王筱迪,周金杭,曹 雪,高文浩,尹乾隆,任皓威,2,劉 寧,2,*
(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030;2.哈爾濱騰凝科技有限公司,黑龍江 哈爾濱 150030)
母乳喂養(yǎng)是為嬰兒健康成長和發(fā)育提供理想食物的一種最佳方式,對嬰兒和母親的健康都有獨特的生理和情感影響。人乳是6 個月內(nèi)的嬰兒最理想的天然食品。世界衛(wèi)生組織提倡對0~6 個月嬰兒母乳喂養(yǎng),且繼續(xù)母乳喂養(yǎng)至1 歲以上。母乳不僅為嬰兒提供了超過50%的膳食能量需求,而且還作為一種載體在膳食中提供必需脂肪酸和脂溶性維生素。其中的脂質(zhì)不僅作為嬰兒神經(jīng)和視網(wǎng)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成部分,還可能通過抑制細菌腸毒素參與抗菌功能,保護嬰兒的健康成長。在人乳所有營養(yǎng)成分中,人乳脂肪是最復雜的天然脂質(zhì)之一,并顯示出最大的可變性。人乳脂質(zhì)的主要成分為甘油酯(glycerides lipid,GL)、甘油磷脂(glycerophospholipid,GP)、鞘脂(sphingolipid,SP)、甾醇脂(sterol lipid,ST)與脂肪酸及其衍生物(fatty acids,F(xiàn)As)。
人乳是一個動態(tài)系統(tǒng),其成分因母親而異(人種和個體),并受到泌乳階段、飲食、健康狀況等因素的影響。人乳不是靜態(tài)的流體,而是隨著時間的推移而變化,尤其是泌乳階段中脂質(zhì)的變化部分地反映了嬰兒的需求。雖然已有一些研究對不同泌乳期人乳中脂肪酸組成進行了研究,但很少有研究報道整個泌乳期過程中人乳脂質(zhì)組成的變化。Shi Yudong等對內(nèi)蒙古地區(qū)不同泌乳階段人乳樣品的化學成分進行了分析。Wang Yonghua等分析了廣州地區(qū)初乳和成熟乳的脂肪酸組成。George等通過液相-離子遷移質(zhì)譜僅對產(chǎn)后3 個月的人乳進行了詳細分析,共鑒定出205 種甘油三酯(triglyceride,TAG),其中的98 種此前未在人乳中發(fā)現(xiàn)。Tu Anqi等利用超臨界流體色譜-四重飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對來自中國不同地區(qū)的過渡乳、成熟乳和國外嬰兒配方奶粉進行了比較分析。Wang Lina等將人的成熟乳與牛奶作比較,其中的215 種脂質(zhì)可作為摻假分析的潛在生物標志物;而人乳與羊奶比較得出的生物標志物共有147 種。Garcia等通過氣相色譜法測定法國母親的初乳、過渡乳、成熟乳中TAG、總磷脂和縮醛磷脂的含量以及脂肪酸組成。但是由于不同國家人乳的脂肪酸組成不同,西方人乳中脂類的特征并不能完全反映中國人乳脂類的組成和結(jié)構(gòu),所以盡快建立屬于中國的人乳脂質(zhì)組學庫十分重要。
上述研究中,數(shù)據(jù)均采用信息依賴型采集(information dependent acquisition,IDA),其應用廣泛,檢測準確,已在研究脂質(zhì)組學方面奠定了基礎(chǔ),且數(shù)據(jù)分析相對簡單。與傳統(tǒng)的IDA采集模式相比,順序窗口采集所有理論質(zhì)譜模式(sequential window acquisition of all theoretical mass spectra,SWATH)掃描均勻且掃描范圍廣,依據(jù)峰面積定量,避免了靈敏度低與重現(xiàn)性差等問題。SWATH技術(shù)作為一項全新的超高效液相色譜質(zhì)譜法的采集模式,可通過一次進樣鑒定所有的脂質(zhì)成分,具有靈敏度高和樣品定量相關(guān)性高等優(yōu)點。SWATH技術(shù)與超高效液相色譜-高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合,使其同時具有高采集命中率和獲得所有質(zhì)譜信息的特點。