乳酸菌發(fā)酵核桃酸乳不良?xì)馕兜男纬膳c分析

齊 琳，王 帥，蘇 晨，忠 夢，王冰悅，吉洋洋，何愛民，宋 昊*，榮瑞芬,*

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實驗室，北京 100023；2.北京市理化分析測試中心，北京 100089；3.河北?。ㄐ吓_）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 臨城 054300；4.北京一輕研究院有限公司，北京 101111）

核桃富含多不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、多糖、多酚及黃酮等營養(yǎng)健康成分，營養(yǎng)與保健價值極高，但其產(chǎn)品種類少，原果食用口感單調(diào)、苦澀，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的食用。近年來，益生菌乳酸菌的健康作用愈來愈受到專家和消費(fèi)者認(rèn)可，乳酸菌發(fā)酵食品正被世界各國看好，成為研究開發(fā)熱點(diǎn)，特別是乳酸菌發(fā)酵植物酸乳具有動物酸乳不可比的資源優(yōu)勢，正受到眾多企業(yè)和市場的青睞，但植物酸乳常有一種特殊的味道，如酸豆乳的豆腥味，常不被人喜愛。乳酸菌發(fā)酵核桃酸奶也存在一種與口感相背離的特殊氣味，不同于酸豆乳的豆腥味，有人稱其為生味、油脂味，屬不良特征風(fēng)味。酸豆乳豆腥味的形成及其風(fēng)味物組成經(jīng)過大量研究可知是以己醛、己醇為主的一類揮發(fā)性化合物，酸豆乳風(fēng)味已得到改進(jìn)，產(chǎn)品紛紛問世。乳酸菌發(fā)酵核桃酸乳問世產(chǎn)品僅見有六個核桃品牌酸乳，但也未大規(guī)模上市。核桃酸乳品質(zhì)改進(jìn)仍在研究進(jìn)展中，有關(guān)工藝與產(chǎn)品開發(fā)研究較多，而酸乳風(fēng)味的研究目前較少且不夠深入，特別是不良?xì)馕兜奶岢龊脱芯旷r見報道。

薛純等采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對核桃乳發(fā)酵及貯藏過程中的香氣物質(zhì)進(jìn)行全面的分析檢測，結(jié)果表明發(fā)酵核桃乳中主體香氣物質(zhì)為正己醇和乙偶姻，發(fā)酵前的核桃乳中正己醇和正己醛含量最高，正己醛具有生乳味，對不良風(fēng)味及其風(fēng)味物未進(jìn)行研究，而改善核桃酸乳不良?xì)馕侗仨殞ζ湫纬珊徒M成有清晰的認(rèn)識和了解。

基于前人研究基礎(chǔ)，本實驗對核桃酸乳風(fēng)味形成有影響的3 個層面設(shè)計實驗，通過風(fēng)味感官評價比較分析不同核桃原料乳組分、不同發(fā)酵菌劑對核桃發(fā)酵乳不良特征風(fēng)味產(chǎn)生的影響，分析發(fā)酵過程中原料組分與風(fēng)味變化規(guī)律，并對核桃乳發(fā)酵過程中原料乳的氧化、主要營養(yǎng)物質(zhì)的變化及其與風(fēng)味物的相關(guān)性進(jìn)行分析；采用HSSPME-GC-MS技術(shù)對核桃乳發(fā)酵過程的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行分析測定，并對其關(guān)鍵風(fēng)味物進(jìn)行相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析和主成分分析（principal component analysis，PCA），探究核桃發(fā)酵乳不良?xì)馕兜男纬杉拔镔|(zhì)組成，為進(jìn)一步改善核桃發(fā)酵乳風(fēng)味品質(zhì)，開發(fā)營養(yǎng)美味的核桃發(fā)酵乳深加工產(chǎn)品提供理論依據(jù)，研究結(jié)果對促進(jìn)核桃產(chǎn)業(yè)快速健康發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃仁和核桃粕，產(chǎn)香型乳酸菌發(fā)酵劑：乳酸乳球菌乳酸亞種-嗜熱鏈球菌-嗜酸乳桿菌（1∶1∶1，/），杜邦營養(yǎng)與配料食品有限公司提供（公司1）；產(chǎn)酸型乳酸菌發(fā)酵劑：嗜熱鏈球菌-德氏乳桿菌-保加利亞亞種（3∶1∶3，/），蛋白水解酶 河北綠嶺果業(yè)有限公司提供（公司2）；綿白糖 市購。

