微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸風(fēng)味形成及變化的影響

陳援援，馬凱華，牛文秀，孫慧娟，任小青，馬儷珍*

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

風(fēng)干腸作為一種傳統(tǒng)的發(fā)酵肉制品，因其營養(yǎng)價值高、風(fēng)味獨特而深受消費(fèi)者的喜愛。傳統(tǒng)風(fēng)干腸的制作大多采用自然發(fā)酵的方式，在自然發(fā)酵過程中，風(fēng)干腸中的微生物主要來源于原料肉、輔料和周圍環(huán)境形成特定的微生物群落，但自然發(fā)酵肉制品的質(zhì)量可能會隨著生產(chǎn)環(huán)境中微生物群落的變化而發(fā)生變化。為了規(guī)范生產(chǎn)工藝，采用接種發(fā)酵劑的方法，可以確保產(chǎn)品獨特風(fēng)味的形成，同時提高產(chǎn)品的品質(zhì)和安全。目前，在發(fā)酵肉制品中常添加的發(fā)酵劑有植物乳桿菌、木糖葡萄球菌、戊糖片球菌、清酒乳桿菌等。肉制品風(fēng)味和滋味的形成不僅來源于加入的調(diào)味料，還來源于內(nèi)源性酶和微生物酶作用于碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的反應(yīng)結(jié)果。據(jù)報道，蛋白質(zhì)經(jīng)內(nèi)源性蛋白酶和微生物酶代謝產(chǎn)生的低分子質(zhì)量肽（＜3 kDa）和游離氨基酸直接或間接地促進(jìn)了干發(fā)酵香腸中風(fēng)味化合物的形成。研究表明一些乳酸菌菌株（如清酒乳桿菌和乳酸片球菌）具有抗氧化能力，因為它們具有抗氧化酶、細(xì)胞表面蛋白、多糖和胞外分泌物，能抑制脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過度氧化，減少與酸敗相關(guān)的揮發(fā)性化合物的含量。曹辰辰等采用10CFU/g接種量，按照1∶1接種植物乳桿菌CD101和模仿葡萄球菌NJ201進(jìn)行發(fā)酵，制作發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)該功能性發(fā)酵劑能夠抑制產(chǎn)品的脂肪氧化和蛋白氧化，顯著增加揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類。Hu Yingying等研究表明，彎曲乳桿菌、戊糖片球菌、木糖葡萄球菌在干香腸發(fā)酵過程中對香腸的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地的形成起重要作用。因此，接種適宜的發(fā)酵劑對確保發(fā)酵肉制品的感官特性、品質(zhì)和安全具有至關(guān)重要的作用。

本實驗在前期研究優(yōu)選出的外源添加物發(fā)酵牛骨調(diào)味基料復(fù)合抗氧化劑（fermented beef flavorings and compound antioxidant，F(xiàn)BFA）和風(fēng)干腸基本加工工藝的基礎(chǔ)上，再接種3 種商業(yè)發(fā)酵劑（SHI-59、WBL-45、PRO-MIX5），以不接種發(fā)酵劑為空白對照組（CK），在風(fēng)干6、12 d取樣測定4 組風(fēng)干腸樣品的游離氨基酸含量，同時采用電子鼻、電子舌和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀對風(fēng)干腸成品（12 d）的風(fēng)味變化進(jìn)行測定。研究FBFA與乳酸菌協(xié)同作用對風(fēng)干腸風(fēng)味、滋味、游離氨基酸及其呈味貢獻(xiàn)的影響，旨在為我國風(fēng)干腸生產(chǎn)中風(fēng)味鑒定以及品質(zhì)評價提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考，有助于風(fēng)干腸的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻排酸成熟24 h的三元白豬（體質(zhì)量101 kg，飼喂時間150 d）豬后腿肉、豬肥膘，購自天津二商迎賓肉類食品有限公司；食鹽、白砂糖、曲酒、味精、醬油天津市紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場；茶多酚、迷迭香 豫中生物科技有限公司；VE、VC、VB蘇州佰億鑫生物科技有限公司；SHI-59（木糖葡萄球菌、戊糖片球菌、植物乳桿菌）、WBL-45（木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、清酒乳桿菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌、清酒乳桿菌、類植物乳桿菌） 意大利薩科公司；膠原蛋白腸衣（牛二層皮提取、孔徑30 mm） 神冠控股（集團(tuán)）有限公司；2-甲基3-庚酮（分析純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；65 μm PDMS/DVB萃取頭 美國Supelco公司；20 mL頂空進(jìn)樣瓶 多文醫(yī)療器材有限公司；Hamilton微量進(jìn)樣針（10 mL） 天津市琛航科技儀器有限公司；HeraclesII超快速氣相電子鼻 法國Alpha M.O.S公司；TS-5000Z電子舌 日本INSENT公司；AS220R2分析天平波蘭RADWAG公司；S-43000氨基酸分析儀 德國SYKAM公司；CLIMACELL恒溫恒濕箱 艾力特國際貿(mào)易有限公司；BVBJ-30F真空攪拌機(jī) 浙江嘉興艾博實業(yè)有限公司；XZ-5L灌腸機(jī) 廣州旭眾食品機(jī)械有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 FBFA的制備