目前,國內(nèi)外尚未有研究使用SWATH采集模式對人乳中脂質(zhì)成分進行檢測,國外只有部分藥物脂質(zhì)代謝物或蛋白分析用到了SWATH檢測模式。本研究將超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(ultrahigh performance liquid chromatography-triple quadrupole time of flight tandem mass spectrometry,UPLC-Triple-TOF-MS/MS)與SWATH對不同泌乳階段人乳中的脂質(zhì)進行鑒定及相對定量分析,在建立中國人乳脂質(zhì)組學庫的同時為科學模擬各階段母乳及開發(fā)不同段齡嬰幼兒奶粉的研發(fā)提供參考依據(jù)。
人乳取自黑龍江省哈爾濱市第一醫(yī)院,采樣對象為哈爾濱本地人或在哈爾濱生活3 a以上的22~36 歲足月分娩且身體健康的漢族產(chǎn)婦。采樣經(jīng)產(chǎn)婦及家屬同意并簽署知情同意書。
氯仿、氯化鈉、異丙醇、乙酸銨、甲醇和乙腈 德國默克有限公司。試劑均為色譜純。
Acquity UPLCBEH C色譜柱(2.1 mmh100 mm,1.7 μm)、Acquity超高效液相色譜儀 美國Waters公司;Triple TOF5600質(zhì)譜分析儀 美國SCIEX公司;BYN200-2氮吹儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。
1.3.1 人乳采集
產(chǎn)婦定時用吸奶器采集初乳(1~5 d)、過渡乳(6~20 d)和成熟乳(21 d以后),放入-80 ℃超低溫冰箱中進行冷凍保存,在1 個月內(nèi)完成實驗。
1.3.2 人乳脂質(zhì)提取
參考改良的Folch法。取人乳1 mL放入10 mL離心管,使用0.8 mL超純水將其稀釋,向其中加入4 mL氯仿-甲醇混合溶劑(2∶1,/),混合均勻。在輸出功率150 W超聲處理10 min后,加入0.2 倍體積的質(zhì)量分數(shù)0.9%氯化鈉溶液,旋混數(shù)秒?;旌象w系在1 854h離心15 min,靜置2 min,分層后將有機相轉(zhuǎn)移至螺口玻璃管中。之后再向水相中加入4.0 mL氯仿-甲醇混合溶液(2∶1,/),重復上述操作2 次,合并有機相并將其轉(zhuǎn)移至玻璃管中。氮吹后,用1 mL氯仿-甲醇混合溶液(2∶1,/)復溶,過濾膜后等待檢測。
1.3.3 液相色譜條件
色譜柱為Acquity UPLCBEH C(2.1 mmh 100 mm,1.7 μm);進樣量5 μL;流動相A為水-甲醇-乙腈混合溶液(1∶1∶1,/)(含有2 mmol/L乙酸銨),B為異丙醇-乙腈混合溶液(1∶1,/)(含有2 mmol/L乙酸銨);流速0.35 mL/min;柱溫35 ℃;分流比50∶1。梯度洗脫時間和流動相的比例見表1。
表1 人乳脂質(zhì)分析的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for analysis of human milk lipids
1.3.4 質(zhì)譜條件
電噴霧離子源,正離子模式條件:離子源噴射電壓5 500 V;去簇電壓80 V;碰撞能量10 eV;離子源氣體1壓力60 psi;離子源氣體2壓力60 psi;簾式氣體壓力35 psi;離子源溫度550 ℃;質(zhì)量掃描范圍/50~1 700。負離子模式條件:離子源噴射電壓-4 500 V;分解電位-80 V;碰撞能量-40 eV;離子源氣體1壓力60 psi;離子源氣體2壓力60 psi;簾式氣體壓力35 psi;離子源溫度550 ℃;質(zhì)量掃描范圍為/50~1 700。
SWATH定量模式:正離子模式;間隔窗口3.8 u;從/50開始并增加到/1 700;每步的碰撞能量為35 eV,并且每次產(chǎn)物離子掃描施加15 eV的碰撞能量擴散,依次均勻掃描。
