高通量測序技術(shù)分析西藏不同海拔地區(qū)曲拉微生物多樣性

薛 蓓，盧灝澤,，楊 帆,，張洋銘，羅 章，張鳳杰，薛 潔,*

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

曲拉，藏語意為干奶渣，是西藏地區(qū)牧民家庭自制的一種奶酪制品，其營養(yǎng)豐富，便于貯藏，具有獨(dú)特的口感與特殊的風(fēng)味。曲拉帶有濃重的地域特色，已逐漸成為青藏高原上的特色農(nóng)產(chǎn)品。曲拉的制作工藝基本如下：將牦牛乳煮沸脫脂后，接種酸乳清，在自然條件下發(fā)酵，排出乳清后自然風(fēng)干而成。在自然發(fā)酵條件下，由于生產(chǎn)環(huán)境的差異，會(huì)造成成品曲拉中微生物菌群組成的差異。導(dǎo)致成品曲拉品質(zhì)不穩(wěn)定，安全性也不能保證。

張蓓利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，對不同制作階段的曲拉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)酵母菌和乳酸菌是整個(gè)發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物。卿蔓君等將曲拉中的微生物進(jìn)行分離純化，優(yōu)勢菌屬為畢赤酵母屬（）、克魯維酵母屬（）。文鵬程等從牦牛曲拉中分離出性能較好、不同菌屬的乳酸菌。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、部分微生物難以培養(yǎng)、操作復(fù)雜易出錯(cuò)等缺點(diǎn)，不能完整地表現(xiàn)出曲拉中微生物的多樣性。已有研究對采自中國不同地區(qū)的多個(gè)傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品的分析結(jié)果表明，不同樣品中的微生物多樣性與地理環(huán)境密切相關(guān)，不同地區(qū)的發(fā)酵乳制品中微生物群落結(jié)構(gòu)不同，且存在明顯的差異。

曲拉自然發(fā)酵的生產(chǎn)過程決定了其風(fēng)味與微生物組成有很大關(guān)系，由于不同地域的微生物組成不同，可能對曲拉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味造成影響。研究曲拉微生物多樣性，對探明其群落結(jié)構(gòu)以清晰了解不同微生物在曲拉中的分布情況、鑒別有無致病菌保證曲拉安全性有重要意義。此外，可以發(fā)掘曲拉中的高原特色微生物，對優(yōu)良菌種進(jìn)行開發(fā)利用，豐富菌種資源。本研究利用高通量測序技術(shù)，分析西藏不同海拔地區(qū)曲拉中微生物的群落結(jié)構(gòu)，以期探明不同海拔地區(qū)曲拉中微生物差異情況，并為曲拉中微生物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集自西藏不同海拔地區(qū)的40 份牦牛曲拉（牦牛品種為西藏高山牦牛，年齡在5～6 歲，該品種在西藏?cái)?shù)量多，分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)，是西藏牦牛的重要代表），采于2021年3月，樣品信息見表1。

表1 樣品名稱及分組信息Table 1 Coding and grouping of Qula samples from different altitudes

E.Z.N.A.Soil DNA試劑盒 美國Omega BioTek公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）所用試劑 大連寶生生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司；臺式離心機(jī)湖南恒諾儀器公司；電泳儀 北京六一儀器廠；高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集與分組

按照表1所示采樣地點(diǎn)，采集曲拉樣品，將樣品放置于無菌采樣袋中，冰袋低溫下保存，盡快送回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)樣品采樣地點(diǎn)海拔高度，將所有樣品分為3 組：低海拔組當(dāng)?shù)睾０胃叨葹? 000 m以下；中海拔組當(dāng)?shù)睾０胃叨仍? 000～4 000 m；高海拔組當(dāng)?shù)睾０胃叨葹? 000 m以上。

1.3.2 DNA提取

樣品的總DNA提取利用試劑盒，按照試劑盒內(nèi)的使用說明進(jìn)行具體操作。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

PCR體系：10hPCR buffer（Mgplus）2.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，DNA模板1.0 μL，rDNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，ddHO 17.2 μL。

細(xì)菌V3-V4區(qū)域的通用引物為338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）、806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

真菌ITS區(qū)域的通用引物為ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）、ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 高通量測序