FBFA是由發(fā)酵牛骨調(diào)味基料（fermented beef flavorings，F(xiàn)BF）和復(fù)合抗氧化劑（compound antioxidants，CA）復(fù)配而成。FBF制備參照樊曉盼等的方法，其添加量為肉質(zhì)量的2%，CA添加量按照熊鳳嬌等的方法，即茶多酚、迷迭香、VE和抗壞血酸鈉添加量（按肉質(zhì)量）分別為60.14 、60.11、60.00 mg/kg和60.00 mg/kg。

1.3.2 風(fēng)干腸的制作

腌制：將豬后腿瘦肉剔除筋膜、脂肪后，用絞肉機(jī)絞碎（篩板孔徑8 mm），背膘用切絲機(jī)切碎，按照肥瘦比1∶9的比例放入真空攪拌機(jī)中，加入占肉總質(zhì)量1.8%的食鹽、0.01%的亞硝酸鈉（事先用少量水溶解）和抗壞血酸鈉0.55 g/kg，真空攪拌5 min，取出后放入不銹鋼盆中，緊貼肉表面蓋一層保鮮膜，于0～4 ℃冷庫中腌制24 h。

拌餡：將腌制好的肉再次倒入真空攪拌機(jī)中，依次加入4%糖、1.5%曲酒、0.2%味精、0.3%生抽、10%水，微生物發(fā)酵劑添加量為10 g/100 kg（按肉質(zhì)量計，CK組不加），真空攪拌8 min。

灌腸：將制好的肉餡灌入膠原蛋白腸衣中，結(jié)扎（每節(jié)13～15 cm）、排氣。

風(fēng)干：將灌制好的肉腸放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中風(fēng)干12 d，恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、相對濕度和風(fēng)速參數(shù)如表1所示。

表1 風(fēng)干腸工藝參數(shù)Table 1 Processing parameters for production of air-dried sausage

1.3.3 實驗設(shè)計

在風(fēng)干腸加工的基礎(chǔ)配方基礎(chǔ)上，實驗設(shè)計4 組，每組均加入FBFA（按照1.3.1節(jié)），CK組不接種，其他3 組（SHI組、WBL組、PRO組）分別接種SHI-59、WBL-45、PRO-MIX5微生物發(fā)酵劑添加量為10 g/100 kg（活菌數(shù)分別為10、10、10CFU/g）。分別在風(fēng)干6、12 d取樣測定4 組風(fēng)干腸樣品的游離氨基酸含量，并采用HeraclesII超快速氣相電子鼻、電子舌和GC-MS對風(fēng)干腸12 d的氣味、滋味和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量進(jìn)行測定。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 游離氨基酸測定

取5 g攪碎且經(jīng)真空冷凍干燥后的樣品于離心管中，加入20 mL磺基水楊酸溶液（質(zhì)量濃度3 g/100 mL），均質(zhì)1 min，4 ℃、1 000h離心15 min，向上清液中加入2 mL正己烷，用旋渦振蕩器振蕩搖勻，用0.02 mol/L鹽酸溶液定容至50 mL，分層后取水相用0.22 μm濾膜過濾，用氨基酸分析儀進(jìn)行檢測。

