乳桿菌耐消化應激能力及消化應激對其腸道黏附能力的影響

陳大衛(wèi)，程 月，任晨瑜，陳春萌，瞿恒賢，瓦云超，燕憲濤，陳 霞，黃玉軍，張臣臣，關成冉，鄭英明，顧瑞霞,*

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州 225127；2.江蘇宇航食品科技有限公司，江蘇 鹽城 224000）

乳桿菌作為人體腸道中的重要益生菌，不僅能夠調節(jié)機體腸道的微生態(tài)平衡，還具有提高免疫、抗氧化以及促進營養(yǎng)物質吸收等功能。在發(fā)揮益生作用之前，乳桿菌需經過口腔、胃及腸道等一系列的消化應激，而口腔中的溶菌酶能夠通過水解-乙酰葡糖胺和-乙酰胞壁酸破壞乳桿菌的細胞壁結構，胃中的酸性環(huán)境（pH 2.0～5.0）會使菌體細胞中維持正常生理功能的蛋白發(fā)生變性，腸道中的膽鹽（0.1%～0.3%）、胰酶（0.1%）及pH值等也會導致菌體細胞相關蛋白的變性；這些不良環(huán)境不僅會對乳桿菌的黏附能力產生較大的影響，更會造成乳桿菌的損傷甚至死亡。而乳桿菌在腸上皮細胞上的黏附有助于延長其在腸道中的停留時間，加強其與腸上皮細胞間的信息交流，并通過調節(jié)腸道菌群、免疫反應、代謝產物及抑制腸道病原菌的定植等改善低免疫、過氧化、腹瀉等對機體健康產生的不良影響。因此，乳桿菌只有耐受口腔、胃液和腸液等消化道的不良環(huán)境，以較高的活菌數到達并黏附在腸道上，才能更好地發(fā)揮其益生作用。

乳桿菌的黏附主要分為2 個階段，首先由非特異性的物理結合如疏水相互作用、表面電荷驅動黏附；隨后通過菌株細胞的表層蛋白、胞外多糖、脂磷壁酸等細胞壁的組成成分與宿主進行特異性黏附。表層蛋白是在菌株細胞內合成后通過信號肽穿過細胞膜被分泌到細胞外，通過與菌體表面的肽聚糖層和磷壁酸結合發(fā)揮其黏附作用；胞外多糖則是乳桿菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的糖類化合物，根據與菌體的緊密連接程度可分為黏液多糖和莢膜多糖；而脂磷壁酸主要是與細胞壁肽聚糖共價結合的壁磷壁酸，以及錨定在細胞膜上的脂磷壁酸。

目前，對乳桿菌黏附的大部分研究僅分別單獨考察其在模擬胃腸道環(huán)境下的存活情況和對腸上皮細胞的黏附能力；而關于乳桿菌在依次經過模擬唾液-胃液-腸液等連續(xù)消化應激后的黏附能力及其表面黏附素變化的研究較少，主要集中在單個消化應激對乳桿菌黏附能力的影響，對于連續(xù)消化應激對乳桿菌黏附能力的影響仍未知，具體的響應和適應機制也不明確。因此，本實驗首先研究乳桿菌在依次經過模擬唾液-胃液-腸液等連續(xù)消化應激后的存活能力，然后研究其對腸道的黏附能力以及連續(xù)消化應激對其黏附能力和表面黏附素的影響；最后通過透射電鏡（transmissim electnonic microscopy，TEM）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分別探討連續(xù)消化應激對乳桿菌表層微觀結構及表層蛋白的影響，以期闡明消化應激對乳桿菌黏附影響的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌（）m1、LYO、m98、W157、W116、W78，副干酪乳桿菌（）W125、m54、96、m38、m64、m111，發(fā)酵乳桿菌（）56、m91、57、146、147、118來自江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室；人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞株湖南豐暉生物科技有限公司；大腸桿菌（） CICC10899、沙門菌（）WX29 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、氯化鋰（LiCl）、牛膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE低分子質量標準蛋白Marker（10～180 kDa）賽默飛世爾科技（中國）有限公司；黏蛋白（Type II）上海麥克林生化科技有限公司；高碘酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 生工生物工程（上海）股份有限公司；最小基本培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）、丙酮酸鈉溶液、氨基酸溶液、谷氨酰胺添加劑美國Gibco公司。

