HS-SPME-GC-MS結(jié)合電子鼻分析烘烤對大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

包陳力根，關(guān)淳博，辛明航，滕 旭，劉婷婷,*，王大為,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食用菌加工技術(shù)集成科研基地，吉林 長春 130118；3.吉林省糧食精深加工與高效利用工程研究中心，吉林 長春 130118；4.吉林省糧食精深加工與副產(chǎn)物高效利用技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室，吉林 長春 130118）

大球蓋菇（）系球蓋菇科球蓋菇屬的一種珍稀食用菌，又被稱為赤松茸、皺球蓋菇、酒紅球蓋菇，是國際市場上十大蘑菇之一，富含蛋白質(zhì)、多糖、礦物質(zhì)及維生素等，是優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)保健食材，素有“山林珍品”、“素中之葷”的美譽，并具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血糖等多種生物活性，深受消費者的青睞。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是構(gòu)成食品風(fēng)味的重要因素，通常人們對食品的選擇和愛好主要取決于其揮發(fā)性風(fēng)味。而風(fēng)味的產(chǎn)生離不開風(fēng)味前體物質(zhì)，風(fēng)味前體物質(zhì)在加熱條件下可發(fā)生熱降解反應(yīng)、美拉德反應(yīng)、油脂氧化反應(yīng)等使食品中脂肪、糖類及蛋白質(zhì)發(fā)生變化的反應(yīng)，從而形成不同的風(fēng)味物質(zhì)，對產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生影響。烘烤是食品加工中形成風(fēng)味的主要途徑，Adelina等發(fā)現(xiàn)松子在烘烤前后揮發(fā)性化合物含量有明顯變化；Shi Yi等采用電子鼻和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（head space-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）研究糙米在烘烤過程中香氣成分變化，發(fā)現(xiàn)烘烤過程中雜環(huán)化合物含量增加，呋喃和吡嗪類物質(zhì)對香氣品質(zhì)作出巨大貢獻；Hwang等研究烘烤溫度對香菇揮發(fā)性風(fēng)味的影響，表明160 ℃烘烤60 min的香菇揮發(fā)性化合物最多；烘烤還可改善產(chǎn)品的顏色、質(zhì)地及延長保質(zhì)期。目前對大球蓋菇的栽培方式、提取物及功能因子進行較多研究，但對其風(fēng)味研究甚少，Hu Si等研究不同干燥方式對大球蓋菇非揮發(fā)性風(fēng)味的影響，并說明真空冷凍干燥能更好地保存大球蓋菇中的非揮發(fā)性化合物，熱風(fēng)干燥樣品的等效鮮味濃度值最高。

目前，絕大多數(shù)大球蓋菇以干品形式供給市場，其風(fēng)味寡淡，如能對其進行提升風(fēng)味的處理，能大幅度提高大球蓋菇的應(yīng)用范圍及消費量，有效拉動大球蓋菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，也已經(jīng)有較多關(guān)于食用菌揮發(fā)性風(fēng)味的研究，Li Qin等對雙胞蘑菇鮮品進行3 種不同烹調(diào)方式（煮沸、高壓蒸氣和微波加熱）的加工，發(fā)現(xiàn)煮沸蘑菇湯中揮發(fā)性化合物的種類比其他2 種方式高，不同食用菌其揮發(fā)性風(fēng)味各有不同，烘烤對大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響的研究，國內(nèi)外鮮見相關(guān)報道。本研究采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)、電子鼻及感官評定研究烘烤溫度對大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，并對其揮發(fā)性組分進行分析，闡明豐富和改善大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味的烘烤條件，為大球蓋菇精深加工及綜合利用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大球蓋菇干品（含水量6%）由吉林省梅河口市鑫鑫蔬菜種植專業(yè)合作社提供，將除雜后的大球蓋菇干品用于樣品的制備。

1.2 儀器與設(shè)備

H-1000B高速多功能粉碎機 上海冰都電器有限公司；TSQ9000 GC-MS聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技有限公司；PEN3型電子鼻 德國Airsense公司；HP-INNOWax毛細管柱、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司；XYF-1E遠紅外線食品烤爐 廣州電熱設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