石油醚、苯、三氯甲烷、沒食子酸、冰乙酸、硫酸氫鈉、碘化鉀、異辛烷、硫代硫酸鈉、茴香胺、淀粉、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、正庚烷、無水甲醇、無水乙醇（均為分析純） 北京化工廠；蘆?。ǚ治黾儯?國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林-酚試劑 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；亞油酸甲酯、油酸甲酯、亞麻酸甲酯（標(biāo)準(zhǔn)品） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

實驗室小型打漿機(jī) 美的集團(tuán)；YC7132型膠體磨天津市寶田機(jī)電有限公司；GYB60-6S型高壓均質(zhì)機(jī)上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；HG-940A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-1C型超凈工作臺 上海培固實驗儀器有限公司；UV-1800型紫外分光光度計 日本島津公司；HH6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；6820 GC儀、火焰離子化檢測器、7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀、123-7032色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；手動固相微萃取進(jìn)樣手柄、50/30 μm萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃發(fā)酵酸乳配方與生產(chǎn)工藝

配方：核桃仁與核桃粕質(zhì)量比為2∶1，料液比1∶10（g/mL），白砂糖8%，乳酸菌發(fā)酵菌劑，接種量0.1%。

發(fā)酵工藝：原料預(yù)處理→磨漿→過篩→調(diào)配→均質(zhì)→滅菌→冷卻→接種→28 ℃發(fā)酵13 h→4 ℃后熟24 h→成品→酸度測定和感官指標(biāo)檢測。

1.3.2 核桃發(fā)酵乳感官評價

感官評價指標(biāo)見表1，感官評價人員由6 名食品專業(yè)的老師和學(xué)生組成。

表1 核桃發(fā)酵酸乳感官評價評分Table 1 Criteria for sensory evaluation of walnut yogurt

1.3.3 核桃發(fā)酵乳不良特征風(fēng)味形成機(jī)理

1.3.3.1 原料不同預(yù)處理與組分對發(fā)酵乳不良特征風(fēng)味形成的影響

對核桃發(fā)酵乳原料分別進(jìn)行蛋白酶酶解蛋白質(zhì)、脫脂、脫酚處理，使原料組成成分中分別為缺少蛋白質(zhì)、無脂肪和無多酚存在，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵、后熟后進(jìn)行酸度測定和風(fēng)味感官評定，確定原料中對不良?xì)馕队绊戄^大的組分。

1.3.3.2 不同發(fā)酵菌劑對核桃發(fā)酵乳不良特征風(fēng)味形成的影響

分別采用杜邦營養(yǎng)公司的產(chǎn)香型發(fā)酵菌劑：乳酸乳球菌乳酸亞種-嗜熱鏈球菌-嗜酸乳桿菌（1∶1∶1）和河北綠嶺公司提供的產(chǎn)酸型發(fā)酵菌劑：產(chǎn)酸型嗜熱鏈球菌-德氏乳桿菌-保加利亞亞種（3∶1∶3）發(fā)酵核桃乳，進(jìn)行感官評價。

1.3.3.3 核桃乳發(fā)酵過程中原料組分與揮發(fā)性化合物含量與變化規(guī)律分析

以1.3.1節(jié)的配方與生產(chǎn)工藝制備核桃發(fā)酵乳，以發(fā)酵0 h的原料乳為對照，發(fā)酵4、7、10、13 h，后熟24 h分別取樣，測定發(fā)酵不同時間的酸乳組分、揮發(fā)性化合物組分含量，分析其變化趨勢，結(jié)合感官評價，與0 h對照比較，分析不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生、變化規(guī)律及可能的形成機(jī)制和不良?xì)馕段锝M成。樣品分析3 次重復(fù)，3 次平行。

發(fā)酵乳品質(zhì)指標(biāo)與組分分析測定方法：感官評價測定參照GB 19302ü2010《發(fā)酵乳中規(guī)定的感官評定方法》；脂肪酸含量測定參照GB/T 31325ü2014《植物蛋白飲料核桃露（乳）測定》；酸度測定參照GB 5009.239ü2016《食品酸度的測定》；脂肪含量測定參照GB 5009.6ü2016《食品中脂肪的測定》；蛋白質(zhì)含量測定參照GB 5009.5ü2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》；有機(jī)酸測定參照米智慧等的方法；羰基價測定參照GB 5009.230ü2016《食品中羰基價的測定》。