將PCR產(chǎn)物送至美吉生物公司，后續(xù)的文庫構(gòu)建與上機(jī)測序由該公司的Illumina MiSeq PE300測序平臺進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic軟件對原始序列進(jìn)行質(zhì)控與過濾，舍去質(zhì)量較低的序列，用FLASH軟件對原始序列進(jìn)行拼接，使用UCHIME軟件剔除嵌合體。使用UPARSE軟件，根據(jù)97%相似性對序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類。將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格，在美吉生物云平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)多樣性指數(shù)，分析不同組樣品的多樣性。根據(jù)OTU數(shù)量的Venn圖，分析不同組樣品含有的OTU數(shù)量，根據(jù)樣品在屬水平下的物種相對豐度圖，分析不同組樣品的優(yōu)勢微生物與群落結(jié)構(gòu)，根據(jù)主成分分析（principal component analysis，PCA）與非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）層級聚類分析不同組樣品間差異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同曲拉樣品中微生物α多樣性分析

多樣性可反映出不同樣品間物種多樣性與豐富度的差別，本研究對3 組曲拉樣品中微生物的多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果如表2、圖1所示。可得低海拔組與中海拔組、高海拔組樣品的細(xì)菌多樣性指數(shù)與豐富度指數(shù)都存在顯著差異（＜0.05），中海拔組與高海拔組差異不顯著。隨著海拔高度的上升，曲拉樣品中細(xì)菌的多樣性指數(shù)與豐富度指數(shù)都呈下降趨勢。造成該現(xiàn)象的原因可能是隨著海拔高度的上升，溫度逐漸降低、降水逐漸減少、大氣壓降低。這些環(huán)境因素的改變對微生物會(huì)造成較大影響，導(dǎo)致對不良環(huán)境耐受性較差的微生物不能生長。

表2 曲拉樣品中細(xì)菌測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of bacterial sequencing data of Qula samples

圖1 細(xì)菌Shannon指數(shù)（a）和Chao1指數(shù)（b）箱式圖Fig.1 Bacterial Shannon index (a) and Chao1 index (b)

結(jié)合表3、圖2可得，3 組樣品間真菌多樣性指數(shù)差異不顯著，但低海拔組與中海拔組、高海拔組樣品的真菌豐富度指數(shù)存在顯著差異（＜0.05），中海拔組與高海拔組差異不顯著。與細(xì)菌相比，真菌對不良環(huán)境的耐受性更強(qiáng)，因此海拔變化對真菌的影響較細(xì)菌小。但隨著海拔高度的上升，各種環(huán)境因素的改變導(dǎo)致了微生物生長條件變差，中海拔組與高海拔組的微生物多樣性都比低海拔組要低。

表3 曲拉樣品中真菌測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 3 Sequencing data statistics of fungi in Qula samples

圖2 真菌Shannon指數(shù)（a）和Chao1指數(shù)（b）箱式圖Fig.2 Fungal Shannon index (a) and Chao1 index (b)

2.2 樣品所含OTU數(shù)量分析

為了研究不同海拔地區(qū)的曲拉樣品中微生物多樣性，需要對不同組樣品的序列按97%的一致性聚類為OTU，然后進(jìn)行分析。通過聚類操作，按照RDP貝葉斯算法分析不同水平中OTU代表序列，利用R軟件，繪制Venn圖。

由圖3可知，低海拔組含有細(xì)菌OTU 2 411 個(gè)、中海拔組含有細(xì)菌OTU 1 391 個(gè)、高海拔組含有細(xì)菌OTU 1 197 個(gè)，其中低海拔組與中海拔組共有的細(xì)菌OTU 473 個(gè)、低海拔組與高海拔組共有的細(xì)菌OTU 217 個(gè)、中海拔組與高海拔組共有的細(xì)菌OTU 75 個(gè)，3 組共有的細(xì)菌OTU 715 個(gè)。低海拔組含有細(xì)菌OTU數(shù)量最多、中海拔組次之、高海拔組最少。

圖3 曲拉樣品細(xì)菌群落Venn圖Fig.3 Venn diagram showing shared and unique bacterial OTUs among Qula samples

由圖4可知，低海拔組含有真菌OTU 801 個(gè)、中海拔組含有真菌OTU 343 個(gè)、高海拔組含有真菌OTU 399 個(gè)，其中低海拔組與中海拔組共有的真菌OTU 64 個(gè)、低海拔組與高海拔組共有的真菌OTU 75 個(gè)、中海拔組與高海拔組共有的真菌OTU 17 個(gè)，3 組共有的真菌OTU 173 個(gè)。低海拔組含有真菌OTU數(shù)量最多、高海拔組次之、中海拔組最少。

圖4 曲拉樣品真菌群落Venn圖Fig.4 Venn diagram showing shared and unique fungal OTUs among Qula samples

