雙對(duì)苯醌的抗氧化活性分析及其固體發(fā)酵條件優(yōu)化

胡彥麗，潘利利，閆淑珍，陳雙林*

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

天然的抗氧化活性物質(zhì)主要包括黃酮類、多酚類、維生素類和多糖等，真菌產(chǎn)生的抗氧化活性物質(zhì)則主要有醌類、酚類、多糖類、三萜類、對(duì)聯(lián)三苯類等。苯醌是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的醌類化合物，廣泛存在于生物體內(nèi)，主要包括對(duì)苯醌和鄰苯醌兩大類，而天然存在的苯醌化合物多為對(duì)苯醌及其衍生物。苯醌由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，可以參與生物系統(tǒng)中電子和質(zhì)子的轉(zhuǎn)移過(guò)程，具有作為抗氧化劑的潛力。覃陸慧等在探討楊桃根苯醌（benzoquinone ofL.root，BACR）對(duì)治療糖尿病小鼠的效果及相關(guān)機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，給予BACR后，糖尿病小鼠肝臟的丙二醛含量明顯下降，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量明顯升高，表明BACR能有效減輕氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷。Okamoto等在研究一種苯醌類化合物6-(10-羥基癸基)-2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌時(shí)指出，它能抑制大鼠肝和大腦微粒體中由亞鐵離子引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化。此外，輔酶Q作為一種常見(jiàn)的苯醌類抗氧化劑，可通過(guò)直接清除自由基使膜磷脂和膜蛋白免受過(guò)氧化。Xu Qiao等最先從瓶生頂孢霉（）CA022菌株固體發(fā)酵中提取分離和鑒定出雙對(duì)苯醌（2,7-dihydroxy-3,6,9-trimethyl-9-xanthene-1,4,5,8-tetraone，DTXT）（圖1），這是一種新的苯醌化合物，因而，其生物活性尚未被研究和揭示，并且前期發(fā)酵研究獲得的DTXT產(chǎn)量也比較低，都將限制其未來(lái)可能的應(yīng)用。本研究借鑒已知苯醌類化合物具有抗氧化活性的線索，首先探索瓶生頂孢霉CA022菌株固體發(fā)酵所產(chǎn)生的DTXT的抗氧化活性。在證明DTXT具有良好抗氧化活性的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化固體發(fā)酵條件提高其產(chǎn)量。

圖1 DTXT結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of DTXT

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株為瓶生頂孢霉CA022（CGMCC No10816），由本實(shí)驗(yàn)室分離于采自浙江安吉的竹黃（）子實(shí)體。

初始液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、硝酸鈉3 g、KHPO1 g、MgSOg7HO 0.5 g，加無(wú)菌蒸餾水定容至1 000 mL。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：100 g大米，裝入17 cmh35 cmh5 cm的食用菌栽培袋中，加水淹沒(méi)浸泡12 h后瀝干水分，扎帶封口。121 ℃滅菌20 min，24 h后進(jìn)行第2次滅菌。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；甲醇（色譜級(jí)） 美國(guó)天地有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2多孔酶標(biāo)儀 美國(guó)分子儀器（上海）有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；1220高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Agilent公司；X-30R離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)和固體發(fā)酵

在無(wú)菌環(huán)境下，挑取瓶生頂孢霉CA022菌株的少許菌絲于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)皿中加入約10 mL無(wú)菌水，進(jìn)行孢子的沖洗并稀釋至10，用涂布棒涂布于PDA平板上，將其置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。待PDA平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至新的PDA平板，培養(yǎng)3 d后，挑取顏色較深的單個(gè)菌株作為固體發(fā)酵的出發(fā)菌株，并用無(wú)菌水制成1h10個(gè)/mL的孢子懸液。向每個(gè)液體種子培養(yǎng)基（50 mL）中接入1 mL孢子懸液，28 ℃、130 r/min培養(yǎng)5 d，然后將種子液接于裝有100 g固體發(fā)酵培養(yǎng)基的食用菌袋，混勻鋪平，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。每天觀察并混動(dòng)發(fā)酵料，防止發(fā)酵料板結(jié)影響DTXT產(chǎn)量。

