遵義細(xì)菌型自然發(fā)酵干豆豉菌群結(jié)構(gòu)及風(fēng)味品質(zhì)分析

聶黔麗，王修俊*，劉林新，陳顏紅，包歡歡，何春霞

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實驗室，貴州 貴陽 550025）

豆豉主要以黃豆或黑豆為原料，經(jīng)過微生物群落作用發(fā)酵而成。因其獨(dú)特風(fēng)味及營養(yǎng)價值而成為我國四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一，長期食用還具有助消化、增強(qiáng)肝臟排毒、預(yù)防癌癥等生理功能。細(xì)菌型豆豉主要在山東、貴州及云南等地較為常見，這類豆豉主要通過細(xì)菌在蛋白酶作用下分解蛋白質(zhì)進(jìn)行有氧發(fā)酵，利用食鹽、高濃度白酒改變微生物生長環(huán)境減緩其生長速度，此外還通過添加姜粉、胡椒粉去豆腥增加發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)在無氧環(huán)境后熟發(fā)酵，干燥既得成品細(xì)菌型豆豉。遵義細(xì)菌型干豆豉作為遵義的一種特色美食，常與臘肉、折耳根搭配成為遵義地方特色菜，深受人們喜愛。

豆豉的質(zhì)量、風(fēng)味與發(fā)酵過程中的微生物密切相關(guān)，而目前遵義細(xì)菌型自然發(fā)酵豆豉主要以家庭式或者手工作坊式自然發(fā)酵，涉及的菌群多、菌群產(chǎn)物復(fù)雜，發(fā)酵主要貢獻(xiàn)菌群無法控制，發(fā)酵出來的豆豉品質(zhì)無法保障。針對這一問題，目前大多數(shù)研究都采用高通量測序?qū)ψ匀话l(fā)酵豆豉的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析，該技術(shù)不需分離純化樣品中的微生物，能夠有效避免純培養(yǎng)挑菌過程中的主觀性，并且能客觀反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，因此被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的菌群研究中。趙文鵬等利用高通測序技術(shù)研究得到曲霉型豆豉發(fā)酵中細(xì)菌群落組成和演替規(guī)律；李薇等則對毛霉型豆豉的微生物群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)演替規(guī)律進(jìn)行了分析；鄧高文等以貴州水豆豉為研究對象，利用該技術(shù)對其細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行研究。但是目前的研究大多集中于對霉菌型豆豉的研究，關(guān)于細(xì)菌型豆豉仍然較少，并且都只是側(cè)重于分析豆豉的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性，關(guān)于豆豉微生物菌落結(jié)構(gòu)多樣性及其與風(fēng)味品質(zhì)的相關(guān)性的研究甚少。

傳統(tǒng)的遵義細(xì)菌型自然發(fā)酵豆豉，發(fā)酵周期長、發(fā)酵過程復(fù)雜，難以判斷其發(fā)酵周期。因此本研究以發(fā)酵成熟的干豆豉為原料，依托高通量測序分析遵義細(xì)菌型豆豉樣品的菌落結(jié)構(gòu)，揭示遵義細(xì)菌型自然發(fā)酵干豆豉的微生物菌落結(jié)構(gòu)多樣性，并對遵義細(xì)菌型豆豉的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行分析，從而為遵義細(xì)菌型豆豉微生物菌群結(jié)構(gòu)影響其風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)理提供重要參考及為后續(xù)生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發(fā)酵干豆豉成品（以下簡稱豆豉） 遵義新嘉裕食品有限公司；土壤基因組提取試劑盒 美國Omega公司；Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混合液、Hieff NGS?基因分選磁珠 上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺式離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；ETC 811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Q32866Qubit3.0熒光計 美國Invitrogen公司；FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；DYCZ-21電泳槽、DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳拓能達(dá)科技有限公司；ZHWY111B型恒溫?fù)u床 上海志城分析儀器有限公司；FA1004型電子精密天平 上海良平儀表有限公司；YX280B型手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；LS-1F型超凈化工作臺 上海索普儀器有限公司；0.5～10 μL移液槍 羅德生物技術(shù)有限公司；SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器 常州博遠(yuǎn)實驗分析儀器廠；XHF-D高速勻漿機(jī) 寧波新芝股份有限公司；L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB手動固相微萃取裝置 美國Supelco公司；HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 高通量測序