1.2 儀器與設備

JF-SX-500全自動滅菌鍋 日本TOMY公司；DNP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；Legend mach1.6 R高速冷凍離心機 美國塞默飛世爾科技有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；IC1000細胞計數儀 美國Count Star公司；IX2-ILL100熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；JEM1200EX型TEM日本JEOL公司；HX-2000 SDS-PAGE儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 常用試劑及培養(yǎng)基的配制

模擬唾液：按表1的比例配制模擬唾液緩沖液，加入100 mg/L的溶菌酶溶解后，用1 mol/L的HCl溶液調節(jié)pH 7.0，0.22 μm濾膜過濾除菌，現用現配。

表1 模擬消化液成分組成Table 1 Composition of simulated digestion fluids mmol/L

模擬胃液：按表1的比例配制模擬胃液緩沖液，加入3 g/L的胃蛋白酶溶解后，用1 mol/L的HCl溶液調節(jié)pH 3.0，0.22 μm濾膜過濾除菌，現用現配。

模擬腸液：按表1的比例配制模擬腸液緩沖液，加入0.1%的胰蛋白酶、0.3%的牛膽鹽溶解后，用1 mol/L的HCl溶液調節(jié)pH 8.0，經0.22 μm濾膜過濾除菌，現用現配。

MEM完全培養(yǎng)液：77% MEM培養(yǎng)液、20% Clark胎牛血清、1% MEM非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸鈉溶液、1% GlutaMAX谷氨酰胺添加劑，4 ℃貯藏備用。

MRS（De Man, Rogosa and Sharpe）液體培養(yǎng)基：無水乙酸鈉5.0 g，KHPOg7HO 0.2 g，MnSOg4HO 0.05 g，蛋白胨10.0 g，吐溫-80 1 mL，葡萄糖20.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min，放置室溫冷卻后使用。MRS固體培養(yǎng)基則加入15.0 g瓊脂。

1.3.2 乳桿菌的消化應激能力

活化后的乳桿菌于8 000h離心10 min，無菌PBS（pH 7.2）洗滌后將菌體沉淀懸浮于模擬唾液中，37 ℃培養(yǎng)5 min，8 000h離心10 min后將菌體沉淀重懸于模擬胃液中，37 ℃培養(yǎng)3 h，8 000h離心10 min后再將菌體沉淀重懸于模擬腸液中，37 ℃培養(yǎng)2 h；每次應激后均采用平板菌落計數法測定乳桿菌的活菌數。

1.3.3 乳桿菌對黏蛋白的黏附能力

稱取一定量的黏蛋白溶于PBS，配制成1 mg/mL的黏蛋白溶液，取0.5 mL加至24 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)1 h后4 ℃過夜，然后加入等體積的黏蛋白繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)2 h以彌補空白位點，PBS（pH 7.2）洗滌2 次后，接種0.5 mL 10CFU/mL的菌株，37 ℃培養(yǎng)2 h；再用PBS洗滌2 次以除去未黏附的菌株，加入0.5 mL 5 mL/L TritonX-100溶液，于37 ℃孵育30 min解除已黏附的菌株，用槍頭輕輕刮取收集菌懸液，采用平板菌落計數法測定乳桿菌的活菌數，按照式（1）計算乳桿菌對黏蛋白的黏附率：

1.3.4 乳桿菌對Caco-2細胞的黏附能力

取0.5 mL 2h10cell/mL Caco-2細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，每天換液1 次，培養(yǎng)至單層，無菌PBS洗滌2 次，加入0.5 mL 10CFU/mL的未消化應激或消化應激后的乳桿菌，37 ℃培養(yǎng)2 h；用無菌PBS洗滌3 次除去未黏附的菌株，加入150 μL 0.25%胰酶消化液后在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中消化3～5 min至Caco-2細胞完全脫落，再加入350 μL MEM完全培養(yǎng)基終止消化，收集菌懸液，采用平板菌落計數法測定乳桿菌的活菌數，按照式（1）計算乳桿菌對Caco-2細胞的黏附率。