挑選無霉變、無病蟲害的大球蓋菇干品，切割成形狀小于0.5 cm，再將大球蓋菇塊兒粉碎至粒度為0.125 mm的粉末，分別取6 份大球蓋菇粉末（每份100 g）進行處理，其中一份樣品作為對照，不進行烘烤，其余5 份粉末平鋪于烤盤中，分別在不同溫度下（100、120、140、160、180 ℃）烘烤5 min即為樣品，烘烤溫度和時間為預(yù)實驗基礎(chǔ)上選擇。

1.3.2 HS-SPME條件

參照文獻[12]的方法，準確稱取1.0 g樣品，置于8 mL頂空瓶中，用帶有聚四氯乙烯隔墊的蓋子密封，置于60 ℃條件下平衡30 min，將已老化好的50 μm DVB/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭插入頂空瓶中吸附40 min，后取出復(fù)合萃取頭插入到GC進樣口中，推出復(fù)合萃取頭中的纖維頭，在250 ℃條件下解吸5 min。

1.3.3 GC-MS條件

GC條件：HP-INNOWax強極性柱（30 mh0.25 mm，0.25 mm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min；以5 ℃/min速率升溫至150 ℃，保持1 min；以8 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持2 min；以10 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持2 min；進樣口溫度250 ℃，氦氣流速1.0 mL/min，分流比為5∶1。

MS條件：電子電離源；電離能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度240 ℃；溶劑延遲2.0 s；全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍/33～550。

根據(jù)得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖，利用GC-MS自帶的標(biāo)準譜庫（NIST）對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行檢索定性分析，保留正反匹配度大于800的結(jié)果，同時根據(jù)保留指數(shù)（retention index，RI）及文獻報道的RI對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行再次鑒定。

1.3.4 電子鼻傳感器檢測

電子鼻是由多個性能彼此重疊的氣敏傳感器和適當(dāng)?shù)哪Ｊ椒诸惙椒ńM成具有識別單一和復(fù)雜氣體能力的裝置，PEN3型電子鼻由10 個加熱型金屬氧化物傳感器陣列、氣體流量控制系統(tǒng)及分析控制軟件組成，金屬氧化物半導(dǎo)體對揮發(fā)性化合物具有不同的選擇性和敏感性，具有一定的特異性，電子鼻10 根傳感器描述如表1所示。稱取0.1 g的樣品置于進樣瓶中，并用帶有PTFE氣密性隔墊的蓋子蓋上，靜置30 min，用電子鼻探頭吸取進樣瓶頂端氣體并分析測定其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，電子鼻設(shè)置的參數(shù)為測試時間60 s、清洗時間90 s、內(nèi)部流量300 mL/min、進樣流量300 mL/min，每組進行3 次平行實驗。

表1 電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance description of electronic nose sensors

1.3.5 關(guān)鍵風(fēng)味化合物評定

采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法，參考文獻[14]算法，定義對大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味成分貢獻最大的ROAV為100，其他揮發(fā)性風(fēng)味組分按下式計算：

式中：和分別為該揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量/%和閾值/（mg/kg）；和分別為對整體風(fēng)味貢獻最大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量/%和閾值/（mg/kg）。

1.3.6 感官評定

感官評定小組由7 名經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的成員組成，通過重復(fù)討論最終確定烘烤大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味的特征術(shù)語。感官評定采用5 分制，0 分表示無香氣強度，3 分表示中等香氣強度，5 分表示較強香氣強度，每個樣品品評3 次，取平均值即為香氣強度值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量采用峰面積歸一化法，使用Tbtools軟件對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的百分比數(shù)據(jù)進行熱圖分析，采用Origin 2021軟件對電子鼻數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和雷達圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