每個樣本做3 次平行。由Analyst 1.7.1軟件得到的數(shù)據(jù)經(jīng)PeakView 2.2和MasterView軟件進行一級質(zhì)譜分析,將得到的保留時間結(jié)果范圍導入LipidView 1.2軟件,并結(jié)合二級碎片分析定性脂質(zhì)類化合物。脂質(zhì)化合物的定量分析通過MultiQuant3.0.3和PeakView 2.2軟件共同處理。所得數(shù)據(jù)應用Excel、SPSS軟件進行單因素方差分析,化學結(jié)構(gòu)式采用ChemDraw Professional 16.0軟件進行繪制。
參考本課題組優(yōu)化的分析人乳中磷脂組學的方法進行實驗參數(shù)設(shè)定。靈敏度、精密度、準確度、加標回收率均在規(guī)定范圍內(nèi),可滿足對樣品測定的要求。檢出限與定量限均可表明在所選用的實驗條件下,儀器呈現(xiàn)較高的靈敏度。
不同類別的脂類化合物在二級質(zhì)譜圖中具有特殊的裂解規(guī)律,根據(jù)不同位點的化學鍵斷裂產(chǎn)生的中性丟失碎片離子或特異性二級碎片(大部分為[M+H-FA]碎片離子)推導出附著在甘油分子上的單個FAs,以鑒定脂質(zhì)組分的結(jié)構(gòu)。圖1以磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)為例,在負離子模式下,PE 38:2生成/770.724的[M-H]準分子離子,/140.007和/196.025為PE的特征離子碎片,/480.229代表失去了一個氫原子的斷裂的溶血型磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine,LPE,18:0)單鏈,/283.235和/307.228分別是斷裂的C和C脂肪酸失去一個氫原子產(chǎn)生的二級碎片。針對于PE 38:2這種物質(zhì),不同長度的?;満筒煌孽;滊p鍵數(shù)目形成了許多可能的?;溄M合。除了上述組合方式外,還有/281.218和/309.242、/279.207和/311.258,它們分別代表PE 38:2(18:1/20:1)和(18:0/20:2)。但由于其強度最高,PE 38:2主要以C和C脂肪酸組成為主。一般來說,?;滊S不同的長度(即不同的碳原子數(shù))、不同的不飽和度、潛在的支鏈等而變化。脂質(zhì)頭基和?;湹倪@些變化形成了大量的脂質(zhì)分子種類,提升了脂質(zhì)定性分析的難度。
圖1 PE 38:2在負離子模式下的二級質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectra of PE 38:2 in negative ion mode
按照以上結(jié)構(gòu)鑒定方法,結(jié)合高通量、高覆蓋度、高準確性的SWATH采集技術(shù)在正負離子下檢測到的脂質(zhì)化合物共229 種,如表2所示。除了檢測人乳中含量豐富的脂質(zhì),如GL和GP外,還一同測定了SP、ST和FAs,它們在整個泌乳階段含量較低且種類較少。由于SWATH采集技術(shù)可以高效測定極低豐度分子的特性,本研究檢測到10 種ST,如麥角甾醇(Erg)、脂質(zhì)白蛋白納米顆粒(lipid-albumin nanoparticles,LAN)、去氧孕烯(Des)等。FAs共4 種,為游離脂肪酸(free fatty acid,F(xiàn)FA)FFA 14:1~22:6之間。GP是種類最豐富的脂類,共108 種。