1.3.5 乳桿菌表面主要黏附素的測定

將0.5 mL 2h10cell/mL Caco-2細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至單層，分別取10CFU/mL未消化應激或消化應激后的乳桿菌用無菌PBS洗滌3 次，離心后分別加入5 mol/L LiCl溶液、50 mmol/L高碘酸鈉（NaIO）溶液和2% BSA去除菌株細胞表層蛋白、多糖和脂磷壁酸；無菌PBS洗滌離心收集菌體，并懸浮至10CFU/mL，接種0.5 mL至Caco-2細胞單層，37 ℃培養(yǎng)2 h，PBS洗滌3 次除去未黏附的菌株，加入0.15 mL胰酶細胞消化液，待細胞完全脫落后加入350 μL MEM完全培養(yǎng)基終止消化，收集菌懸液，采用平板菌落計數法測定乳桿菌活菌數。按照式（1）計算乳桿菌對Caco-2細胞的黏附率，分別去除菌株表層蛋白、多糖和脂磷壁酸等表面黏附素后，測得黏附率最低的即為該菌株的主要黏附素。

1.3.6 乳桿菌抑制病原菌黏附腸道的能力

取0.5 mL 2h10cell/mL Caco-2細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)至單層，無菌PBS（pH 7.2）洗滌2 次；接種菌株分別研究其通過排除、競爭和替代等方式抑制大腸桿菌和沙門菌黏附腸道的能力。

排除實驗：先接種0.5 mL 10CFU/mL乳桿菌菌懸液和0.5 mL 無菌PBS至24 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO培養(yǎng)1 h，無菌PBS洗滌3 次，除去未黏附的菌體；然后再分別加入0.5 mL 10CFU/mL的大腸桿菌或沙門菌和0.5 mL 無菌PBS，37 ℃、5% CO培養(yǎng)1 h。競爭實驗：同時接種0.5 mL 10CFU/mL乳桿菌菌懸液和大腸桿菌或沙門菌至24 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO培養(yǎng)2 h。替代實驗：先接種大腸桿菌或沙門菌和無菌PBS，37 ℃、5% CO培養(yǎng)1 h，PBS洗滌3 次，除去未黏附的病原菌，然后再接種乳桿菌和無菌PBS，37 ℃、5% CO培養(yǎng)1 h。

用無菌PBS分別洗滌上述培養(yǎng)后的細胞和病原菌的共培養(yǎng)物，除去未黏附的病原菌，每孔加入0.15 mL胰酶細胞消化液消化，待細胞完全脫落后加入350 μL MEM完全培養(yǎng)基終止消化，收集菌懸液，平板計數法于LB培養(yǎng)基中檢測大腸桿菌和沙門菌活菌數；每組做3 個平行實驗，根據式（2）計算乳桿菌對病原菌的黏附抑制率：

式中：為未接種菌株時，黏附在Caco-2細胞上的病原菌活菌數；為接種菌株后，黏附在Caco-2細胞上的病原菌活菌數。

1.3.7 乳桿菌表層蛋白的SDS-PAGE

利用LiCl提取乳桿菌表層蛋白后，4 ℃、8 000h離心10 min收集上清液，得到表層蛋白粗提液，用0.22 μm的無菌親水性微孔濾膜過濾，于4 ℃ 2 000 Da透析袋中進行透析，期間多次更換透析液，48 h后將懸濁液于4 ℃、8 000h離心10 min離心收集沉淀，并進行冷凍干燥，得到表層蛋白粗提物；用去離子水溶解粗提物，與4×電泳上樣buffer以3∶1（/）比例充分混勻，60 ℃金屬浴30 min后進行SDS-PAGE，然后用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色，再用乙酸脫色液脫色到出現清晰的蛋白質條帶。

1.3.8 消化應激對乳桿菌菌體形態(tài)的影響

將消化應激前后的乳桿菌1 000h離心5 min，吸去上清液，沿管壁緩慢加入1 mL 2.5%的戊二醛固定液，于4 ℃ 2.5%戊二醛中固定24 h后，用50 mmol/L PBS（pH 7.2）洗滌5 次，加入1%四氧化鋨于不透光環(huán)境中固定2 h，PBS（pH 7.2）洗滌3 次后，分別利用30%、50%、70%及90%的乙醇溶液脫水，然后用90%～100%的丙酮溶液脫水。將脫水后樣品包埋在Spurr低黏度包埋樹脂中，利用TEM進行觀察。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 乳桿菌的消化應激能力