1.3.2 DTXT的提取和純化

參照陳雙林等的方法進(jìn)行提取和純化，將獲得含目標(biāo)產(chǎn)物的晶體通過(guò)HPLC檢測(cè)，并將得到的檢測(cè)圖譜與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進(jìn)行比較，以判斷是否為DTXT及其純度。將所得純度為95%以上的DTXT樣品用于體外抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 還原力（總抗氧化活性）的測(cè)定

參照王炬等的方法并作改進(jìn)?？寡趸镔|(zhì)會(huì)使反應(yīng)體系中的Fe還原成Fe，在700 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化反映出還原能力的高低，吸光度越高說(shuō)明還原能力越強(qiáng)。稱取適量的DTXT樣品用無(wú)水乙醇制成20、40、60、80、100、150 μg/mL和200 μg/mL溶液。分別取1 mL上述待測(cè)溶液，依次加入1 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴反應(yīng)20 min，迅速冷卻后，再加入1 mL 10%三氯乙酸溶液混勻，3 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL，加去離子水2.5 mL和0.1% FeCl溶液0.5 mL，搖勻后常溫反應(yīng)10 min，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以VC、VE、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxy toluene，BHT）和蘆丁為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.4 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

參照Dong Weixue等的方法并作改進(jìn)。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的DTXT乙醇溶液（同1.3.3節(jié)），各加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液4.5 mL和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，25 ℃水浴反應(yīng)5 min，迅速加入1 mL 8 mmol/L HCl溶液終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)299 nm處測(cè)定樣品溶液的吸光度。對(duì)照同1.3.3節(jié)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算如式（1）所示：

式中：為樣品溶液＋Tris-HCl緩沖液＋鄰苯三酚溶液＋HCl溶液；為樣品溶液＋Tris-HCl緩沖液＋無(wú)水乙醇＋HCl溶液；為無(wú)水乙醇＋Tris-HCl緩沖液＋鄰苯三酚溶液＋HCl溶液。

1.3.5 羥自由基清除率的測(cè)定

參照李曉英等的方法并作改進(jìn)。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的DTXT乙醇溶液（質(zhì)量濃度同1.3.3節(jié)），依次加入1 mL 10 mmol/L FeSO溶液和1 mL 10 mmol/L水楊酸溶液，混勻后加入1 mL 8.8 mmol/L HO溶液，37 ℃水浴反應(yīng)30 min后終止反應(yīng)，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照同1.3.3節(jié)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。羥自由基清除率計(jì)算如式（2）所示：

式中：為樣品溶液＋FeSO溶液＋水楊酸溶液＋HO溶液；為樣品溶液＋FeSO溶液＋水楊酸溶液＋無(wú)水乙醇；為無(wú)水乙醇＋FeSO溶液＋水楊酸溶液＋HO溶液。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照Song Zhu等的方法并作改進(jìn)。分別取2 mL不同質(zhì)量濃度DTXT乙醇溶液（同1.3.3節(jié)），各加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混勻后避光靜置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照同1.3.3節(jié)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。DPPH自由基清除率計(jì)算如式（3）所示：

式中：為樣品溶液＋DPPH溶液；為樣品溶液＋無(wú)水乙醇；為無(wú)水乙醇＋DPPH溶液。

1.3.7 DTXT產(chǎn)量的測(cè)定和產(chǎn)率曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用甲醇配制62.5、125、250、375 μg/mL和500 μg/mL的DTXT溶液。采用HPLC檢測(cè)法（波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL），以樣品的峰面積（mAugs）和質(zhì)量濃度（μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得到DTXT的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：=14.855＋612.80（=0.998 3）。

產(chǎn)量測(cè)定：發(fā)酵完成后，取出發(fā)酵料置于55 ℃烘箱烘干，100 目粉碎過(guò)篩，每袋取5 g。用乙酸乙酯浸提直至無(wú)色，合并浸提液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)有機(jī)溶劑至旋干，加入5 mL色譜甲醇，經(jīng)超聲充分振蕩后，用有機(jī)濾膜過(guò)濾，經(jīng)HPLC分析檢測(cè)DTXT的吸收峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出DTXT產(chǎn)量。