其中PE及LPE共33 種,是整個泌乳期中磷脂種類最豐富的;其次是磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)及溶血型磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine,LPC)類脂質(zhì)共21 種;磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)及溶血型磷脂酰絲氨酸(lysophosphatidylserine,LPS)共8 種;磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)及溶血型磷脂酰甘油(lysophosphatidylglycerol,LPG)共13 種;磷脂酸(phosphatidic acid,PA)及溶血型磷脂酸(lysobisphosphatidic acids,LPA)共10 種;磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)及溶血型磷脂酰肌醇(lysophosphatidylinositol,LPI)共7 種;其他類的GP共16 種。SP共22 種,其中鞘磷脂(sphingomyelin,SM)12 種。SWATH技術(shù)將整個質(zhì)譜掃描范圍分為若干個窗口,高速、循環(huán)地對每個窗口的所有離子進行碎裂、掃描,從而無遺漏、無差異地采集全部子離子信息,擁有更高的覆蓋度。除常見物質(zhì)己糖神經(jīng)酰胺(HexCer)外,通過SWATH采集技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了硫苷脂(SGalCer)、1-磷酸神經(jīng)酰胺(CerP)、神經(jīng)酰胺磷脂酰乙醇胺(PE-Cer)、神經(jīng)酰胺磷脂酰肌醇(PICer)、長鏈堿基(LCB)等。其中SGalCer是通過硫酸基與半乳糖部分的3-羥基的酯化反應從葡萄糖神經(jīng)酰胺中衍生出來的物質(zhì),LCB則是鞘氨醇的衍生物,然而這些極低豐度的物質(zhì)在脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫中不常見,如LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫中的脂質(zhì)。人乳中的GL主要包括甘油二酯(diglyceride,DAG)和TAG,還有一些不常見的物質(zhì)如單烷基二酰甘油(monoalkyl diacylglycerol,MADAG)等。GL是整個泌乳階段中含量最多的脂質(zhì),同時由于甘油不同位點上的羥基被不同碳數(shù)、雙鍵數(shù)、雙鍵位置和構(gòu)象的脂肪酸酯化形成,導致GL共81 種,其中包括24 種DAG、28 種TAG(TAG 34:0~64:12)和其余29 種GL。雖然本研究檢測到的TAG種類并不是很多,但僅僅這28 種TAG就在成熟乳中占總脂質(zhì)化合物總含量的一半。
表2 不同泌乳期人乳中脂質(zhì)種類及其相對含量Table 2 Types and relative contents of lipids in human milk during different lactation periods
續(xù)表2
續(xù)表2
續(xù)表2
續(xù)表2
由圖2可知,初乳中5 類脂質(zhì)的相對含量分別為GL 68.44%、GP 19.13%、SP 6.15%、ST 4.02%、FAs為2.27%;過渡乳中5 類脂質(zhì)的相對含量分別為GL 69.63%、GP 18.65%、SP 6.22%、ST 3.67%、FAs為1.83%;成熟乳中5 類脂質(zhì)的相對含量分別為GL 71.04%、GP 17.55%、SP 6.54%、ST 3.52%、FAs為1.35%。其中,GP和SP中的SM屬于磷脂(phospholipid,PL)。這些PL在初乳、過渡乳、成熟乳中的相對含量分別為22.95%、21.86%、21.07%(表2),在整個泌乳階段呈下降趨勢,與Ingvordsen Lindahl、Bitman等研究發(fā)現(xiàn)一致。此外,60%的PL和85%的ST與乳脂球有關(guān),作為乳脂球膜的結(jié)構(gòu)成分存在于乳中。上述PL和ST的下降表明,隨著哺乳期的變化,脂肪球周圍的膜厚度減少,乳脂肪球的大小隨著哺乳的進行而增加。人乳中總脂質(zhì)含量隨泌乳期時間的延長而增加,并與PL呈反比關(guān)系。