發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物檢測：采用HS-SPME-GC-MS法測定。

GC條件：采用程序升溫方式，起始溫度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至90 ℃，再以12 ℃/min升溫至250 ℃保持7 min；載氣He（純度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比1∶30。

MS條件：電子電離源；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，數(shù)據(jù)采集模式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍/50～450。

定性與定量分析：揮發(fā)性化合物利用NIST08.L譜庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對得到的譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行串聯(lián)檢索和人工解析，獲得未知化合物與質(zhì)譜庫中已知化合物的匹配度，匹配度大于80即初步確定未知物為該物質(zhì)。利用面積歸一化法計算各組分峰面積百分比（相對含量）。

1.3.3.4 核桃發(fā)酵乳關(guān)鍵風(fēng)味物與PCA

ROAV分析參照劉登勇等的ROAV法，按下式計算：

式中：C為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量/%；T為某揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的感覺閾值/（μg/kg）；為氣味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)風(fēng)味性物質(zhì)的相對含量/%；為氣味貢獻(xiàn)最大揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的感覺閾值/（μg/kg）。

PCA：采用SPSS軟件分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)3 次重復(fù)，利用SPSS 12.0軟件分別對各指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析以及與核桃發(fā)酵乳不良?xì)馕兜南嚓P(guān)性分析，采用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃發(fā)酵乳不良特征風(fēng)味形成途徑

乳酸菌在發(fā)酵過程主要將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳酸，并在胞外酶作用下分解蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生與發(fā)酵風(fēng)味有關(guān)的醛、酮、醇、酸等物質(zhì)。不同原料，因組成成分含量等不同，其發(fā)酵食品風(fēng)味不同。

2.1.1 原料組分對核桃發(fā)酵乳酸度、感官與不良?xì)馕兜挠绊?/p>

如表2所示，脫除脂肪組的不良?xì)馕讹@著降低，同時核桃香味也明顯降低。蛋白酶解組不良?xì)馕队休p微減弱，同時產(chǎn)生了一定的后苦味，這與蛋白酶解產(chǎn)生小分子疏水性肽有關(guān)。脫除多酚組依然有明顯的不良?xì)馕?。表明原料乳脂肪成分對發(fā)酵乳整體風(fēng)味與不良?xì)馕缎纬捎绊戄^大。

表2 原料組分對核桃發(fā)酵乳酸度、感官和不良?xì)馕兜挠绊慣able 2 Effect of different pretreatments on sensory evaluation of fermented walnut milk

3 組處理原料乳發(fā)酵產(chǎn)酸顯著不同，蛋白質(zhì)酶解組的發(fā)酵乳酸度最高，為64.3，顯著高于脫脂和脫酚處理的發(fā)酵乳酸度（＜0.01），脫脂處理的發(fā)酵乳酸度最低，為42.7，脫酚組酸度居中，為56.8，表明脂肪在乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸中有重要作用。

2.1.2 不同發(fā)酵菌劑對核桃發(fā)酵酸乳酸度、感官與不良?xì)馕兜挠绊?/p>

如表3所示，產(chǎn)酸性菌劑組酸乳不良?xì)馕睹黠@大于產(chǎn)香菌種的風(fēng)味，酸度也大，極顯著高于產(chǎn)香菌種酸度55.1 °T（＜0.01），酸乳風(fēng)味也有差異，表明此2 種不同乳酸菌劑發(fā)酵過程都會產(chǎn)生不良?xì)馕?，產(chǎn)生的酸乳風(fēng)味也不相同，此結(jié)果與文鵬程、白琳、于素素、任婷婷等研究結(jié)果相似。

表3 不同發(fā)酵菌劑對核桃發(fā)酵乳酸度、感官與不良?xì)馕兜挠绊慣able 3 Sensory evaluation results of walnut yogurt fermented by different starter cultures

2.1.3 核桃乳發(fā)酵過程中不良特征風(fēng)味相關(guān)性分析

核桃發(fā)酵乳風(fēng)味和不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生是伴隨著發(fā)酵產(chǎn)酸過程產(chǎn)生的，因此分析發(fā)酵乳酸度、乳酸、乙酸含量變化與不良特征風(fēng)味產(chǎn)生的相關(guān)性。