產(chǎn)率曲線的建立：分別于固體發(fā)酵的7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 d和18 d進(jìn)行取樣測(cè)定DTXT產(chǎn)量，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.8 單因素試驗(yàn)

基于1.3.1節(jié)固體發(fā)酵的方法與步驟，保持其他條件不變，將初始液態(tài)種子培養(yǎng)基中的葡萄糖分別替換為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉，質(zhì)量濃度設(shè)置為10、15、20、25、30 g/L，搖床培養(yǎng)結(jié)束后將50 mL種子液加入100 g大米培養(yǎng)基中，使其碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、0.75%、1.0%、1.25%和1.5%（以大米質(zhì)量計(jì)，下同）；供試氮源為硝酸鈉、硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨、尿素和蛋白胨，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.125%、0.15%、0.175%和0.2%；供試微量元素為MgSOg7HO、ZnSOg7HO、FeSOg7HO、MnSOg7HO和HBO，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.015%、0.020%、0.025%、0.030%和0.035%；供試維生素為VB、VB、VB、VB、VB和VB，含量分別為5、25、50、75 μg/100 g和100 μg/100 g。以上每個(gè)處理均重復(fù)3 次。其中維生素在配制成1 mg/mL的母液后，用無(wú)菌的0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，待培養(yǎng)基滅菌冷卻后按需加入。

1.3.9 響應(yīng)面試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以篩選出的最佳碳源、氮源、微量元素和維生素為自變量，DTXT產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Design-Expert 12.0的中心組合設(shè)計(jì)法，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for response surface methodology

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DTXT的提取和純化

將獲得含目標(biāo)產(chǎn)物的晶體通過(guò)HPLC檢測(cè)，得到檢測(cè)圖譜（圖2）。在相同的檢測(cè)條件下，待測(cè)樣品中主要物質(zhì)的出峰時(shí)間為6.538 min（圖2A），與本實(shí)驗(yàn)室保存的純化對(duì)照品出峰時(shí)間6.556 min（圖2B）基本一致，并且待測(cè)樣品的純度達(dá)到98%，純度較高，可以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

圖2 待測(cè)物（A）和對(duì)照品（B）的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of unknown (A) and control (B) samples

2.2 DTXT體外抗氧化活性

2.2.1 DTXT還原力

還原力反映了抗氧化物質(zhì)的總抗氧化能力。DTXT還原力隨著質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)（表2），當(dāng)DTXT質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，吸光度為0.608f0.002。在150～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DTXT吸光度較大，與蘆丁相當(dāng)，差異不顯著。在20～200 μg/mL范圍內(nèi)，DTXT還原力均顯著低于相同質(zhì)量濃度下的VC，但顯著高于相同質(zhì)量濃度的VE和BHT。結(jié)果表明DTXT具有良好的總抗氧化能力。

表2 DTXT的還原力Table 2 Reducing power of DTXT

2.2.2 DTXT對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

不同質(zhì)量濃度的DTXT均能清除超氧陰離子自由基，在20～200 μg/mL范圍內(nèi)，清除能力隨著DTXT質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)（表3），IC為112.70 μg/mL。在200 μg/mL質(zhì)量濃度下，DTXT對(duì)超氧陰離子自由基清除率達(dá)到（67.00f5.05）%。在150 μg/mL和200 μg/mL質(zhì)量濃度下，DTXT對(duì)超氧陰離子自由基清除率顯著高于BHT。在20～200 μg/mL范圍內(nèi)，DTXT清除超氧陰離子自由基的能力與VE大體相當(dāng)，但低于相同質(zhì)量濃度的VC和蘆丁，且差異顯著。

表3 DTXT對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Table 3 Percentage scavenging of O2-· by DTXT %