2.3 不同樣品在屬水平的比較

在樣品中檢出的眾多微生物中，由于許多物種含量過少，不具有代表意義。因此在群落組成分析中，將相對豐度小于1%的物種歸為其他類（others），相對豐度大于1%的物種按豐度大小進(jìn)行繪圖。

由圖5所示，共檢出23 種相對豐度大于1%的屬，隨著海拔高度的上升，樣品中優(yōu)勢微生物的種類減少。其中低海拔組17 種，中海拔組11 種，高海拔組7 種。不同組樣品共有的優(yōu)勢屬為乳球菌屬（）、乳桿菌屬（），平均相對豐度為34.0%和18.4%。在低海拔組中，優(yōu)勢菌屬為紅球菌屬（）13.1%、12.2%、考克氏菌屬（）9.5%、6.4%、醋酸菌屬（）5.9%。中海拔組中，優(yōu)勢菌屬為54.6%、12.8%、10.4%。在高海拔組中，優(yōu)勢菌屬為40.9%、30.2%、9.4%。除低海拔組外，和在樣品中占有絕對優(yōu)勢。在各組樣品中，明串珠菌屬（）、片球菌屬（）、腸球菌屬（）、鏈球菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、雙歧桿菌屬（）也有較高的豐度，這些乳酸菌也常見于各種發(fā)酵乳制品、泡菜等傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在生產(chǎn)過程中代謝產(chǎn)生乳酸、促進(jìn)發(fā)酵，抑制有害菌，并產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)，最終使傳統(tǒng)發(fā)酵食品具有其典型的特征。

圖5 曲拉樣品在屬水平的細(xì)菌群落組成Fig.5 Bacterial community composition of Qula samples at the genus level

如圖6所示，共檢出23 種相對豐度大于1%的屬，其中低海拔組11 種，中海拔組12 種，高海拔組13 種。不同組樣品間優(yōu)勢微生物的種數(shù)差異不明顯。不同組樣品共有的優(yōu)勢屬為地霉屬（），平均相對豐度為33.8%。白地霉（）是奶酪中常見的真菌，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，影響奶酪的風(fēng)味。在低海拔組中，優(yōu)勢菌屬為曲霉屬（）21.1%、20.0%、青霉屬（）16.7%。在中海拔組中，優(yōu)勢菌屬為48.0%、畢赤酵母屬（）8.15%。在高海拔組中，優(yōu)勢菌屬為33.6%、7.4%。在各組樣品中，克魯維酵母屬（）、、假絲酵母屬（）也有較高的豐度，這些酵母菌常見于各種奶酪制品中，對奶酪的風(fēng)味產(chǎn)生重要影響。此外，未鑒定出的屬在不同組樣品中也有較高的豐度。

圖6 曲拉樣品在屬水平的真菌群落組成Fig.6 Fungal community composition of Qula samples at the genus level

2.4 不同曲拉樣品中微生物β多樣性分析

利用SPSS軟件，分析曲拉樣品的細(xì)菌、真菌群落。由圖7a可得出，低海拔組樣品在PCA圖中的位置集中，距離緊密，樣品間相似度較高，有明顯的聚類趨勢。中海拔組樣品在PCA圖中的位置比較集中，距離接近，高海拔組的樣品在PCA圖中較為分散，距離較遠(yuǎn)。圖7b為基于unweighted_unifrac距離的UPGMA聚類分析圖，低海拔組的樣品聚類較為集中，樹枝間的長度較短，樣品間相似度較高，且與中海拔組、高海拔組的距離較遠(yuǎn)。中海拔組、高海拔組的樣品樹枝間長度較長，樣品間相似度較低。與PCA所得出的結(jié)論一致。

圖7 不同組樣品的細(xì)菌群落PCA（a）與層級聚類分析（b）Fig.7 PCA plot for bacterial communities in samples from different groups (a) and hierarchical cluster analysis (b)

由圖8a可見，低海拔組樣品在PCA圖中的位置分散，距離較遠(yuǎn)，樣品間相似度較低，中海拔組、高海拔組的樣品在PCA圖中位置集中，距離較近，樣品間相似度較高。圖8b中，低海拔組樣品樹枝間的長度較長，樣品間相似度較低，與中海拔組、高海拔組差異較大。中海拔組、高海拔組的聚類較為集中，樹枝間的長度較短，樣品間相似度較高。與PCA所得出的結(jié)論一致。