1.3.1.1 樣品預(yù)處理

隨機(jī)取豆豉樣品2.0 g，使用高溫滅菌的剪刀將其剪碎后混合均勻，取0.5 g樣品放入2.0 mL樣品管，在組織破碎儀中進(jìn)行破碎后提取，得到內(nèi)切樣品，命名為DC-1；將0.5 g樣品加入無菌水混合均勻后離心留取適量沉淀后進(jìn)行提取，得到表皮樣品，命名DC-2。

1.3.1.2 豆豉樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增

使用E.Z.N.AMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒對樣品中的DNA進(jìn)行提取，提取方法參照試劑盒的說明進(jìn)行，得到樣品基因組DNA。

以Nobar_341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）、Nobar_805R（CCTACGGGNGGCWGCAG）作為引物對細(xì)菌16S rRNA序列的V-V區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR體系各組分于無菌離心管中混合均勻后短暫離心，之后將PCR管置于PCR儀中按照PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，為了得到均勻的長簇效果和高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，使用Qubit 3.0熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定，構(gòu)建測序文庫后委托生工生物工程（上海）股份有限公司于MiSeq平臺測序。

1.3.1.3 多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過MiSeq得到含有barcode序列的雙端序列數(shù)據(jù)，拼接、對比優(yōu)化后質(zhì)控過濾，參數(shù)為-O5-m50，使用cutadapt去除引物；TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系使用PEAR將成對reads拼接成一條序列；由barcode序列和引物序列從拼接對優(yōu)化后相似度在97%相似度水平下的數(shù)據(jù)，利用RDP classifier、SINTAX、BLAST進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）分類學(xué)分析，以確定細(xì)菌型豆豉微生物分類信息。

1.3.2 自然發(fā)酵干豆豉風(fēng)味品質(zhì)分析

1.3.2.1 氨基酸測定

取粉末顆粒狀豆豉樣品1.00 g，按GB 5009.124ü 2016《食品中氨基酸的測定》方法，每組實驗做3 個平行，結(jié)果取平均值。

1.3.2.2 游離脂肪酸測定

參照GB 5009.168ü2016《食品中脂肪酸的測定》，對總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist17和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對含量。

1.3.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)測定

將豆豉樣品混勻剪碎，稱取充分混勻豆豉樣品2.0 g，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定豆豉揮發(fā)性物質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過mothur軟件進(jìn)行rarefaction分析，Excel 2019對其余數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。利用R軟件、Excel 2019、Python的ete3 package軟件分別繪制稀釋曲線、相對豐度柱形圖、系統(tǒng)樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果

2.1.1 豆豉序列分析

經(jīng)Illumina高通量技術(shù)對樣品16S rRNA的V-V區(qū)域進(jìn)行測序并對測序結(jié)果進(jìn)行篩選后，共得到424 631 條長度大于400 bp的有效序列，細(xì)菌及真菌樣品OTU覆蓋率高達(dá)99%，表明豆豉樣品中微生物種類幾乎都被檢測到，完全能夠代表樣本中細(xì)菌的真實情況；樣品平均Chao指數(shù)為245.24，有效序列有133 587.5 條，OTU數(shù)為81，說明測序結(jié)果覆蓋全面，長度大于分析標(biāo)準(zhǔn)序列，可用于序列測定分析（表1）。在OTU劃分的基礎(chǔ)上，按照97%相似性水平下對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類注釋，再通過RDP和SINTAX將OTU代表序列鑒定后得到，豆豉中的微生物被鑒定為7 個門，15 個綱，20 個目，30 個科，44 個屬。

表1 豆豉序列數(shù)據(jù)Table 1 Bacterial sequencing data for douchi samples

2.1.2 豆豉的細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

基于QIIME，以樣品在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線，從而反映樣品在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。曲線越平緩說明數(shù)據(jù)樣本量越充足，由圖1可看出，豆豉樣品序列數(shù)大于10 000左右時，多樣性指數(shù)稀釋性曲線趨于平緩，OTU數(shù)目不再上升，達(dá)到飽和。表明測序量合理，并且隨著序列數(shù)的增加豆豉樣品中細(xì)菌多樣性不會有太大改變，足以反映豆豉樣品中大部分的微生物多樣性。