2.2.3 DTXT對(duì)羥自由基的清除作用

DTXT對(duì)羥自由基具有良好的清除作用，清除能力隨著DTXT質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)（表4），IC為78.63 μg/mL。在200 μg/mL時(shí)，DTXT對(duì)羥自由基清除率為（78.83f3.19）%。在20～200 μg/mL范圍內(nèi)，DTXT對(duì)羥自由基清除率均顯著高于相同質(zhì)量濃度的VE和BHT，但低于相同質(zhì)量濃度的VC。在高質(zhì)量濃度（150～200 μg/mL）時(shí)，與蘆丁的清除作用差異不顯著。

表4 DTXT對(duì)羥自由基的清除率Table 4 Percentage scavenging of ·OH by DTXT %

2.2.4 DTXT對(duì)DPPH自由基的清除作用

DTXT對(duì)DPPH自由基也具有良好的清除作用（表5），清除能力隨著DTXT質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)，IC為88.36 μg/mL。在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到（76.53f3.08）%。在較高質(zhì)量濃度（150 μg/mL和200 μg/mL）下，DTXT對(duì)DPPH自由基清除率顯著高于相同質(zhì)量濃度的BHT和VE，低于相同濃度的蘆丁，但無(wú)顯著差異。在20～200 μg/mL范圍內(nèi)，DTXT對(duì)DPPH自由基清除率均顯著低于相同質(zhì)量濃度的VC。

表5 DTXT對(duì)DPPH自由基的清除率Table 5 Percentage scavenging of DPPH free radical by DTXT%

2.3 DTXT的固體發(fā)酵

2.3.1 DTXT產(chǎn)量曲線

DTXT產(chǎn)量隨著供試菌株瓶生頂孢霉CA022固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加（圖3），在固體發(fā)酵14 d達(dá)到最大（2 815.89 mg/kg），之后，產(chǎn)量逐步下降，因此將DTXT的固體發(fā)酵時(shí)間確定為14 d。

圖3 DTXT產(chǎn)量與發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系Fig.3 Relationship between fermentation time and DTXT production

2.3.2 碳源對(duì)固體發(fā)酵產(chǎn)DTXT產(chǎn)量的影響

向瓶生頂孢霉CA022菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加6 種供試碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖和可溶性淀粉），圖4結(jié)果表明，它們均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT產(chǎn)量。隨著碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，DTXT產(chǎn)量在較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)下都在逐漸增加，在較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下則逐漸下降。DTXT產(chǎn)量達(dá)到最高時(shí)的各碳源處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到2 864.83 mg/kg；蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到1 564.15 mg/kg；麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到 2 693.61 mg/kg；果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到2 024.51 mg/kg；乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到2 210.11 mg/kg；可溶性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到2 349.49 mg/kg。相比于另外5 種碳源，葡萄糖在較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，DTXT產(chǎn)量就達(dá)到最高，且高于其他5 種碳源處理的最高產(chǎn)量。

圖4 不同碳源對(duì)固體發(fā)酵DTXT產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on DTXT production

2.3.3 氮源對(duì)固體發(fā)酵產(chǎn)DTXT產(chǎn)量的影響

向瓶生頂孢霉CA022菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加6 種供試氮源（硝酸鈉、硝酸鉀、氯化銨、硫酸銨、尿素和蛋白胨），圖5結(jié)果表明，它們均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT產(chǎn)量。隨著氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，DTXT產(chǎn)量在較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)下都在逐漸增加，在較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下則逐漸下降。DTXT產(chǎn)量達(dá)到最高時(shí)的各氮源處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，硝酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.175%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到2 837.97 mg/kg；硝酸鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.175%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到2 444.31 mg/kg；氯化銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.175%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到992.47 mg/kg；硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到864.27 mg/kg；尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到700.06 mg/kg；蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.175%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到643.24 mg/kg。相比于另外5 種氮源，添加0.175%硝酸鈉時(shí)，DTXT產(chǎn)量最高，且顯著高于其他5 種氮源處理的最高產(chǎn)量（＜0.05）。

圖5 不同氮源對(duì)固體發(fā)酵DTXT產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on DTXT production