圖2 初乳(A)、過渡乳(B)、成熟乳(C)中每類脂質(zhì)占總脂質(zhì)的相對含量Fig.2 Relative contents of each class of lipids in colostrum (A),transitional milk (B), and mature milk (C)
人乳中各PL的相對含量隨著泌乳期的變化也處于動態(tài)變化中,如圖3所示。文獻表明無論在初乳、過渡乳還是成熟乳中,PC、PE、SM為PL主要組成。然而在本研究中(圖3),初乳中相對含量最多的PL是PA,約占總PL的20.7%,其相對含量隨著泌乳期的延長顯著下降,并且成熟乳中的PA含量明顯低于其他PL。在整個泌乳期中,PS和PI的相對含量相對恒定,但在初乳中略高于成熟乳。有研究表明,PI所含的-6系列的花生四烯酸(arachidonic acid,ARA,20:4)僅次于PE。由圖3可知,從初乳到成熟乳SM含量顯著增加。PE和PG在過渡乳中的含量明顯低于其他乳,并在成熟乳中達到最大值。PE和SM在成熟乳中的含量相似(22.2%、22.4%),是成熟乳中最豐富的PL。雖然在本研究中PE的含量為先下降后上升,與Harzer、Bitman等研究有所區(qū)別,但在成熟乳中PE占總磷脂的含量大體相似(約為20%)。此外,PC呈先上升后下降,在過渡乳中含量最高,約占總磷脂的37.6%(圖3)。由圖3可知,PC在整個泌乳期磷脂類中所占比例最大(占總磷脂的67.30%),其次是SM(占總磷脂的53.51%)與PE(占總磷脂的52.44%)。然而,Cilla等報道PL在人乳中的相對含量在不同研究之間存在顯著差異。何揚波表明,除PC外,其他磷脂都隨泌乳期的變化穩(wěn)步升高。Sala-Vila等卻認為SM和PC占磷脂的主要部分,同時SM在整個泌乳階段含量相對恒定。Bitman和Benoit等報告,SM是人乳中含量最多的磷脂。而Wang Liwen和Ingvordsen Lindahl等觀點相同,都認為PE是整個泌乳期中最主要的磷脂。但人乳的成分是一個動態(tài)的過程,并受多種因素的影響,目前尚未確定其真正標準組成。
圖3 人乳中不同極性脂質(zhì)隨泌乳期的含量變化Fig.3 Changes in percentages of different polar lipids in human milk with lactation time
2.3.1 不同泌乳期人乳磷脂亞類相對含量分析
由表2可知,在不同泌乳期人乳的磷脂酰甘油中,各個泌乳階段中含量最多的PG均為LPG。PG在本研究中擁有最多溶血磷脂種類,共有9 種。其中,含量最多的為初乳的LPG 14:1,約占總脂質(zhì)的1.01%,與其他泌乳期人乳的LPG 14:1含量存在顯著差異。攜帶二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)的LPG 20:5也在初乳中含量較高,并隨泌乳時間的延長相對含量下降。LPG是PG中的主要成分,在整個泌乳時期占總PG含量的64%以上,尤其占成熟乳總PG含量的90%。LPE占初乳PE總含量的47%。Van Beusekom等發(fā)現(xiàn),加勒比海地區(qū)母親的成熟乳汁中PE的相對含量約為13%,LPE約占其PE含量的54%。這些溶血磷脂是指其脂肪酸鏈已從-1或-2位移除的磷脂,鑒于它們來源的不確定性,如此高比例的溶血磷脂很可能是在乳樣品冷藏過程中發(fā)生水解。由表2可知,在整個泌乳階段共測得24 種溶血磷脂(數(shù)量高于Wang Lina和Ingvordsen Lindahl等的研究結(jié)果),其中可以為嬰兒提供膽堿的LPC只有LPC 16:0,且在初乳中的相對含量最多并與其他乳存在顯著差異,約為總脂質(zhì)的0.44%,并隨泌乳期的延長,含量顯著降低。膽堿作為神經(jīng)傳遞過程中乙酰膽堿的前體對嬰兒的腦發(fā)育存在重要作用,同時還參與構(gòu)建細胞膜的結(jié)構(gòu)。