉中含有較高的DG。使用生物信息學篩選出37 種差異脂質(zhì)分子，進一步篩選出11 種區(qū)分2 種驢肉的候選生物標志物和5 條脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑。本研究深入分析德州驢肉脂質(zhì)組成，在脂質(zhì)分子和代謝水平解析德州驢不同品種肌肉脂質(zhì)的差異，篩選出的差異脂質(zhì)分子和相關(guān)代謝途徑可作為區(qū)分驢肉的潛在生物標志物，為清晰認識德州驢肉營養(yǎng)價值和開發(fā)其肉制品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。