由圖1、表2可知，不同溫度烘烤的大球蓋菇中共鑒定出87 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其主要為醛類13 種、酯類17 種、醇類18 種、烷烴類4 種、酮類9 種、酸類8 種、吡嗪類4 種及其他類14 種，大球蓋菇在烘烤過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成與含量存在顯著差異。未烘烤樣品中，酸、醇類物質(zhì)的含量占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的71.89%，其中酸類物質(zhì)含量物質(zhì)最高，占總揮發(fā)組分的36.72%，其次是醇類，占35.17%；6 個樣品中酸類物質(zhì)相對含量均最高，分別達到36.72%、37.28%、38.81%、35.41%、28.13%、27.39%。隨著烘烤程度增加，醇類含量顯著減少，醛類、烷烴類、吡嗪類物質(zhì)含量有所增加，酸類物質(zhì)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，酯類、酮類及其他類物質(zhì)含量沒有顯著差異。

圖1 不同烘烤溫度大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)量（A）及相對含量（B）Fig.1 Number (A) and relative content (B) of volatile flavor components in S.rugoso-annulata roasted at different temperatures

表2 不同烘烤溫度大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及相對含量Table 2 Composition and relative content of volatile flavor components in S.rugoso-annulata roasted at different temperatures

續(xù)表2

續(xù)表2

醛類物質(zhì)是食用菌中含量豐富、味覺閾值也相對較低的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，賦予食品特殊風(fēng)味。未烘烤樣品中醛類物質(zhì)相對含量為9.94%，隨著烘烤溫度升高，醛類物質(zhì)含量有所增加，100、120、140、160、180 ℃樣品中醛類物質(zhì)相對含量分別為10.11%、11.19%、13.21%、26.42%、26.79%。其中相對含量較多的醛類物質(zhì)為異戊醛和正己醛，異戊醛具有麥芽香、水果香氣，正己醛賦予食品青香的味道，此外，苯甲醛在所有樣品中均有檢出，具有特殊的櫻桃與杏仁香氣；2-甲基丁醛只存在于烘烤后的樣品中，其相對含量為0.88%～6.88%，推測這可能是亮氨酸在高溫下的Strecker反應(yīng)產(chǎn)生，增加了堅果、麥芽和獨特的可可香氣。

酯類化合物可通過酯化反應(yīng)得到，即有機酸和醇類反應(yīng)，生成酯類化合物同時生成一分子水，其中無環(huán)狀的羥基羧酸經(jīng)分子內(nèi)酯化可形成內(nèi)酯，所有樣品中酯類物質(zhì)共17 種，140 ℃烘烤生成酯類物質(zhì)最多13 種，可能是因為酯化反應(yīng)的產(chǎn)生，丙位戊內(nèi)酯和4-羥基丁酸內(nèi)酯含量相對較高，增加樣品椰子香氣。

醇類物質(zhì)其前體物質(zhì)主要是多不飽和脂肪酸，一般是脂質(zhì)氧化而成的一類閾值較高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，當(dāng)濃度足夠高時可對風(fēng)味起重要貢獻作用。未烘烤樣品中醇類物質(zhì)相對含量為35.17%，隨著溫度升高，醇類物質(zhì)總含量呈遞減趨勢。其中，異戊醇、正戊醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、苯乙醇是主要揮發(fā)性物質(zhì)，異戊醇具有青香的味道，正己醇提供花香、脂肪香，苯乙醇具有玫瑰香，1-辛烯-3-醇屬于C醇，也叫做蘑菇醇，有標(biāo)志性的蘑菇氣味、泥土味和玫瑰氣味，是一種脂肪族不飽和醇；由酶促降解的亞油酸，產(chǎn)生堿性芳香化合物的“蘑菇壤香”氣味，在后續(xù)烘烤樣品中，含量明顯減少，這可能是因為C醇在熱處理過程中易降解或分解造成的。

酮類是一類重要的風(fēng)味物質(zhì)，短鏈酮類具有脂香和焦香香氣，長鏈酮類則呈現(xiàn)出花香氣息，隨著烘烤溫度升高，酮類物質(zhì)相對含量增多，這可能是由不飽和脂肪酸的降解引起的，其中奇數(shù)碳原子的甲基酮具有堅果奶酪的味道。表中甲基壬基甲酮是共有的酮類物質(zhì)，具有奶香味、水果味，在烘烤大球蓋菇過程中，起到風(fēng)味增強的作用。