2.3.4 微量元素對(duì)固體發(fā)酵產(chǎn)DTXT產(chǎn)量的影響

向瓶生頂孢霉CA022菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加5 種微量元素（MgSOg7HO、ZnSOg7HO、FeSOg7HO、MnSOg7HO和HBO），圖6結(jié)果表明，它們均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT產(chǎn)量。隨著微量元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，DTXT產(chǎn)量在較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)下都在逐漸增加，在較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)下則逐漸下降。DTXT達(dá)到最高時(shí)的各微量元素處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，MgSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到2 558.55 mg/kg；ZnSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到1 452.88 mg/kg；FeSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到572.50 mg/kg；MnSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到727.36 mg/kg；HBO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%時(shí)，DTXT產(chǎn)量達(dá)到2 831.37 mg/kg。相比于另外5 種微量元素，HBO效果最佳，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%時(shí)，DTXT產(chǎn)量最高，且顯著高于其他4 種供試微量元素處理的最高產(chǎn)量（＜0.05）。

圖6 不同微量元素對(duì)固體發(fā)酵DTXT產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different microelements on DTXT production

2.3.5 維生素對(duì)固體發(fā)酵產(chǎn)DTXT產(chǎn)量的影響

向瓶生頂孢霉CA022菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加6 種B族維生素üü硫胺素（VB）、核黃素（VB）、煙酸（VB）、吡哆素（VB）、生物素（VB）和鈷胺素（VB），結(jié)果表明（圖7），與不添加任何維生素的處理相比，它們?cè)谝欢ǔ潭壬暇商岣吖腆w發(fā)酵DTXT產(chǎn)量，但差異不顯著。其中VB的效果最好，含量為75 μg/100 g時(shí)，DTXT產(chǎn)量最高，達(dá)到4 254.90 mg/kg。

圖7 維生素對(duì)DTXT產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of different vitamins on DTXT production

2.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇葡萄糖、硝酸鈉、HBO和VB作為瓶生頂孢霉CA022菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)DTXT的組合處理，利用Design-Expert 12.0進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共30 組，所得結(jié)果如表6所示。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 6 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)所獲DTXT產(chǎn)量數(shù)據(jù)（）進(jìn)行多元回歸擬合，得到下面的二階多項(xiàng)式回歸方程：

由回歸模型方差分析（表7）可以看出，響應(yīng)模型的＜0.000 1，=75.65，失擬項(xiàng)=0.228 6＞0.05不顯著，表明該模型擬合度較高。此外，模型的相關(guān)系數(shù)為0.986 0，說(shuō)明該模型可以解釋98.60%的響應(yīng)值變化，只有很小的變量（1.40%）沒(méi)有得到合理的解釋，表明預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的一致性較好。以上結(jié)果表明該模型的擬合度良好，可用于瓶生頂孢霉CA022菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)DTXT產(chǎn)量的預(yù)測(cè)。回歸模型的方差分析可以判斷自變量對(duì)因變量的影響程度。由表7可見(jiàn)，一次項(xiàng)、、對(duì)響應(yīng)值的影響較大，達(dá)到極顯著水平（＜0.01），而影響則不顯著（＞0.05）。二次項(xiàng)、、達(dá)到極顯著水平（＜0.01），影響則不顯著（＞0.05）。模型中的交互項(xiàng)、、達(dá)到顯著水平（＜0.05），而、、影響則不顯著（＞0.05）。比較4 個(gè)因素的值大小可知，影響DTXT產(chǎn)量的因素依次為：葡萄糖＞硝酸鈉＞HBO＞VB。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance of quadratic polynomial model

根據(jù)三維響應(yīng)面可以看出各變量之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線是響應(yīng)面在水平方向的投影，等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，呈圓形表示兩因素交互作用不顯著。由圖8可以看出，各因素交互作用大小依次為：葡萄糖與HBO＞硝酸鈉與VB＞葡萄糖與硝酸鈉＞硝酸鈉與HBO＞葡萄糖與VB＞HBO與VB，與表7回歸分析結(jié)果相符。

圖8 各因素交互作用對(duì)DTXT產(chǎn)量的影響Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on DTXT production