將乳桿菌菌體依次懸浮于模擬唾液、模擬胃液及模擬腸液中，37 ℃分別培養(yǎng)2 h后，研究乳桿菌對模擬消化道的耐受情況，結果如表2所示。模擬唾液和模擬唾液-胃液的應激對實驗乳桿菌的存活率影響較小，活菌數下降均小于0.35（lg（CFU/mL）），甚至還促進了乳桿菌的生長；而模擬唾液-胃液-腸液的應激對乳桿菌的存活率影響較大，活菌數下降了0.96～5.04（lg（CFU/mL）），其中鼠李糖乳桿菌LYO，副干酪乳桿菌W125、m54、m38、m111，發(fā)酵乳桿菌57、146的活菌數下降較低且存活率顯著高于其他菌株（＜0.05），均分別大于7（lg（CFU/mL））和1.32%，表明這7 株乳桿菌具有較強的耐唾液-胃液-腸液應激的能力并能夠以大于10CFU/mL的活菌數到達腸道。

表2 乳桿菌的耐消化應激能力（n=3）Table 2 Digestive stress tolerance of Lactobacillus (n = 3)

2.2 乳桿菌的黏附能力

將耐消化應激能力較強的乳桿菌接種至腸道黏蛋白溶液和Caco-2單層細胞中，研究菌株對腸道黏蛋白和Caco-2細胞的黏附能力，結果見圖1。7 株乳桿菌的黏附率差異較大，其中副干酪乳桿菌W125、m111和發(fā)酵乳桿菌146對黏蛋白的黏附率分別為15.67%、8.75%、8.38%，顯著高于其他菌株（＜0.05）；副干酪乳桿菌W125、m111、m38和發(fā)酵乳桿菌146對Caco-2細胞的黏附率分別為11.47%、21.34%、10.51%及10.44%，顯著高于其他菌株（＜0.05）。

圖1 乳桿菌對黏蛋白（A）和Caco-2細胞（B）的黏附能力Fig.1 Adhesion capacity of Lactobacillus to mucins (A) and Caco-2 cells (B)

由圖2可知，實驗的乳桿菌對Caco-2細胞和黏蛋白之間的黏附呈顯著正相關（＜0.05），相關系數為0.64，因此后續(xù)僅通過菌株對Caco-2細胞的黏附實驗評價菌株對腸道的黏附能力。

圖2 乳桿菌對黏蛋白和Caco-2細胞黏附能力相關性分析Fig.2 Correlation between the adhesion capacities of Lactobacillus to mucins and Caco-2 cells

2.3 乳桿菌抑制腸道病原菌黏附能力

接種黏附能力較強的菌株至Caco-2細胞單層，研究菌株通過排除、競爭和替代的方式對大腸桿菌和沙門菌黏附腸道的抑制能力，結果如圖3所示。3 株乳桿菌均具有抑制大腸桿菌和沙門菌黏附腸道的能力，分別通過排除、競爭和替代方式對大腸桿菌和沙門菌的黏附抑制率均大于13.51%，其中發(fā)酵乳桿菌146通過排除、競爭和替代的方式對沙門菌黏附腸道的抑制率分別為94.14%、92.53%和95.61%，顯著高于其他菌株（＜0.05）；副干酪乳桿菌W125和m111通過競爭方式對大腸桿菌黏附腸道的抑制率顯著高于發(fā)酵乳桿菌146（＜0.05），而副干酪乳桿菌m111和發(fā)酵乳桿菌146則是通過替代方式對大腸桿菌黏附腸道的抑制率顯著高于副干酪乳桿菌W125（＜0.05）。

圖3 乳桿菌對病原菌的黏附抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of Lactobacillus on pathogen adhesion to Caco-2 cells

2.4 消化應激對乳桿菌黏附能力的影響

機體的消化應激會影響乳桿菌對腸上皮Caco-2細胞的黏附能力，菌株在依次經過模擬唾液、模擬胃液及模擬腸液應激后的黏附率見圖4。模擬唾液-胃液-腸液應激顯著降低了副干酪乳桿菌W125和發(fā)酵乳桿菌146的黏附能力（＜0.05），黏附率分別由11.46%和10.43%下降到3.09%和7.35%；但顯著增加了副干酪乳桿菌m111的黏附能力（＜0.05），黏附率由17.60%增加到30.45%。

圖4 消化應激對乳桿菌黏附能力的影響Fig.4 Effect of digestive stress on adhesion capacity of Lactobacillus