采用滋味強(qiáng)度值（taste activity value，TAV）評價單個游離氨基酸對風(fēng)干腸滋味的貢獻(xiàn)，TAV計算如式（1）所示：

式中：為呈味化合物的含量/（mg/100 g）；為呈味化合物的滋味閾值/（mg/100 g）。

TAV大于1，認(rèn)為該物質(zhì)對滋味有貢獻(xiàn)，比值越大，滋味貢獻(xiàn)越高；TAV小于1，認(rèn)為該物質(zhì)對滋味貢獻(xiàn)小，呈味作用不明顯。

1.3.4.2 HeraclesII超快速電子鼻分析

將4 組風(fēng)干腸樣品絞碎，稱取4 g樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶，蓋緊瓶蓋，將樣品放入50 ℃的恒溫水浴鍋中水浴24 min。用10 mL進(jìn)樣針吸取頂空瓶中5 mL氣體，手動進(jìn)樣注射入HeraclesII超快速電子鼻中，儀器分析參數(shù)，進(jìn)樣口溫度200 ℃；進(jìn)樣持續(xù)時間40 s；捕集阱初始溫度40 ℃；捕集阱分流速度10 mL/min；捕集阱最終溫度200 ℃；柱溫的初始溫度50 ℃；柱溫的程序升溫方式0.5 ℃/min-100 ℃、1 ℃/min-200 ℃；采集時間140 s；火焰離子化檢測器溫度260 ℃。

1.3.4.3 電子舌分析

將樣品絞碎，待溫度恢復(fù)至室溫后，分別稱取30 g樣品至于250 mL燒杯中，添加150 mL純凈水，攪拌均勻，置于超聲波清洗機(jī)中超聲5 min，1 000h離心5 min，濾紙過濾，取上清液測試。傳感器介紹如表2所示。

表2 傳感器介紹Table 2 Performance description of electronic tongue sensors

1.3.4.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS檢測

參照雷虹的方法并修改，稱取4 g絞碎的風(fēng)干腸樣品于20 mL的頂空瓶中，加入5 mL的飽和氯化鈉溶液和2 μL的2-甲基-3-庚酮溶液（0.816 μg/μL），放入自動進(jìn)樣盤上進(jìn)行自動進(jìn)樣，將老化的萃取頭插入樣品瓶使石英纖維頭暴露于樣品上部空間，在60 ℃吸附45 min后拔出，萃取頭在GC進(jìn)樣口250 ℃解吸附4 min。

GC條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 mh 0.25 mm，0.25 μm），載氣為He，載氣流速1.0 mL/min，傳輸線溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，自動進(jìn)樣；升溫程序：45 ℃保持2 min，以6 ℃/min升溫到230 ℃，保持5 min。

MS條件：離子源溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍/30～400；溶劑延遲時間為1 min。

風(fēng)味化合物相對于2-甲基-3庚酮的含量，按式（2）計算：

式中：為所測定揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；A為測定揮發(fā)性化合物的峰面積/（AUgmin）；為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度（0.816 μg/μL）；為內(nèi)標(biāo)物的峰面積/（AUgmin）；為內(nèi)標(biāo)物的進(jìn)樣量/μL；為所測定樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4.5 氣味活度值（odor activity value，OAV）測定

OAV計算參考張凱華等的方法，按式（3）計算：

式中：為實驗測定計算所得揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；為同物質(zhì)在水中的察覺閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 19.0軟件下的Duncan進(jìn)行顯著性分析，Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸在風(fēng)干6、12 d游離氨基酸組成的影響