烷烴類物質(zhì)閾值較高，對大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味貢獻不大，共檢出3 種烷烴類物質(zhì)，120 ℃烘烤時生成十四烷，并隨著溫度升高，相對含量增多；吡嗪類物質(zhì)共鑒定出4 種，2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪只存在于烘烤樣品中，并隨著溫度升高，相對含量增加，帶有令人愉悅的可可香氣和堅果香氣，推測是因為在烘烤過程中產(chǎn)生了美拉德反應(yīng)；酸類物質(zhì)閾值較高，其中異戊酸隨著烘烤溫度升高，相對含量降低，減少了酸臭味。

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)熱圖聚類分析

為進一步分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，對6 個樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)繪制成熱圖，如圖2所示，可以直觀地看到6 個樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)明顯有差異。藍色代表低含量，紅色代表高含量，熱圖中顏色越深代表該成分含量越高。從圖2可知，十二醛、苯乙醛、反,順-2,6-壬二烯醛、丁酸甲酯、異戊酸甲酯、戊酸甲酯、乙酸異戊酯、異丁醇與2,3-二甲基-1-丁醇只存在于未烘烤樣品中；6 個樣品中檢測到共有物質(zhì)25 種，分別為異丁醛、異戊醛、戊醛、正己醛、苯甲醛、乙酸甲酯、丙位戊內(nèi)酯、4-羥基丁酸內(nèi)酯、丙位壬內(nèi)酯、酞酸二甲酯、異戊醇、正戊醇、正己醇、蘑菇醇、苯甲醇、苯乙醇、甲基壬基甲酮、2(5)-呋喃酮、異戊酸、正戊酸、正己酸、甲苯、2-戊基呋喃、對甲苯胺和2-乙?；量缓婵具^程中生成40 種風(fēng)味物質(zhì)，烘烤使風(fēng)味物質(zhì)的豐富度增加，140 ℃烘烤時，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最多達到63 種，主要呈麥芽香、果香、玫瑰香、堅果香和可可香，同時保留了大球蓋菇原有的蘑菇香氣；100 ℃和120 ℃烘烤樣品具有相似的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，140、160 ℃和180 ℃烘烤樣品中揮發(fā)性風(fēng)味標(biāo)志物聚為一類。

圖2 不同烘烤溫度大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類熱圖Fig.2 Cluster heat map of volatile flavor compounds of S.rugosoannulata roasted at different temperatures

2.3 電子鼻數(shù)據(jù)分析

使用配有10 種類型傳感器的電子鼻對樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)特征進行分析，對結(jié)果進行PCA，總結(jié)屬性和樣本之間的整體關(guān)系。由圖3可知，PC1和PC2貢獻率分別為90.3%和7.7%，累計貢獻率為98%，說明PC1和PC2可以反映樣品中的絕大部分信息。圖中同一樣品的數(shù)據(jù)點聚集程度相對較好，表明同一樣品的重復(fù)性和穩(wěn)定性相對較高；并且烘烤前后樣品區(qū)域明顯分布不同；不同烘烤溫度的各個樣品之間分離顯著，由此說明6 個樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異較大，電子鼻可以準確有效地區(qū)分。電子鼻雙標(biāo)圖中W6S、W3S與未烘烤樣品相關(guān)聯(lián)，W1C、W3C和W5C與烘烤100、120、140 ℃相關(guān)聯(lián)，W5S、W1W、W2W、W2S和W1S與烘烤160、180 ℃相關(guān)聯(lián)。

圖3 不同烘烤溫度大球蓋菇電子鼻PCA圖（A）及雷達圖（B）Fig.3 Principal component analysis (A) and radar chart (B) of the electronic nose data for S.rugoso-annulata roasted at different temperatures