2.1.3.1 核桃乳發(fā)酵過程中酸度、有機(jī)酸與不良?xì)馕叮ㄌ卣黠L(fēng)味）的變化及其相關(guān)性分析

如圖1A所示，核桃乳發(fā)酵過程前7 h發(fā)酵乳酸度和不良?xì)馕吨低絼蛩偕仙L(fēng)味、不良?xì)馕毒宓话l(fā)酵7 h后，可聞到明顯的發(fā)酵不良?xì)馕?，并持續(xù)上升，達(dá)到最高值10 分，后熟期不良?xì)馕督档?，但酸度出現(xiàn)緩慢而后又快速上升趨勢，超過了不良?xì)馕兜淖罡咧?，表現(xiàn)出與不良?xì)馕断喾吹淖兓厔?。相關(guān)性分析核桃發(fā)酵乳的不良?xì)馕杜c酸度存在0.05水平的顯著正相關(guān)性（=0.886*），表明發(fā)酵乳不良?xì)馕兜男纬墒请S著發(fā)酵產(chǎn)酸過程逐步增強(qiáng)的，但并不完全同步。不同發(fā)酵時間有機(jī)酸含量與不良?xì)馕蹲兓鐖D1B所示，發(fā)酵過程中乳酸變化表現(xiàn)為前期上升快，后期慢的趨勢，與不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生不同步，乙酸在發(fā)酵過程中始終保持含量很低，變化極小。

圖1 不同發(fā)酵時間發(fā)酵乳酸度（A）和有機(jī)酸含量（B）與不良?xì)馕兜淖兓疐ig.1 Changes in acidity (A), organic acid content (B) and unpleasant odor value in fermented walnut milk with fermentation time

乳酸和乙酸風(fēng)味是熟知的風(fēng)味，與核桃發(fā)酵酸乳不良?xì)馕断嗖钌踹h(yuǎn)，因此，乳酸和乙酸不會直接導(dǎo)致不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生。

2.1.3.2 核桃乳發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量與不良?xì)馕叮ㄌ卣黠L(fēng)味）的變化趨勢分析

如圖2所示，核桃乳發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量前期快速降低，而不良?xì)馕恫⑽纯焖僭黾樱砻鞯鞍踪|(zhì)組分對不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生影響不大，在前述不同原料組分對不良?xì)馕队绊懷芯恐幸惨炎C實，因此，可判斷蛋白質(zhì)不是導(dǎo)致不良?xì)馕懂a(chǎn)生的主要組分。蛋白質(zhì)含量的降低與蛋白質(zhì)在乳酸菌分泌的蛋白酶作用下水解產(chǎn)生肽和氨基酸有關(guān)，乳酸菌具有利用氨基酸進(jìn)行代謝的能力，同時氨基酸可參與風(fēng)味物的形成，對發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味形成有影響。

圖2 不同發(fā)酵時間發(fā)酵乳蛋白質(zhì)含量的變化Fig.2 Changes in protein content in fermented walnut milk with fermentation time

2.1.3.3 核桃乳發(fā)酵過程中脂肪含量與不良?xì)馕叮ㄌ卣黠L(fēng)味）的變化及其相關(guān)性分析

如圖3所示，隨著發(fā)酵時間的延長，核桃發(fā)酵乳脂肪含量在勻速降低，在發(fā)酵時間為13 h脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至最低，為2.5%，而3 種主要不飽和酸脂肪酸含量在不斷增加，表明核桃乳脂肪在乳酸菌種作用下水解為游離脂肪酸，且隨時間延長脂肪酸含量持續(xù)增加，直到后熟期間仍呈增加趨勢。與此同時，核桃發(fā)酵乳不良?xì)馕对谥饾u增強(qiáng)，二者相關(guān)性分析=－0.952**，＜0.01，核桃發(fā)酵酸乳不良?xì)馕蹲兓c脂肪含量減少呈極顯著負(fù)相關(guān)，即與脂肪的水解呈顯著的正相關(guān)。

圖3 不同發(fā)酵時間發(fā)酵乳脂肪（A）與脂肪酸（B）含量與不良?xì)馕兜淖兓疐ig.3 Changes in fat (A) and fatty acid (B) contents and unpleasant odor value in fermented walnut milk with fermentation time