蛋白質(zhì)水解是風(fēng)干腸成熟過程中發(fā)生的主要機(jī)制之一，微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸在風(fēng)干6、12 d的游離氨基酸組成及相對含量如表3所示。4 個風(fēng)干腸樣品中共檢測出25 種游離氨基酸，包括8 種必需氨基酸，9 種非必需氨基酸，8 種非蛋白氨基酸。與風(fēng)干6 d游離氨基酸種類和含量比較，風(fēng)干12 d CK組的蛋氨酸、色氨酸、?；撬?、尿素有所下降，SHI、WBL組的蛋氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、磷酸絲氨酸、?；撬?、-氨基丁酸、-氨基丁酸有所下降。有報道表明，游離氨基酸是美拉德反應(yīng)和Strecker降解的中間產(chǎn)物，美拉德反應(yīng)和Strecker降解會導(dǎo)致游離氨基酸的減少。到風(fēng)干12 d，4 組風(fēng)干腸樣品中均檢測出含量豐富的特征氨基酸：纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸、?；撬岷图‰?，非必需氨基酸總量、非蛋白氨基酸總量和游離氨基酸總量均顯著高于風(fēng)干6 d（＜0.05），說明隨著風(fēng)干時間的延長，氨基酸總量在不斷增多，大量研究表明，成熟階段氨基酸含量的增加，主要是由于微生物酶活性在干發(fā)酵香腸加工后期起作用，而導(dǎo)致大量氨基酸釋放。到風(fēng)干12 d，4 組風(fēng)干腸游離氨基酸總量大小關(guān)系為PRO（2 655.18 mg/100 g）＞SHI（2 409.78 mg/100 g）＞W(wǎng)BL（2 317.74 mg/100 g）＞CK（2 137.82 mg/100 g），PRO組顯著高于其余3 組，主要是因為PRO-MIX5發(fā)酵劑中含有清酒乳桿菌，據(jù)報道，清酒乳桿菌具有活性較強(qiáng)的二肽酶、三肽酶、氨基肽酶、x-脯氨酰二肽基肽酶和精氨酸氨基肽酶等外肽酶，能作用蛋白質(zhì)產(chǎn)生大量的游離氨基酸，主要是亮氨酸和丙氨酸。CK組游離氨基酸總量最低，由此可以看出，接種發(fā)酵劑可以顯著提高風(fēng)干腸中的游離氨基酸總量（＜0.05）。據(jù)報道，凝固酶陰性葡萄球菌，如木糖葡萄球菌和彎曲乳桿菌，具有重要的蛋白水解活性和轉(zhuǎn)化氨基酸為芳香化合物的活性。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和葡萄球菌是歐洲干發(fā)酵香腸中的典型菌種，在酸化、反硝化、脂解和蛋白質(zhì)水解過程中是最活躍的微生物，尿素、鳥氨酸是由精氨酸在精氨酸酶作用下水解產(chǎn)生，-谷氨酸脫羧生成中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)-氨基丁酸，?；撬嵩谀X組織中較多，可能是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在功能型飲料如紅牛中含有。

表3 不同微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸在風(fēng)干6、12 d游離氨基酸組成的影響Table 3 Effects of different microbial starters on free amino acid composition of air-dried sausage on the 6th and 12th day of air drying mg/100 g

續(xù)表3

2.2 微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸在風(fēng)干6、12 d的游離氨基酸味覺特征及TAV的影響

游離氨基酸不僅增加風(fēng)干腸的營養(yǎng)價值，對風(fēng)干腸的滋味也有貢獻(xiàn)。不同游離氨基酸有不同的呈味閾值，一般閾值越小，代表其對滋味的貢獻(xiàn)越大，所以不能用游離氨基酸的含量評價其對滋味貢獻(xiàn)的大小。游離氨基酸的TAV大于1，認(rèn)為該物質(zhì)對滋味有貢獻(xiàn)，比值越大，滋味貢獻(xiàn)越高。根據(jù)味覺特征將風(fēng)干腸中的游離氨基酸分為3 類，包括2 種鮮味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、5 種甜味氨基酸（蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸）和10 種苦味氨基酸（纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸）。由表4可知，4 組風(fēng)干腸在風(fēng)干6、12 d鮮味氨基酸雖然只有2 種，但因為谷氨酸的TAV（30 mg/100 g）大，所以對風(fēng)干腸鮮味貢獻(xiàn)很大，這也是風(fēng)干腸味道鮮美的原因。4 組風(fēng)干腸鮮味氨基酸的TAV總和最高，其次是苦味，纈氨酸和組氨酸的TAV＞1，說明對苦味的貢獻(xiàn)大，其余的苦味氨基酸TAV＜1，Lioe等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)苦味氨基酸TAV＜1時，對其他氨基酸的鮮味和甜味有增強(qiáng)作用。甜味氨基酸的TAV總和最低，其中丙氨酸對4 組風(fēng)干腸甜味的貢獻(xiàn)最高。隨著風(fēng)干時間的延長，4 組風(fēng)干腸呈味氨基酸TAV總和表現(xiàn)為增大的趨勢，說明風(fēng)干工藝有利于風(fēng)干腸滋味物質(zhì)的積累，4 組風(fēng)干腸呈現(xiàn)出相似且統(tǒng)一的呈味特點。其中接菌組的鮮味、苦味、甜味TAV總和大于CK組，PRO組鮮味強(qiáng)度值最大，WBL、SHI組次之（圖1），表明微生物發(fā)酵劑有利于風(fēng)干腸滋味物質(zhì)的形成，尤其是木糖葡萄球菌與乳酸菌聯(lián)合使用可促進(jìn)發(fā)酵肉制品中游離氨基酸的富集。