PC和SM都是膽堿的重要來源,約占人乳中膽堿含量的17%。由表2可知,在整個泌乳期的PC中,LPC 16:0、PC 34:3/PC 35:1/PC-36:4、PC 35:4分別為初乳、過渡乳、成熟乳中含量最多的脂質(zhì),分別占總脂質(zhì)的0.44%、1.24%和0.68%。PC的主要脂肪酸組成依次為C、C、C、C,大多數(shù)研究表明,這4 種脂肪酸共占PC總脂肪酸的90%。然而對于最不飽和的磷脂——PE來說,如表2所示,初乳中LPE 18:2為PE中含量最多的脂質(zhì),占總脂質(zhì)的1.08%;過渡乳中PE 38:4(18:0/20:4)含量最多,占總脂質(zhì)的0.18%;成熟乳中LPE 26:0是含量最多的脂質(zhì),占總脂質(zhì)的0.98%,其次是PE 40:6(18:0/22:6),占總脂質(zhì)的0.65%;同時LPE 26:0、LPE 18:2、PE 40:6(18:0/22:6)也是整個泌乳階段含量最多的PE,如圖4所示。PE比PC、SM含有更豐富的長鏈多不飽和脂肪酸,如:二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)、EPA、ARA等,這與Ingvordsen Lindahlida等研究一致。觀察本研究的PL特性發(fā)現(xiàn)PC中有4 種脂質(zhì)分子含有長鏈多不飽和脂肪酸,PE共8 種,其他PL中僅含1 種或2 種。由表2可知,含有長鏈多不飽和脂肪酸的PE(PE 38:5(18:1/20:4)、PE 40:4(18:0/22:4)、PE 40:6(18:0/22:6或18:1/22:5)),在成熟乳中含量最高,初乳中含量最低。尤其是PE 40:4及PE 40:6在成熟乳中的含量與其初乳中含量存在顯著差異。PE作為含多不飽和脂肪酸最多、飽和脂肪酸最少的磷脂,提供了嬰兒所需的重要生物活性成分,如ARA、EPA和DHA,對新生兒的神經(jīng)和視覺發(fā)育、生長至關(guān)重要。
圖4 不同泌乳期PE組成Fig.4 Composition of PE in different lactation periods
2.3.2 不同泌乳期人乳鞘脂含量及特性分析
由表2可知,在不同泌乳期的SM中,SM 36:1; 2、SM 40:2; 2、SM 36:2; 2分別為初乳、過渡乳、成熟乳中SM含量最多的脂質(zhì),分別占總脂質(zhì)的1.09%、1.26%、0.80%。且從初乳到成熟乳,SM含量顯著增加(分別占總PL的13.92%、17.18%和22.41%)。張雪等表明,SM與GP的脂肪酸組成存在顯著差異,SM所含的飽和脂肪酸在所有磷脂中最高,多不飽和脂肪酸含量最低。由于SP含有-酰胺化的脂肪?;ǔ1攘字闹觉;L得多,這也意味著SP通常含有比GP中最常見的脂肪酰基更長的脂肪?;?;而SP具有的“雙峰”物種分布(圖5)說明其主要含有的-酰胺化C為最短脂肪酸組成,C~C為最長,很少存在-酰胺化C和C。
圖5 鞘脂的“雙峰”結(jié)構(gòu)圖Fig.5 “Bimodal” structure of sphingolipids
SM中的多不飽和脂肪酸還含有C和C。C即為人們常說的神經(jīng)酸(nervonic acid,NA)天然存在于人乳中(<2%),主要在SM中酯化,即使在含多不飽和脂肪酸最多的PE中也鮮有存在。NA是神經(jīng)元膜的重要組成部分,其在早期髓鞘形成和預防營養(yǎng)不良等問題中起著至關(guān)重要的作用,與DHA和ARA一起對新生兒的神經(jīng)發(fā)育有積極的影響。由表2可知,含有NA的SM 40:1; 2(16:0/24:1)、SM 40:2; 2(16:1/24:1)、SM 42:2; 2(18:1/24:1)在過渡乳中的相對含量遠高于其他兩個泌乳階段,尤其是SM 40:1; 2在過渡乳中的含量與其他泌乳階段均存在顯著差異。Yu Jiahu等表明,在成熟乳中NA的含量會減少25%,且個體間NA含量的差異可能主要由內(nèi)源性因素引起,受母體飲食的影響較小。