2.1.3.4 核桃乳發(fā)酵過程中羰基價與不良?xì)馕叮ㄌ卣黠L(fēng)味）變化及其相關(guān)性分析

如圖4所示，隨著發(fā)酵時間的延長，核桃發(fā)酵乳的羰基價開始不斷升高，在發(fā)酵0～7 h，羰基價從0.725 mmol/kg升至0.98 mmol/kg，極顯著增加（＜0.01），至后熟24 h后，羰基價仍顯著升高至1.18 mmol/kg。表明核桃乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生了較多的醛酮類產(chǎn)物，同時核桃發(fā)酵乳不良?xì)馕对诓粩嗉訌?qiáng)。相關(guān)性分析表明不良?xì)馕蹲兓c羰基價的變化在0.05水平上存在正相關(guān)（=0.917*），由此可判斷不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生可能與原料乳中的脂肪氧化相關(guān)。

圖4 不同發(fā)酵時間發(fā)酵乳羰基價與不良?xì)馕兜淖兓疐ig.4 Changes in carbonyl value and unpleasant odor value of fermented walnut milk with fermentation time

2.2 核桃發(fā)酵乳揮發(fā)性化合物與不良特征風(fēng)味物分析

2.2.1 核桃發(fā)酵乳揮發(fā)性化合物的HP-SPME-GC-MS分析

SPME-GC-MS方法被廣泛應(yīng)用在風(fēng)味物分析檢測，為探究核桃發(fā)酵酸乳不良?xì)馕缎纬蓹C(jī)制及其組成成分，采用HP-SPME-GC-MS對核桃乳發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析測定。

2.2.1.1 核桃乳發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物物數(shù)量變化

如表4所示，核桃乳發(fā)酵前，產(chǎn)香型核桃發(fā)酵乳揮發(fā)性化合物共15 種，以醇和醛類物較多，其中正己醇相對含量最高，為25.9%（表5），與薛純等的研究結(jié)果一致。隨發(fā)酵時間延長，揮發(fā)性化合物數(shù)量逐漸增加，發(fā)酵4 h時總數(shù)達(dá)30 種，感官可聞到不良?xì)馕懂a(chǎn)生，其中醇類化合物增加最多，新增11 種，烯、醛、酯、酸、酮類化合物均有新增，發(fā)酵10 h，揮發(fā)性化合物總數(shù)達(dá)到52 種，不良?xì)馕吨饾u增加至后熟期，發(fā)酵后期酮類、酸類物數(shù)量增加4 倍，醛類化合物發(fā)酵前后數(shù)量相對穩(wěn)定，不良?xì)馕稖p弱。

表4 不同發(fā)酵時間產(chǎn)香型菌劑發(fā)酵核桃乳中各種揮發(fā)性化合物數(shù)量Table 4 Changes in number of volatile compounds in fermented walnut milk with fermentation time

發(fā)酵前，發(fā)酵原液中醇和醛類化合物已達(dá)到4 種，多于其他類化合物，這可能與原料在打漿研磨過程中核桃脂肪酸發(fā)生水解和氧化有關(guān)。目前已知醇、醛、酸、酮、酯類化合物是各類食物的主要揮發(fā)性風(fēng)味物，因此可判斷新增醇、醛、酸、酮、酯類物質(zhì)可能與發(fā)酵核桃乳不良?xì)馕队嘘P(guān)。

2.2.1.2 核桃乳發(fā)酵前后揮發(fā)物相對含量變化及ROAV分析

將測得的風(fēng)味物與工作站所帶標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫比對，參照文獻(xiàn)查找相關(guān)閾值，參考已有的大豆發(fā)酵酸乳、酸牛乳、核桃發(fā)酵酸乳風(fēng)味物質(zhì)風(fēng)味特性，總結(jié)產(chǎn)香型和產(chǎn)酸型核桃乳發(fā)酵過程中主要風(fēng)味物相對含量、風(fēng)味特性和ROAV如表5、6所示。