圖1 細(xì)菌α多樣性指數(shù)稀釋性曲線圖Fig.1 Rarefaction curves of bacterial α-index

2.1.3 豆豉的科、屬水平相對豐度分析

由圖2可知，豆豉的細(xì)菌在科水平上細(xì)菌種類有桿菌科（Bacillacea）、芽孢桿菌科-1（Paenibacillaceae-1）、球菌科（Planococcaceae）、擬桿菌科（Paenibacillaceae-2）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）及其他菌株，從科水平上分析豆豉中芽孢桿菌相對豐度接近50%，說明該地區(qū)豆豉主要貢獻(xiàn)菌群為芽孢桿菌科。在屬水平上，豆豉樣品的優(yōu)勢菌屬有芽孢桿菌屬（）、擬桿菌屬（）、梭形桿菌屬（）、短芽孢桿菌屬（）、無芽孢桿菌屬（）、厭氧桿菌屬（）、乳桿菌屬（）、腸球菌屬（）、未分類芽孢桿菌屬（unclassified_Paenibacillaceae），其平均相對豐度為41.01%、27.23%、7.09%、8.44%、6.6%、2.02%、2.12%、1.58%、1.16%?？梢娮窳x細(xì)菌型豆豉中桿菌屬芽孢桿菌、擬桿菌、短桿菌占據(jù)絕對優(yōu)勢，其綜合比例占比高達(dá)92.39%，含少量的乳桿菌。

圖2 細(xì)菌在科水平和屬水平相對豐度柱狀圖Fig.2 Relative abundance of bacteria at the family and genus levels

2.1.4 豆豉系統(tǒng)發(fā)育菌株種占比分析

從圖3可看出，豆豉菌群隸屬于兩個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），相對含量94.33%和5.39%。其核心優(yōu)勢菌群隸屬于厚壁菌門的桿菌綱，而芽孢桿菌科在該地區(qū)干豆豉中占絕對優(yōu)勢，其相對豐度為41.85%。另外雖然乳桿菌在科水平上的相對豐度僅為2.23%，但是其對豆豉的滋味有重要影響。董蘊(yùn)等在對細(xì)菌類群對豆豉品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，酸味是不同豆豉之間形成差異的最大感官指標(biāo)，并得到乳桿菌與豆豉的酸味呈正相關(guān)；陳浩等研究發(fā)現(xiàn)，添加了乳桿菌發(fā)酵的豆豉，其產(chǎn)品理化特性及揮發(fā)性物質(zhì)均優(yōu)于未添加乳桿菌組；Liu Chenjian等在云南細(xì)菌型豆豉中發(fā)現(xiàn)大量乳桿菌，且是該地區(qū)豆豉發(fā)風(fēng)味形成的主要貢獻(xiàn)者；另外在李曉然等對云南地區(qū)細(xì)菌型豆豉的菌群結(jié)構(gòu)研究中，乳桿菌屬相對豐度占絕對優(yōu)勢，在豆豉發(fā)酵中起重要作用，其次10%左右的芽孢桿菌也是該地區(qū)豆豉發(fā)酵的重要菌；而宋園亮在乳桿菌和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵豆豉的研究中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌能顯著減少由純種枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆豉所產(chǎn)生的氨味，使豆豉具有濃厚的酯香，在感官評價中接受度最好。另外在郭婭、鄧高文、黃曉潤等對貴州地區(qū)特色水豆豉菌群結(jié)構(gòu)的分析中，均未檢出乳桿菌，這可能與豆豉的類型有關(guān)。因此本研究可以得出，遵義細(xì)菌型干豆豉主要由芽孢桿菌和乳桿菌共同作用，協(xié)同發(fā)酵出具有獨(dú)特醬香的遵義細(xì)菌型干豆豉。