圖8 不同組樣品的真菌群落PCA（a）與層級聚類分析（b）Fig.8 PCA plot for fungal communities in samples from different groups (a) and hierarchical cluster analysis (b)

3 討 論

曲拉作為我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，屬于酸凝型奶酪，往往在自然條件下經(jīng)過多菌種的共同發(fā)酵制成。曲拉中微生物群落結(jié)構(gòu)對曲拉的風(fēng)味影響重大：乳酸菌是曲拉中細(xì)菌的核心菌群，在曲拉生產(chǎn)過程中，乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸促進(jìn)凝乳、生成多種風(fēng)味物質(zhì)。多種乳酸菌協(xié)同發(fā)酵可減少發(fā)酵時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，改善曲拉的整體品質(zhì)。酵母菌則與蛋白質(zhì)水解、脂類降解等代謝途徑密切相關(guān)，改善曲拉的質(zhì)地與風(fēng)味。一些霉菌也對曲拉的品質(zhì)有重要影響。但曲拉在自然粗獷的生產(chǎn)條件下，多微共酵的發(fā)酵方式有可能使致病菌生長繁殖，導(dǎo)致其安全性受到嚴(yán)重影響。因此，探明發(fā)酵過程中的部分關(guān)鍵微生物，對改進(jìn)曲拉生產(chǎn)工藝、促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生、保證曲拉安全性等有重要意義。

自然發(fā)酵乳制品有很高的微生物多樣性，是由其發(fā)酵環(huán)境決定。本研究中，和為不同組樣品共有的優(yōu)勢菌群，這與曹磊、劉振東等對不同產(chǎn)地牦牛曲拉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)、為優(yōu)勢菌屬的結(jié)論一致。Wafa等在對丹麥生產(chǎn)的奶酪的細(xì)菌多樣性分析中發(fā)現(xiàn)，和均為奶酪中的優(yōu)勢菌屬。Quigley等研究發(fā)現(xiàn)在愛爾蘭奶酪中是優(yōu)勢菌屬。乳酸菌按照其在乳制品中的作用，又可分為發(fā)酵劑乳酸菌和非發(fā)酵劑乳酸菌，發(fā)酵劑乳酸菌在牛乳中產(chǎn)酸速率高，促進(jìn)凝乳。非發(fā)酵劑乳酸菌在奶酪生產(chǎn)過程中產(chǎn)酸作用弱或不產(chǎn)酸，主要起加快奶酪成熟、改善奶酪風(fēng)味的作用。一些嗜溫型乳酸菌如、等在奶酪成熟過程中作為產(chǎn)香菌，可加快成熟過程并產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，對奶酪的整體風(fēng)味起修飾作用。乳酸菌在各種發(fā)酵乳制品中，所占比例均較大，在整個(gè)生產(chǎn)發(fā)酵過程中，對成品的質(zhì)量與風(fēng)味都起到了重要作用。李先勝等對采自西藏牧民家庭的曲拉進(jìn)行分離純化，篩選出的優(yōu)勢酵母菌為馬克斯克魯維酵母（s），該菌同樣為青海酸牦牛奶中的優(yōu)勢菌群。馬龍等發(fā)現(xiàn)、、是天然開菲爾粒中的優(yōu)勢酵母，這些酵母菌也廣泛存在于各種奶酪中，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，影響著奶酪的風(fēng)味。曲拉的自然發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中包括各種乳酸菌與酵母菌的共同作用，各種菌群間的協(xié)同或抑制作用廣泛存在，造成曲拉的風(fēng)味受到較大影響，如果發(fā)酵時(shí)的衛(wèi)生條件較差，還有可能感染各種致病菌，導(dǎo)致其安全性下降。由于發(fā)酵過程受環(huán)境影響較大，不同批次的產(chǎn)品品質(zhì)波動(dòng)較大。自然發(fā)酵的乳制品具地方特色，深受當(dāng)?shù)厝罕娤矏?，有較大的改進(jìn)空間與市場前景。因此，對于自然發(fā)酵乳制品中的各種微生物的作用還需深入研究。

4 結(jié) 論

利用高通量測序技術(shù)，對西藏不同海拔地區(qū)的40 份曲拉樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。研究表明，不同海拔地區(qū)的曲拉樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)有所差異。低海拔地區(qū)的曲拉樣品中微生物多樣性較高，中海拔地區(qū)的曲拉樣品中微生物多樣性較低，高海拔地區(qū)的曲拉樣品中的微生物多樣性最低。隨著海拔高度上升，曲拉樣品中的微生物多樣性下降。