表4 不同微生物發(fā)酵劑風(fēng)干腸在風(fēng)干6、12 d的游離氨基酸味覺特征及TAVTable 4 Taste characteristics of free amino acids and TAV values of air-dried sausages produced with different microbial starters on the 6th and 12th day of air drying

圖1 風(fēng)干腸在風(fēng)干6、12 d呈味氨基酸總量組成模式分析Fig.1 Analysis of total amino acid composition pattern of air-dried sausage on the 6th and 12th day after air drying

2.3 微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸的有效味覺影響

如圖2A所示，主成分分析（principal component analysis，PCA）中PC1、PC2分別解釋了總方差的61.983%和34.950%。通過對4 組風(fēng)干腸樣品味覺指標(biāo)進(jìn)行PCA發(fā)現(xiàn)，苦味對PC1的貢獻(xiàn)率較大，豐富性對PC2的貢獻(xiàn)率較大，4 組風(fēng)干腸樣品在味道上均存在一定差異，但主要表現(xiàn)在苦味和豐富性這兩個味覺指標(biāo)上，其中SHI組與WBL組是最接近的；PRO組樣品豐富性上與其他樣品差異較大，而在苦味及苦味回味、鮮味和咸味上與SHI組和WBL組接近。CK樣品由于在苦味及豐富性上與其他樣品差異明顯，因此PCA圖上明顯被區(qū)分開來。

圖2B為4 組風(fēng)干腸樣品電子舌有效味覺分析的雷達(dá)圖。4 組風(fēng)干腸的有效味覺指標(biāo)主要表現(xiàn)在苦味、澀味、苦味回味、鮮味、豐富性、咸味這6 個味覺指標(biāo)上，4 組風(fēng)干腸在鮮味、咸味、豐富性和苦味傳感器上的響應(yīng)值最大，說明鮮味、咸味、豐富性和苦味是風(fēng)干腸有效且重要的味覺指標(biāo)，在澀味和苦味回味傳感器上的響應(yīng)值最小接近無味點。CK組是4 個樣品中苦味、苦味回味最大的樣品，SHI組、WBL組、PRO組風(fēng)干腸在苦味和苦味回味方面比較接近，這里的苦味主要是苦味氨基酸和加入的調(diào)味料形成。4 組風(fēng)干腸在鮮味上差異較小，說明微生物發(fā)酵劑對鮮味的影響較小。豐富性是鮮味的回味，用于反映鮮味的持久性，又稱為鮮味持久度。PRO組在豐富性方面高于其他樣品，SHI組和WBL組比較接近，其中CK豐富性最小，由此可以看出，接種發(fā)酵劑的3 組風(fēng)干腸的豐富性均高于CK組，是由于乳酸菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸使豐富性增大。

圖2 不同微生物發(fā)酵劑風(fēng)干腸成品基于電子舌的PCA（A）和有效味覺指標(biāo)（B）分析Fig.2 PCA (A) and effective taste index (B) analysis of air-dried sausages produced with different microbial starters based on electronic tongue data