通過(guò)Design-Expert 12.0軟件，預(yù)測(cè)得到瓶生頂孢霉CA022菌株發(fā)酵產(chǎn)DTXT的最優(yōu)組合為葡萄糖0.773%、硝酸鈉0.185%、HBO0.032%、VB100 μg/100 g，預(yù)測(cè)得到的DTXT最大產(chǎn)量為4 016.24 mg/kg。在模型預(yù)測(cè)最優(yōu)組合條件下進(jìn)行發(fā)酵，實(shí)際得到的DTXT產(chǎn)量為4 150.80 mg/kg。實(shí)驗(yàn)值與理論值在合理的誤差范圍內(nèi)，證明該優(yōu)化方案可行，可用于DTXT的生產(chǎn)。

3 討 論

為了評(píng)價(jià)藥物或天然化合物能否在體內(nèi)作為抗氧化劑，通常先在體外進(jìn)行研究。本研究采用體外抗氧化法考察DTXT的抗氧化活性，結(jié)果表明DTXT具有良好的還原能力和清除自由基的能力，其中對(duì)于羥自由基和DPPH自由基清除率分別達(dá)到78.83%和76.53%。文獻(xiàn)中也有關(guān)于苯醌化合物體外抗氧化活性的報(bào)道，如Joshi在研究天然苯醌Embin的抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)于DPPH自由基清除率達(dá)到50%以上，對(duì)羥自由基清除率達(dá)到79%；Deniz等在研究1,4-苯醌取代物時(shí)發(fā)現(xiàn)2,5-二氨基-1,4-苯醌對(duì)羥自由基清除率達(dá)到76.70%；Liu Kun等對(duì)提取自蘑菇的3 種苯醌化合物的抗氧化活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)3 種化合物均對(duì)DPPH自由基的清除效果不佳（＜50%），但其中化合物2-苯基-3-甲氧基-[1-2-苯并吡喃][4,3-]對(duì)苯醌對(duì)羥自由基清除率達(dá)到80%以上。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)楸锦陨斫Y(jié)構(gòu)的差異，如取代基的不同，導(dǎo)致其對(duì)不同自由基的清除率不同。本研究有助于了解苯醌類化合物的抗氧化活性，但關(guān)于DTXT的抗氧化活性機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到瓶生頂孢霉CA022菌株固體發(fā)酵產(chǎn)DTXT的最佳碳源、氮源、微量元素和維生素分別是葡萄糖、硝酸鈉、HBO和VB。文獻(xiàn)中也有關(guān)于天然苯醌生產(chǎn)條件的報(bào)道，如幸峰等研究熱帶假絲酵母（）產(chǎn)苯醌的最佳碳源和氮源分別是葡萄糖和蛋白胨，茍學(xué)磊等指出角毛殼菌（）發(fā)酵產(chǎn)苯醌類色素的最佳碳源、氮源和微量元素分別是蔗糖、蛋白粉和NaCl，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同，這說(shuō)明不同真菌產(chǎn)苯醌所需要的營(yíng)養(yǎng)條件不同。某些微量元素或生長(zhǎng)因子也能影響苯醌的產(chǎn)生，如Zheng Ziyi等發(fā)現(xiàn)CaCl和VB能促進(jìn)對(duì)麥胚發(fā)酵產(chǎn)甲氧基對(duì)苯醌和2,6-二甲氧基對(duì)苯醌。影響真菌次級(jí)代謝的因素有很多，這些因素之間不是孤立的，而是相互聯(lián)系的，只有選擇較佳的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其配比，微生物才能生長(zhǎng)良好。

4 結(jié) 論

通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)考察了DTXT的抗氧化活性，通過(guò)優(yōu)化瓶生頂孢霉CA022菌株的培養(yǎng)基配方，提高了DTXT產(chǎn)量。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DTXT還原能力以及對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力與蘆丁大體相當(dāng)，具有作為抗氧化劑的潛力。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后的DTXT產(chǎn)量（4 150.80 mg/kg）是優(yōu)化前（2 864.83 mg/kg）的1.45 倍，為DTXT固體發(fā)酵的研發(fā)提供了理論依據(jù)。