2.5 消化應激對乳桿菌表面黏附素的影響

利用LiCl、NaIO和BSA分別去除菌株細胞的非共價結合表層蛋白、表面多糖和抑制菌株細胞的脂磷壁酸研究消化應激對副干酪乳桿菌m111表面黏附素的影響。由圖5可知，副干酪乳桿菌m111在消化應激前，經LiCl處理后的黏附能力顯著低于未經處理的對照組及NaIO和BSA處理組（＜0.05），表明表層蛋白是菌株m111表面主要的黏附素；當菌株m111經過模擬唾液-胃液-腸液應激后，LiCl和NaIO處理后的黏附能力顯著低于BSA處理（＜0.05），表明菌株m111經過消化應激后，表層蛋白和多糖是其表面主要的黏附素。

圖5 消化應激對副干酪乳桿菌m111表面黏附素的影響Fig.5 Effect of digestive stress on surface adhesin of L.paracasei m111

2.6 消化應激對菌株表層蛋白表達的影響

采用BCA試劑盒測定提取的菌株表層蛋白含量，同時利用SDS-PAGE研究消化應激對其表達的影響。由表3可知，在消化應激前后，副干酪乳桿菌m111表層蛋白粗提物中均能檢測到蛋白，表明菌株表面存在蛋白類物質；在依次經過模擬唾液-胃液消化應激后，菌株表層蛋白粗提物中蛋白質量濃度為0.70 mg/mL，是未消化應激的表層蛋白粗提物的1.56 倍（＜0.05）；依次經過模擬唾液-胃液-腸液應激后，菌株表層蛋白粗提物中蛋白含量較模擬唾液-胃液應激和未經消化應激顯著降低（＜0.05）。

表3 副干酪乳桿菌m111表層蛋白含量Table 3 Content of surface protein in L.paracasei m111

由圖6可知，在消化應激前，副干酪乳桿菌m111在15～120 kDa范圍內存在條帶，表明菌株攜帶表層蛋白；在模擬唾液-胃液應激后，蛋白條帶的顏色在36～100 kDa范圍內加深，同時在14 kDa出現了新的條帶，表明模擬唾液-胃液的應激增加了菌株m111的蛋白表達；而經過模擬唾液-胃液-腸液應激后，在15～120 kDa范圍內未檢測到蛋白條帶，14 kDa處的蛋白條帶顏色變淺。

圖6 消化應激對副干酪乳桿菌m111表層蛋白表達的影響Fig.6 Effect of digestive stress on surface protein expression in L.paracasei m111

2.7 消化應激對乳桿菌細胞形態(tài)的影響

通過TEM觀察副干酪乳桿菌m111在依次經過模擬唾液-胃液-腸液應激后的細胞形態(tài)變化，并利用TEM粒徑統(tǒng)計軟件分析消化應激對菌株表層物質厚度的影響。由圖7A、B可知，消化應激前后副干酪乳桿菌m111的細胞形態(tài)均為長梭形和圓潤的桿狀；由圖7C、D及表4可知，消化應激前后菌株m111的表層厚度無顯著影響（＞0.05），表明消化應激對菌株的形態(tài)及表層物質的厚度影響較小。

圖7 消化應激對副干酪乳桿菌m111表層物質厚度的影響Fig.7 Effect of digestive stress on the thickness of surface layer in L.paracasei m111

表4 消化應激后副干酪乳桿菌m111細胞的表層物質厚度Table 4 Thickness of surface layer in L.paracasei m111 before and after digestive stress

3 討 論

乳桿菌必須能夠經受住消化道的應激，才能夠到達腸道并發(fā)揮有益作用，而乳桿菌在經過消化道時，會激發(fā)各種保護機制以抵抗胃酸性環(huán)境、腸內膽汁等不良環(huán)境。實驗乳桿菌在暴露于模擬唾液時，均能保持較高的活性，與Bove等的研究結果相似，可能是由于實驗菌株的基因被口腔應激顯著上調所致；研究還發(fā)現，鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌的存活率均高于100%，表明在短時間內（5 min），鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌對口腔中的溶菌酶具有較強的耐受能力；當經過模擬胃部消化時，大部分實驗乳桿菌均能保持較高的活性，甚至有些菌株還得到了生長，這與Mangia等的研究結果相似，可能是由于實驗乳桿菌在遭受胃部不良環(huán)境的脅迫后能夠通過調動自身質子移位膜ATP酶、谷氨酸脫羧酶、精氨酸脫氨酶和脲酶等改善細胞內外的pH值平衡進而維持其活性；而Bove及Ouwehand等發(fā)現，當乳桿菌以牛奶或多糖為載體進入腸道時，能提高其在唾液和胃液中的存活率，表明牛奶等載體能增強乳桿菌對消化道的應激能力。當實驗乳桿菌依次經過模擬唾液-胃液-腸液消化應激時，大部分實驗菌株的存活率顯著下降（＜0.05），表明連續(xù)的消化過程中胃蛋白酶、pH值、胰酶及膽鹽等不良環(huán)境的應激對實驗菌株活性影響較大。