2.4 微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA的影響

由圖3可知，PCA的識別指數(shù)為89，說明區(qū)分有效。PC1和PC2分別占總方差的79.617%和16.030%，兩者累計方差貢獻(xiàn)率為95.647%，表明該圖能反映出95.647%的樣品氣味數(shù)據(jù)。由圖3可知，4 組樣品不存在交叉，說明4 組樣品在氣味上存在差異，其中SHI組和WBL組之間的相對距離較近，說明兩者在氣味上比較相似，但又有各自的特征風(fēng)味物質(zhì)將兩組樣品區(qū)分開，PRO組、CK組存在各自明顯的特征風(fēng)味物質(zhì)，所以兩者之間的相對距離、兩者與SHI組、WBL組之間的相對距離均較大，至于是哪幾種特征風(fēng)味物質(zhì)引起的還需進(jìn)一步的GC-MS分析。

圖3 基于電子鼻檢測不同微生物發(fā)酵劑風(fēng)干腸成品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCAFig.3 PCA of volatile flavor compounds in air-dried sausages produced with different microbial starters based on electronic nose data

2.5 基于GC-MS分析微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

發(fā)酵肉制品的風(fēng)味物質(zhì)主要來源于脂肪和蛋白質(zhì)的氧化或降解，并取決于原料、加工條件和微生物菌群變化。如表5所示，4 組風(fēng)干腸在風(fēng)干12 d共檢測出9 大類130 種風(fēng)味物質(zhì)，醛類22 種、醇類20 種、醚類3 種、酮類11 種、酸類17 種、酚類3 種、酯類33 種、烴類4 種、雜環(huán)化合物類7 種，其中酯類、醛類、醇類、酸類和雜環(huán)化合物類是風(fēng)干腸常見的主要風(fēng)味物質(zhì)。CK、SHI、WBL、PRO組中檢測到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分別為80、79、76 種和83 種，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總量分別為11 895.69、10 923.73、5 679.61、5 902.35 μg/kg，4 組風(fēng)干腸樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量各不相同，這可能與發(fā)酵過程中前體物的分解代謝有關(guān)，也與發(fā)酵菌株的類型有關(guān)。PRO組的風(fēng)味物質(zhì)種類最多，說明微生物發(fā)酵劑的種類對風(fēng)干腸風(fēng)味物質(zhì)的影響較大，與蔣肇樣等的研究結(jié)果一致。

2.5.1 醛類物質(zhì)分析

醛類主要來源于脂質(zhì)的氧化和降解，具有較低的閾值，通常能增強(qiáng)肉制品的風(fēng)味。由表5可知，CK、SHI、WBL、PRO組風(fēng)干腸成品中檢測到醛類物質(zhì)分別有14、17、12、10 種，含量大小關(guān)系為CK（2 083.12 μg/kg）＞SHI（1 857.73 μg/kg）＞W(wǎng)BL（574.91 μg/kg）＞PRO（478.50 μg/kg），可以看出CK組中己醛、壬醛的含量較高（＜0.05），這些物質(zhì)主要來源于不飽和脂肪酸的氧化，接菌組的醛類物質(zhì)含量顯著低于CK組，PRO組的醛類物質(zhì)含量最低，主要是該組中接種了清酒乳桿菌，研究表明清酒乳桿菌產(chǎn)生的血紅素依賴性過氧化氫酶具有抗氧化能力，能防止發(fā)酵肉制品的品質(zhì)惡化，如酸敗。此外，Wen Rongxin等研究表明從發(fā)酵牛肉干中分離出的清酒乳桿菌 BL6、乳酸片球菌BP2和發(fā)酵乳桿菌 BL11可抑制發(fā)酵牛肉干的脂質(zhì)氧化，從而減少脂肪族醛、醇、酮和碳?xì)浠衔锏戎|(zhì)氧化次生產(chǎn)物的形成，從而提高風(fēng)味。總體而言，接菌組風(fēng)干腸中脂質(zhì)自氧化化合物總含量較低，這可能與乳酸菌菌株的抗氧化活性有關(guān)。