ROAV是量化評價不同揮發(fā)性物質(zhì)對總體風(fēng)味貢獻(xiàn)程度的指標(biāo)，本研究認(rèn)為ROAV≥1的組分是對所分析樣品風(fēng)味影響較大的風(fēng)味化合物，0.5≤ROAV＜1的組分對樣品的總體風(fēng)味具有重要的修飾作用。產(chǎn)香型核桃酸乳發(fā)酵前后不同時間各揮發(fā)性化合物相對含量和ROAV如表5所示，大于1的ROAV由大到小依次為()-2-庚烯醛（86.7）＞乙偶姻＞己酸＞正己醇＞2-庚酮＞正辛醇＞1-庚醇＞苯甲醛＞2-壬酮＞苯乙烯＞苯乙醇（1.42），表明此11 種風(fēng)味物是產(chǎn)香型核桃酸乳中的主要風(fēng)味物，其中關(guān)鍵風(fēng)味物為()-2-庚烯醛、乙偶姻、己酸和正己醇，它們對產(chǎn)香型核桃酸乳整體風(fēng)味有較大影響。()-2-庚烯醛和正己醇風(fēng)味描述均有果香、芳香味或青草、油脂味風(fēng)味，2 種氣味分屬不同風(fēng)味類別，這可能與揮發(fā)性化合物濃度大小有關(guān)，濃度小通常表現(xiàn)為怡人香味，濃度大反而表現(xiàn)為不良?xì)馕?，本研究測得()-2-庚烯醛發(fā)酵后期相對含量較高，選擇其為青草油脂味，根據(jù)風(fēng)味物風(fēng)味特性，()-2-庚烯醛、己酸為不良?xì)馕兜闹饕獊碓次铮遗家隹烧J(rèn)為是良好風(fēng)味的主要來源物，其余風(fēng)味物是對核桃酸乳風(fēng)味有一定修飾作用物質(zhì)。

表5 產(chǎn)香型菌劑核桃乳發(fā)酵過程中各類揮發(fā)性風(fēng)味化合物相對含量與ROAV分析（n=5）Table 5 Changes in percentage contents and ROAV of various volatile flavor compounds during the fermentation process of walnut milk with aroma-producing bacteria (n = 5)

結(jié)合風(fēng)味物特性和感官評價，由發(fā)酵過程風(fēng)味物相對含量變化可知，發(fā)酵前的核桃乳中的正己醇和()-2-庚烯醛含量已較高，但此時感官并未明顯感覺到有核桃發(fā)酵酸乳的不良特征風(fēng)味。發(fā)酵后正己醇依然保持較高含量，并新增5 個醇類物，正辛醇表現(xiàn)為青草、油漆味、油脂味、酒味，與不良?xì)馕缎纬捎嘘P(guān)。醛類物發(fā)酵后新增苯甲醛、苯乙醛和糠醛，苯甲醛被認(rèn)為是不好風(fēng)味。揮發(fā)性酸類物檢測到3 種，為棕櫚酸、乙酸和己酸，棕櫚酸無味，乙酸為醋味，己酸是發(fā)酵后產(chǎn)生，表現(xiàn)為尖酸性干酪味，與感官聞到的酸腐味的不良特征味有相似之處。因此，綜合考慮核桃發(fā)酵乳不良?xì)馕秮碓次锟膳卸橐?)-2-庚烯醛、己酸為主，包含正己醇、苯甲醛、正辛醇在內(nèi)的揮發(fā)性化合物。

如表6所示，風(fēng)味化合物變化最顯著之處是發(fā)酵產(chǎn)生酸類化合物較多，產(chǎn)生醇、醛、酮類化合物較少，其中己酸仍是在發(fā)酵后檢測到，其含量高且ROAV最大，此外醛、酮類化合物的ROAV也較大，ROAV大于1的風(fēng)味物由大到小依次為己酸＞()-2-庚烯醛＞2-庚酮＞正己醇＞苯甲醛＞丁酸丁酯＞2-壬酮＞苯乙醛，表明這8 種化合物是對產(chǎn)酸型核桃酸乳整體風(fēng)味有較大影響風(fēng)味物，不良?xì)馕秮碓次镆彩羌核岷?)-2-庚烯醛，良好風(fēng)味來源物為庚酮、丁酸丁酯和壬酮。

表6 產(chǎn)酸型菌劑核桃乳發(fā)酵過程中各類揮發(fā)性風(fēng)味化合物的相對含量與ROAV分析（n=5）Table 6 Changes in percentage contents and ROAVs of various volatile flavor compounds during the fermentation of walnut milk with acidproducing bacteria (n = 5)

2.2.1.3 核桃發(fā)酵酸乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA

對2.2.1.2節(jié)分析得出的產(chǎn)酸型和產(chǎn)香型核桃酸乳中主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行PCA。如表7所示，2 種核桃酸乳關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)主要集中在前2 個PC，累計方差貢獻(xiàn)率分別達(dá)到73.207%和79.878%，接近80%。

表7 核桃發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PC特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 7 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components for volatile flavor compounds in fermented walnut milk