乳桿菌能夠通過其表面的3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）等兼職功能蛋白與腸道中的黏蛋白相結合實現其對腸道的黏附，而其對腸Caco-2細胞的黏附不僅可以通過GAPDH等兼職功能蛋白，還可以通過SlpA等表面蛋白及胞外多糖等物質實現；因此，不同的黏附素及其黏附機制會使乳桿菌對腸道黏蛋白和腸Caco-2細胞的黏附能力產生差異；同時，表面蛋白等黏附素的數量、組成及其功能的不同也會造成同一種屬不同菌株對Caco-2細胞黏附能力的差異。乳桿菌表層蛋白在其抑制病原菌黏附腸道的過程中發(fā)揮著重要作用，添加一定量的表層蛋白能提高菌株抑制病原菌黏附的能力；因此，表層蛋白含量的差異可能是副干酪乳桿菌m111抑制大腸桿菌黏附腸道的能力顯著高于副干酪乳桿菌W125的重要因素（＜0.05）。

通過SDS-PAGE發(fā)現，模擬唾液-胃液應激增加了菌株m111在36～100 kDa處的蛋白表達，而大部分乳桿菌表層蛋白分子質量在25～71 kDa之間，表明模擬唾液-胃液的應激可能通過刺激菌株m111分泌更多的蛋白至胞外維持菌株的黏附能力，同時，在14 kDa檢測到新的蛋白條帶；而在模擬唾液-胃液-腸液的連續(xù)消化應激后，菌株在14 kDa的蛋白條帶顏色變淺，15～120 kDa之間的蛋白條帶消失，蛋白質量濃度由0.70 mg/mL顯著降低至0.23 mg/mL，表明連續(xù)的消化應激不僅會將菌株m111的表層蛋白降解為更小分子的蛋白，而且還會顯著降低蛋白含量（＜0.05），進而降低乳桿菌黏附腸道的能力；同時，也容易減弱乳桿菌與大腸桿菌競爭腸細胞表面黏附位點的能力及降低乳桿菌表面物質水解大腸桿菌細胞壁肽聚糖的能力，導致乳桿菌抑制病原菌黏附腸道能力的下降。雖然連續(xù)消化應激顯著降低了菌株m111表層蛋白的含量（＜0.05），但同時也可能刺激了菌株m111通過啟動自身的群體感應系統(tǒng)等自我保護機制分泌多糖等物質至細胞外增強其對消化應激的耐受性，從而維持了菌株表層物質的厚度，使其未發(fā)生顯著變化（＞0.05），其主要黏附素也由應激前的表層蛋白變?yōu)閼ず蟮牡鞍缀投嗵?；這些物質也有助于改善菌株黏附腸道的能力，其黏附能力顯著高于未消化應激（＜0.05），而降解產生的小分子蛋白（14 kDa）與分泌的多糖是否有利于菌株抑制病原菌黏附腸道能力提升還需進一步研究。

4 結 論

副干酪乳桿菌W125、m111和發(fā)酵乳桿菌146具有較強的耐唾液-胃液-腸液消化應激和腸道黏附能力，并可以通過排除、競爭和替代的方式抑制大腸桿菌和沙門菌對腸道的黏附；消化應激顯著降低了菌株W125和146的黏附能力（＜0.05），但顯著提高了菌株m111對腸道的黏附能力（＜0.05）。因此，副干酪乳桿菌m111是一株潛在的具有較高應用價值的益生菌。該研究為高耐受消化應激和高腸道黏附的益生乳酸菌的篩選提供參考，也為消化應激對乳桿菌黏附腸道的影響機制研究提供理論依據。