2.5.2 醇類、酮類物質(zhì)分析

由表5可知，4 組風(fēng)干腸樣品中共檢測出30 種醇、11 種酮，含量最高的醇和酮類物質(zhì)分別是1-辛烯-3-醇和乙偶姻（3-羥基-2-丁酮），1-辛烯-3-醇具有典型的蘑菇氣味和較低的氣味閾值，被認(rèn)為是發(fā)酵肉制品中重要的香氣貢獻(xiàn)者。乙偶姻在PRO（含有清酒乳桿菌）中的含量最高，這與Chen Qian等的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)接種清酒乳桿菌可以提高發(fā)酵香腸中3-羥基-2-丁酮的含量。風(fēng)干腸中醇的生物合成涉及許多代謝途徑，如甲基酮還原、氨基酸代謝和脂肪氧化。一些醛可以通過乙醇脫氫酶的活性轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇。微生物脂肪酸的β氧化途徑也能轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇和酮類物質(zhì)，如脂肪酸被某些酶轉(zhuǎn)化為-酮酰CoA，然后-酮酰CoA被硫酯酶轉(zhuǎn)化為-酮酸。最后，通過-酮酸的脫羧反應(yīng)生成甲基酮。1-辛烯-3-醇也由脂肪氧化為相應(yīng)的-酮酸生產(chǎn)，其在SHI組中的含量最高，說明該菌這方面的酶活力較高。甲基支鏈醇，如2-甲基-1-丙醇在3 組接菌風(fēng)干腸中均被檢出，可能是由某些氨基酸（纈氨酸）轉(zhuǎn)化而來，這些氨基酸是由風(fēng)干腸中的乳酸菌和酵母菌代謝產(chǎn)生。苯乙醇是由芳香族氨基酸合成，在接菌組風(fēng)干腸中含量較高。3-甲基-1-丁醇由支鏈氨基酸合成，在SHI-59中含量最高。2-庚酮、2-辛酮分別在PRO組和WBL組中被檢出，其形成是由于葡萄球菌中存在的不完全β氧化途徑所導(dǎo)致。同時，一些化合物可能有不止一種來源，或者是物質(zhì)之間二次反應(yīng)的結(jié)果。在4 組風(fēng)干腸中，這些化合物的含量差異可能是由于乳酸菌菌株對應(yīng)的相關(guān)酶活性不同所致。

2.5.3 酸類物質(zhì)分析

酸類物質(zhì)可以作為影響味道或氣味的化合物前體，短鏈脂肪酸（C數(shù)小于6）在風(fēng)味發(fā)展中具有更大的影響，由于非常強(qiáng)烈的氣味和其較低的閾值，在大多數(shù)樣品中被檢測到。由表5可知，4 組風(fēng)干腸中共檢測出17 種酸類物質(zhì)，醋酸、丁酸、己酸、辛酸和癸酸在4 組風(fēng)干腸樣品中含量較豐富，Hu Yingying、Marco等描述這些揮發(fā)性化合物為發(fā)酵肉制品香氣中的重要成分。CK、SHI、WBL、PRO組風(fēng)干腸中酸類物質(zhì)分別占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的47.67%、40.79%、44.63%、53.00%，可以看出酸類物質(zhì)在風(fēng)干腸中占主要部分，尤其在PRO組中的占比最高。

表5 不同微生物發(fā)酵劑風(fēng)干腸成品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Table 5 Contents of volatile flavor compounds in air-dried sausages produced with different microbial starters

2.5.4 酯類物質(zhì)分析

酯類物質(zhì)是芳香類化合物，具有非常低的氣味檢測閾值，在干發(fā)酵腸中短鏈酸形成的酯通常會帶來水果味，而長鏈酸形成的酯則會帶來脂肪味。CK、SHI、WBL、PRO組風(fēng)干腸酯類在總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量的占比分別為19.13%、20.6%、24.13%、21.71%，接菌組中酯類物質(zhì)占比較高，說明接種微生物發(fā)酵劑有利于風(fēng)干腸中酯類風(fēng)味物質(zhì)的形成，其中WBL組占比最高，這與感官評定表明WBL組有較好的風(fēng)味結(jié)果一致。4 組風(fēng)干腸中有代表性的酯類物質(zhì)為己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯。鑒定出的許多酯類是乙基酯類，它們被認(rèn)為是通過增加水果香味和掩蓋腐臭氣味，是發(fā)酵香腸獲得適當(dāng)香氣的必要條件。丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯的形成來自葡萄球菌的酯酶活性。