圖3 樣品系統(tǒng)組成樹狀圖Fig.3 Dendrogram of bacterial communities in douchi samples

2.2 豆豉風(fēng)味品質(zhì)分析

2.2.1 豆豉游離氨基酸分析

由表2、圖4可知，豆豉中總氨基酸含量為24.828 mg/g，共檢測16 種氨基酸，均包括人體所需的6 種必需氨基酸。不同菌株發(fā)酵豆豉對豆豉中氨基酸種類及含量有顯著影響，這主要在與不同微生物的發(fā)酵周期不同，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)水解程度，而發(fā)酵豆制品中的鮮味和苦味物質(zhì)主要是由于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生，當(dāng)不同滋味的物質(zhì)在一起時會發(fā)生味道的相消、相乘等作用，從而形成了干豆豉獨(dú)特的滋味。由表2可以看到，豆豉呈現(xiàn)鮮味氨基酸分別為0.198 mg/g和4.147 mg/g，占0.79%及17.80%；甜味氨基酸蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸及組氨酸含量總和占總氨基酸比率為4.67%；苦味氨基酸纈氨酸、酪氨酸和精氨酸的總和占總氨基酸含量的51.65%，鮮、甜、苦3 種滋味相互作用，呈現(xiàn)了遵義細(xì)菌型干豆豉獨(dú)特的滋味。

表2 豆豉游離氨基酸組成變化Table 2 Free amino acid composition of douchi

圖4 豆豉游離氨基酸分離譜圖Fig.4 Chromatogram showing the separation of free amino acids in douchi

2.2.2 豆豉游離脂肪酸分析

根據(jù)圖5和表3可知，豆豉中共檢測出26 種游離脂肪酸，其中飽和脂肪酸15 種，硬脂酸含量最高，占總脂肪酸的47.64%。脂肪酸在豆豉風(fēng)味形成過程中作為重要的前提物質(zhì)對細(xì)菌型發(fā)酵豆豉的營養(yǎng)和香氣成分有重要影響，例如硬脂酸、棕櫚酸等可以在多種酶的作用下發(fā)生氧化產(chǎn)生酮類等風(fēng)味物質(zhì)；而飽和脂肪酸有調(diào)節(jié)人體免疫能力、促進(jìn)細(xì)胞分化等作用，當(dāng)攝入不足會對人體健康產(chǎn)生影響，尤其是硬脂酸不但是-3系多不飽和脂肪脂肪酸重要補(bǔ)充來源，而且還可以改善豆豉口感，是眾多風(fēng)味物質(zhì)的前提發(fā)酵物質(zhì)。此外該豆豉中不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的25.26%，其中-3系多不飽和脂肪酸亞麻酸占不飽和脂肪酸總量的93.09%，-6系多不飽和脂肪酸亞油酸占0.929%。不飽和脂肪酸具有降低膽固醇、改善癌癥患者免疫能力和促進(jìn)癌細(xì)胞死亡、抑制癌細(xì)胞生長及產(chǎn)后調(diào)劑等多種作用，其中亞麻酸、亞油酸等含量可以作為影響食品營養(yǎng)價值的重要參考標(biāo)準(zhǔn)之一，因此這也是豆豉具有生理保健功能的重要來源之一。

圖5 豆豉游離脂肪酸TICFig.5 TIC chromatogram of free fatty acids in douchi

表3 豆豉游離脂肪酸組成變化Table 3 Free fatty acid composition of douchi

2.2.3 豆豉揮發(fā)性物質(zhì)分析

續(xù)表4

續(xù)表4

由圖6、表4可知，自然發(fā)酵豆豉由于發(fā)酵菌株不確定性和多樣性，揮發(fā)性物質(zhì)種類豐富，共檢測出91 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酸類物質(zhì)、酮類物質(zhì)及烯烴類物質(zhì)種類最多；從揮發(fā)性物質(zhì)相對含量上看，該豆豉酸類物質(zhì)最高達(dá)到44.529%，其次是含氮類物質(zhì)12.386%，吡嗪類物質(zhì)占10.622%，醇類物質(zhì)占0.995%。