如圖5所示，表明2 種酸乳的風(fēng)味物有共性，表現(xiàn)奶香、酸乳風(fēng)味等良好風(fēng)味的乙偶姻、庚酮、丁酸丁酯、糠醛類化合物基本都分布在PC2正向端，表現(xiàn)不良?xì)馕兜募核帷?)-2-庚烯醛、正己醇、苯甲醛基本分布在PC1的正向端，2 類風(fēng)味物在載荷圖上分布區(qū)域有明顯差異。己酸的分布也有明顯差異，產(chǎn)酸型酸乳中在PC1的正向端高分區(qū)域，與不良特征風(fēng)味相關(guān)性較大，而在產(chǎn)香型酸乳中分布在PC1和PC2的負(fù)向端低分區(qū)域，表明在產(chǎn)香型酸乳中己酸對不良?xì)馕兜呢暙I(xiàn)率相對較小，該分析結(jié)果與感官評價產(chǎn)香型酸乳不良特征味小的結(jié)果一致。

圖5 產(chǎn)酸型（A）和產(chǎn)香型（B）核桃酸乳各風(fēng)味物質(zhì)的載荷圖Fig.5 Loading plots of PC1 versus PC2 for flavor components of walnut yogurt fermented with acid-producing (A) and aroma-producing (B) bacteria

綜合核桃發(fā)酵酸乳揮發(fā)性成分ROAV分析結(jié)果和PCA結(jié)果，二者對關(guān)鍵風(fēng)味物的分析結(jié)果一致，可以確定核桃發(fā)酵酸乳不良特征風(fēng)味來源物是以己酸、()-2-庚烯醛為主的揮發(fā)性成分，正己醇、苯甲醛等對不良特征風(fēng)味形成有影響，可作為不良?xì)馕兜男揎椢铩?/p>

2.2.2 核桃發(fā)酵乳不良特征風(fēng)味形成機(jī)制分析

在2.1節(jié)中脫脂核桃乳發(fā)酵后幾乎無不良?xì)馕懂a(chǎn)生已可鎖定核桃酸乳不良特征風(fēng)味的產(chǎn)生與脂肪組分有關(guān)，核桃乳發(fā)酵過程中脂肪含量變化及羰基價變化與不良特征風(fēng)味變化呈顯著相關(guān)，表明不良特征風(fēng)味與脂肪的氧化過程相關(guān)。在2.2節(jié)中核桃酸乳不良特征風(fēng)味物分析主要為己酸、()-2-庚烯醛及正己醇、苯甲醛等風(fēng)味物，這些物質(zhì)已被證明是亞油酸和亞麻酸在脂肪氧化酶作用下氧化生成13-C氫過氧化物，繼續(xù)在裂解酶作用下裂解為C～C中間產(chǎn)物，因此可以得出核桃酸乳不良?xì)馕缎纬赏緩街饕呛颂以先樵诎l(fā)酵過程中伴隨原料乳中脂肪水解，產(chǎn)生的游離亞油酸和亞麻酸在氧化酶作用下發(fā)生氧化，進(jìn)一步裂解、氧化產(chǎn)生己醇、己酸、苯甲醛、2-庚烯醛、苯乙醛等氧化產(chǎn)物的過程，與酸豆乳豆腥味的產(chǎn)生途徑相似。

3 結(jié) 論

乳酸菌發(fā)酵核桃酸乳關(guān)鍵風(fēng)味物包含()-2-庚烯醛、乙偶姻、己酸、正己醇、正辛醇、1-庚醇、苯甲醛、2-壬酮、2-庚酮、苯乙烯和苯乙醇11 種主要風(fēng)味物，其中不良?xì)馕段镏饕羌核帷?)-2-庚烯醛、己醇、苯甲醛，核桃發(fā)酵酸乳不良?xì)馕兜男纬蓹C(jī)制主要是由原料中油脂所含多不飽和脂肪酸在加工、發(fā)酵過程中發(fā)生水解、氧化、裂解、再氧化等生物合成與分解過程中產(chǎn)生，與酸豆乳豆腥味的產(chǎn)生途徑相似；與酸豆乳豆腥味主要成分己醛、己醇、1-辛烯-3-醇、戊醛、()-2-己烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛相比，二者不良特征風(fēng)味物主要成分僅己醇相同，其他風(fēng)味物不同，這可能是導(dǎo)致酸豆乳豆腥味和核桃酸乳不良?xì)馕陡泄俑杏X相差很大的原因。