中性脂質(zhì)主要包括TAG、DAG,并以TAG作為主要脂質(zhì)。在整個泌乳階段,人乳中TAG的不同脂肪酸組成對嬰幼兒具有不同的潛在作用,這對制備用于嬰兒營養(yǎng)的合成TAG尤為重要??紤]到這些中性脂質(zhì)在人乳中隨泌乳的進行而不斷變化,可假設(shè)它們反映了嬰兒成長發(fā)育的部分需求并具有生物學重要性。此外,在選擇脂肪源以制備嬰兒配方食品時,特殊TAG、DAG的存在可能是重要的,配方食品應盡可能含有TAG“標記”,并且其平均濃度應與不同階段人乳中發(fā)現(xiàn)的濃度相似。本研究并未對TAG中脂肪酸酯化位置進行探尋,故下列組成并不表明脂肪酸在甘油分子中的位置。
如圖6所示,在整個泌乳階段,只有初乳時DAG的總量略高于TAG。過渡乳和成熟乳中,TAG的急劇增加導致TAG分別占總物質(zhì)的40.63%和49.32%,使TAG成為人乳中的主要脂質(zhì)組分。由表2可知,在DAG中,DAG 34:3為初乳中含量最多的脂質(zhì),由兩種脂肪酸組成(16:0/18:3或16:1/18:2),占總脂質(zhì)1.91%;DAG 34:0(16:0/18:0)為過渡乳中含量最多的脂質(zhì),占總脂質(zhì)的1.24%;DAG 36:1(18:0/18:1)為成熟乳中含量最多的脂質(zhì)。然而,Wang Lina等表明DAG(18:2/18:2)、DAG(18:1/18:1)、DAG(14:0/14:0)、DAG(18:1/12:0)是人乳樣品中最常見的DAG種類。由圖7和表2可知,初乳中TAG 34:0為TAG中含量最多的脂質(zhì),占總脂質(zhì)的1.42%;在過渡乳中,相對含量超過2%的TAG共有5 種,以TAG 38:0含量最多(占總脂質(zhì)的7.42%),其次是TAG 40:2(10:0/12:0/18:2)(占總脂質(zhì)的6.07%);在成熟乳中,雖然TAG 38:0和TAG 34:0是TAG中含量最多的兩種脂質(zhì),共占總脂質(zhì)的14.45%,但其余含量較多(>2%)的TAG均由不飽和脂肪酸組成(以TAG 52:4(16:0/18:2/18:2)為首),共占總脂質(zhì)的18.97%。在3 個泌乳階段中,雖然仍是含有飽和脂肪酸的TAG相對含量較高,但隨著泌乳期的延長,含不飽和脂肪酸的TAG相對含量激增,并在成熟乳中共占總脂質(zhì)的31.61%,約為成熟乳中飽和脂肪酸組成的TAG含量總和的1.78 倍。TAG中亞麻酸和亞油酸等長鏈多不飽和脂肪酸含量的升高,可能是由于生長中嬰兒對于多不飽和脂肪酸的需求增加,亞麻酸和亞油酸作為DHA、ARA的前體物質(zhì)也需要更多的儲備。
圖6 人乳中不同脂質(zhì)亞類隨泌乳期的含量變化Fig.6 Changes in percentages of different lipid subclasses in human milk with lactation time
圖7 不同泌乳期的人乳TAG組成Fig.7 Composition of TAG in human milk at different lactation periods
Liu Zhiqian等從牛乳、人乳和不同品牌的嬰兒配方奶粉中共檢測出56 種含DHA的TAG,嬰兒配方奶粉含有56 種中的大部分。本研究只發(fā)現(xiàn)了4 種含有DHA的TAG,分別為TAG 54:8(14:0/18:2/22:6)、TAG 56:11(14:0/20:5/22:6)、TAG 64:8(18:2/24:0/22:6)、TAG 64:12(20:0/22:6/22:6),它們一般是中等或低豐度的。其中,TAG 64:12含有2 個DHA殘基,這種含有2 種或2 種以上DHA分子的TAG主要存在于嬰兒配方奶粉中,很少存在于人乳。對這4 種TAG進行統(tǒng)計學分析(圖6及表2),發(fā)現(xiàn)TAG 54:8在3 個泌乳階段均存在顯著差異,其相對含量從初乳到成熟乳逐步增加(分別為0.22%、1.25%和2.63%);TAG 64:8在過渡乳中與其他兩個泌乳階段存在顯著差異,其中在過渡乳中的相對含量分別是在初乳和成熟乳中的9.3 倍和3.7 倍;TAG 56:11和TAG 64:12的含量隨泌乳期而增長,但其增長幅度小于其他TAG。