圖6 揮發(fā)性物質(zhì)的TICFig.6 TIC chromatogram of volatile substances in douchi

表4 豆豉揮發(fā)性物質(zhì)相對含量Table 4 Relative contents of volatile substances in douchi

吡嗪類物質(zhì)含量在該豆豉中僅次于酸類物質(zhì)，是其風(fēng)味物質(zhì)的主要成分之一。其中2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪閾值極低，會產(chǎn)生可可香氣、烤面包香氣及令人愉悅的烤花生香氣；這類物質(zhì)主要通過影響硫代謝、氨基酸代謝從而對該豆豉風(fēng)味產(chǎn)生極大影響。

醇類、酮類及酯類物質(zhì)在該豆豉中含量較少，但是對其風(fēng)味的影響也是極大的。例如醇類物質(zhì)賦予了豆豉典型的豉香醬香風(fēng)味，其中異戊醇、2-甲基丁醇及1-辛烯-3-醇對豆豉形成特有醬香風(fēng)味有顯著貢獻(xiàn)，苯甲醇有苦杏仁和濃郁的櫻桃香味。酮類化合物一般呈果香風(fēng)味，由脂肪酸氧化作用后，其閾值低且增香能力強(qiáng)。在該豆豉中酮類化合物占比4.926%，2-丁酮、2-甲基-3-戊酮、3-甲基-2-戊酮、4-甲基-3-己酮、6-甲基-3-庚酮、6-甲基-2-庚酮、2-壬酮、苯基丙酮等物質(zhì)對豆豉風(fēng)味物質(zhì)具有較高貢獻(xiàn)度。

結(jié)合對遵義細(xì)菌型豆豉的高通量測序結(jié)果中芽孢桿菌和乳桿菌為豆豉發(fā)酵過程的核心菌群，而有研究報道，豆豉中揮發(fā)性物質(zhì)中酸類物質(zhì)大多由乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的微生物多數(shù)為枯草芽孢桿菌，此外醇類、酯類等的大部分化合物由枯草芽孢桿菌和乳桿菌共同產(chǎn)生，由此可見遵義細(xì)菌型干豆豉的芽孢桿菌及乳桿菌對其風(fēng)味有著極大影響。

3 結(jié) 論

結(jié)合遵義細(xì)菌型干豆豉的稀釋曲線及相對豐度圖可以看出，該地區(qū)干豆豉的細(xì)菌組成比較豐富：共檢出7 個門、15 個綱、20 個目、30 個科、44 個屬；桿菌屬芽孢桿菌、擬桿菌、短桿菌為該豆豉的主要貢獻(xiàn)菌群，在相對豐度中占據(jù)絕對優(yōu)勢，少量的乳桿菌在其發(fā)酵過程中也有重要作用，協(xié)同發(fā)酵出具有獨(dú)特豉香的遵義細(xì)菌型干豆豉。此外對該干豆豉風(fēng)味品質(zhì)分析得到，該豆豉中共存在16 種氨基酸，均包括人體所需的6 種必需氨基酸，總氨基酸含量為24.828 mg/g；共檢測出26 種游離脂肪酸，其中飽和脂肪酸15 種，不飽和脂肪酸11 種；利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從豆豉中檢測出了91 種揮發(fā)性物質(zhì)，以主要影響豆豉風(fēng)味的酯類、酮類、酸類、醇類及吡嗪類化學(xué)物質(zhì)作為參考對主要貢獻(xiàn)香氣成分相對含量及閾值進(jìn)行比較，酸類物質(zhì)含量最高，其次是含氮類物質(zhì)，醇、酮及酯類物質(zhì)含量較少。本研究促進(jìn)了遵義細(xì)菌型自然發(fā)酵干豆豉微生物菌群結(jié)構(gòu)和風(fēng)味品質(zhì)相關(guān)性的基礎(chǔ)研究，在一定程度驗證了遵義細(xì)菌型豆豉的風(fēng)味主要由芽孢桿菌和乳桿菌共同作用產(chǎn)生，從而為遵義型細(xì)菌型豆豉的后續(xù)生產(chǎn)及直投式復(fù)合發(fā)酵菌劑的研究提供理論依據(jù)。