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的微小變化都會導(dǎo)致電子鼻傳感器響應(yīng)值的差異，如圖3B所示，W1S、W1W和W2W傳感器的響應(yīng)值差異明顯，表明樣品經(jīng)過烘烤含有較多的烴類物質(zhì)、硫化物、有機硫化物和芳香化合物。W5S傳感器的響應(yīng)值起初變化不大，180 ℃烘烤樣品響應(yīng)值較高，表明該樣品中含有較多氮氧化物，相比之下W1C、W3C、W6S、W5C及W3S傳感器響應(yīng)值較低，但信號強度仍然不同。電子鼻可以有效區(qū)分不同烘烤溫度大球蓋菇的揮發(fā)性風(fēng)味，且與HS-SPME-GC-MS測定結(jié)果基本一致。

2.4 關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)鑒定

通常，把人們能感受到某種香氣物質(zhì)的最低濃度稱為該香氣物質(zhì)的氣味閾值，通過已報道的氣味閾值分析各揮發(fā)性風(fēng)味成分的ROAV見表3，異戊醛的閾值較低，相對含量較高，對大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味貢獻最大，定義異戊醛為大球蓋菇的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，即ROAV=100。表中僅列出ROAV不小于0.1的34 種物質(zhì)，ROAV不小于1的組分為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，ROAV越大，表明該物質(zhì)對大球蓋菇揮發(fā)性總體風(fēng)味成分貢獻越大；0.1≤ROAV＜1的組分對樣品風(fēng)味具有重要的修飾作用，6 個樣品中各個物質(zhì)的ROAV存在一定的差異。2-甲基丁醛、異戊醛、正己醛、反式-2-壬烯醛、乙酸己酯、蘑菇醇、甲基壬基甲酮、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-戊基呋喃及苯酚的ROAV不小于1，因此均可視為關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其余23 種化合物對大球蓋菇揮發(fā)性總體風(fēng)味成分具有重要的修飾作用。

表3 不同烘烤溫度大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAVTable 3 ROAV of volatile flavor compounds in S.rugoso-annulata roasted at different temperatures

2.5 感官評定分析

如圖4所示，烘烤大球蓋菇的揮發(fā)性風(fēng)味屬性被描述為麥芽香、蘑菇香、青香、堅果可可香及奶香甜香，這與HS-SPME-GC-MS和關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)鑒定的分析結(jié)果相吻合，可明顯看到不同樣品之間感官屬性方面存在一定差異。140 ℃烘烤的樣品在蘑菇香、青香、堅果可可香和奶香甜香方面的評定值均高于其余樣品；160 ℃烘烤樣品的麥芽香氣評定值比其他樣品高；未烘烤樣品在麥芽香、堅果可可香及奶香甜香的評定值均為最低，這與上述電子鼻和HS-SPME-GC-MS分析結(jié)果一致，再次說明了烘烤增加大球蓋菇香氣，提高揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的豐富度。

圖4 不同烘烤溫度大球蓋菇感官評定雷達圖Fig.4 Rader chart of sensory evaluation of S.rugoso-annulata roasted by different temperatures

3 結(jié) 論

采用HS-SPME-GC-MS共鑒定出87 種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括醛類、酯類、醇類、烷烴類、酮類等其他物質(zhì)，烘烤過程中，醛類、烷烴類、吡嗪類物質(zhì)含量有所增加，醇類物質(zhì)含量減少，140 ℃烘烤時生成物質(zhì)種類最多，達到63 種，提高了風(fēng)味的豐富度，增加了果香、麥芽香、玫瑰香、堅果香和可可香味，使該樣品總體風(fēng)味有所改善；通過繪制聚類熱圖，可直觀看到各個樣品間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異，利用電子鼻PCA和雷達圖分析，不同烘烤溫度處理的大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和氣味輪廓得到了明顯區(qū)分；且電子鼻與HS-SPME-GC-MS的分析結(jié)果具有一定的相關(guān)性，并結(jié)合ROAV篩選出34 種關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，主要是醛類和醇類香氣，呈現(xiàn)麥芽香、果香和可可香等天然香氣；感官評定結(jié)果表明不同烘烤溫度處理的大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味存在差異，140 ℃烘烤的樣品香氣突出，與上述分析結(jié)果基本一致，研究結(jié)果可為大球蓋菇揮發(fā)性風(fēng)味成分分析及大球蓋菇食品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。