嬰幼兒依賴于母體循環(huán)中預先形成的DHA供應(無論是來自母體飲食、組織儲備還是-亞麻酸的合成)以及自身亞麻酸的合成。從妊娠的最后3 個月到兩歲,嬰兒大腦每天對DHA和ARA的需要量約為3 mg。由于嬰兒必需脂肪酸去飽和鏈延長的能力有限,自身轉(zhuǎn)化率約為1%,合成速率明顯不足。妊娠晚期補充DHA(200 mg/d)可防止母體DHA水平的下降。這可能是由于在成熟乳中,母親在孕期補充的營養(yǎng)物質(zhì)及組織儲備已基本消耗完畢,因此與其他短鏈脂肪酸相比,富含DHA殘基的長鏈多不飽和的TAG相對含量逐漸下降。Garcia等對實驗數(shù)據(jù)進行估量計算后表明,僅有15%和44%的人乳樣本可以滿足早產(chǎn)兒和足月兒對DHA的要求。
ST中的膽固醇作為乳脂球膜的一種,隨著泌乳的進行呈下降趨勢(圖2)。與Bitman等的結(jié)論相似,在初乳中的膽固醇含量最高,并在過渡乳和成熟乳中逐漸降至較低水平。由表2可知,初乳中的CE 16:1和CE 22:1含量較高,分別占總脂質(zhì)的1.90%和1.59%,與其他泌乳階段的含量存在顯著差異;CE 2:0和CE 14:1分別是過渡乳和成熟乳中含量最多的膽固醇。膽固醇不僅對神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元發(fā)育很重要,還與激素和VD的合成有關(guān)。同時有研究表明,母親的飲食對人乳中的膽固醇并沒有顯著影響,且經(jīng)母乳喂養(yǎng)的嬰兒血漿中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的濃度高于經(jīng)嬰幼兒配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒血漿。與配方奶粉喂養(yǎng)相比,母乳喂養(yǎng)與生命后期較低的血液總膽固醇濃度有關(guān)(成年后血液膽固醇降低0.15 mmol/L),可使心血管疾病的人群患病率降低5%。盡管圍繞點估計值的置信限和觀察到的研究間異質(zhì)性并不排除母乳喂養(yǎng)對心血管的潛在有益或不利影響,但對現(xiàn)有數(shù)據(jù)的薈萃分析也不能得出關(guān)于母乳喂養(yǎng)和成人心血管疾病全因死亡率之間關(guān)系的明確結(jié)論。如表2所示,不同泌乳期的FAs中,F(xiàn)FA 20:0為初乳和過渡乳中含量最多的脂質(zhì),分別占總脂質(zhì)的1.89%和0.42%;FFA 22:4為成熟乳中含量最多的脂質(zhì),占總脂質(zhì)的0.64%。初乳中的總FAs含量最高。
采用具有更高的質(zhì)量精確度和靈敏度檢測技術(shù),詳細分析人乳中脂質(zhì)的分子種類、脂肪酸?;M成、相對含量的差異。利用UPLC-Triple-TOF-MS/MS結(jié)合SWATH采集技術(shù)并使用定義的窗口來同時獲取所有前體離子以獲得更寬的動態(tài)范圍。根據(jù)/和二級質(zhì)譜圖,共鑒定出229 種脂質(zhì)化合物,其中PE 33 種、PC 21 種、PS 8 種、PG 13 種、PA 10 種、PI 7 種;SP共22 種;DAG 24 種,TAG 28 種;ST共10 種;FAs共4 種;以及眾多不在常見脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的脂質(zhì)。然而,本研究并未對TAG中脂肪酸酯化位置進行探尋,也未詳細的對人乳中的糖脂等進行分析,后續(xù)實驗仍需要從TAG位置,從更精密、更有效的微量成分、生物活性物質(zhì)入手,進一步分析人乳脂質(zhì)成分,著力生產(chǎn)出盡可能與母乳100%相接近并滿足嬰兒不同階段生長的需求的嬰兒配方奶粉。