2.5.5 含氮含硫及雜環(huán)化合物分析

硫和氮化合物，如硫醇、噻唑、噻唑啉、吡咯和硫化物，被認(rèn)為是肉類風(fēng)味的主要貢獻(xiàn)者，在肉制品中，盡管這些化合物的濃度很低，但檢測閾值也低，所以它們對肉類香氣的形成影響較大。樣品中檢測到的雜環(huán)化合物包括吡嗪、呋喃及其衍生物。這些化合物通常由美拉德反應(yīng)或氨基酸分解形成。4 組風(fēng)干腸中有代表性的雜環(huán)化合物為2,6-二甲基-吡嗪具有咖啡和炒花生的氣味。此外，接菌組風(fēng)干腸樣品中含有較高濃度的三甲基吡嗪，SHI組的雜環(huán)化合物總量最高，對風(fēng)干腸風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)。

續(xù)表5

續(xù)表5

續(xù)表5

2.6 微生物發(fā)酵劑對風(fēng)干腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAV的影響

肉制品的香氣感知不僅取決于揮發(fā)性化合物的濃度，還取決于氣味閾值和它們與其他食品成分及揮發(fā)性化合物之間的相互作用。在4 組風(fēng)干腸中含有15 種揮發(fā)性化合物的OAV＞1，被認(rèn)為是風(fēng)干腸氣味的主要來源，在整體氣味中起重要影響。OAV＞1的物質(zhì)和風(fēng)味描述如表6所示，其中，己醛、壬醛、()-2-辛烯醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、3-甲基丁醇、乙偶姻、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在4 組風(fēng)干腸中都存在且OAV＞1，對風(fēng)干腸整體風(fēng)味有極大的貢獻(xiàn)。辛酸和壬酸在4 組風(fēng)干腸中都含有，但其氣味閾值大，對風(fēng)干腸的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。CK組、SHI組中檢測出對其風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性化合物為()-2,4-壬二烯醛和3-甲基丁酸，SHI、WBL組中含有OAV＞1呈果子香味的庚醛。PRO組中含有獨特的呈菠蘿芳香氣味的丁酸乙酯?？梢钥闯? 組風(fēng)干腸中都存在各自的特征香味物質(zhì)，表明接種不同發(fā)酵劑對風(fēng)味的影響較大，但由于食品生態(tài)系統(tǒng)的高度復(fù)雜性，目前還不清楚和難以解釋在發(fā)酵香腸成熟過程中發(fā)生的生化變化中涉及的微生物關(guān)聯(lián)和化學(xué)化合物之間的關(guān)系。

表6 不同微生物發(fā)酵劑風(fēng)干腸成品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAVTable 6 OAV of volatile flavor compounds in air-dried sausages produced with different microbial starters

3 結(jié) 論

研究了3 種商業(yè)復(fù)合發(fā)酵劑對風(fēng)干腸游離氨基酸及其呈味貢獻(xiàn)、滋味、風(fēng)味的影響。對風(fēng)干6、12 d的4 組風(fēng)干腸樣品進(jìn)行游離氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，隨著風(fēng)干時間的延長，4 組風(fēng)干腸游離氨基酸總量和呈味氨基酸TAV總和增多；到風(fēng)干12 d，SHI、WBL和PRO組游離氨基酸總量分別為2 409.78、2 317.74、2 655.18 mg/100 g，顯著高于CK組（2 137.82 mg/100 g）（＜0.05），PRO組游離氨基酸總量最高；3 個接菌組呈味氨基酸TAV高于CK組，實驗表明接種微生物發(fā)酵劑和風(fēng)干工藝有利于風(fēng)干腸滋味的形成。電子鼻、電子舌分析發(fā)現(xiàn)，4 組風(fēng)干腸樣品在氣味和滋味方面存在差異，PRO組豐富性最強(qiáng)，SHI組和WBL組次之，且氣味和滋味比較接近，CK組豐富性最小。GC-MS分析結(jié)果，4 組風(fēng)干腸樣品中鑒定出130 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酯類、醛類、醇類、酸類和雜環(huán)化合物類是風(fēng)干腸主要的風(fēng)味物質(zhì)，CK、SHI、WBL、PRO組中分別檢測出80、79、76 種和83 種風(fēng)味物質(zhì)，酯類物質(zhì)在SHI（20.6%）、WBL（24.13%）和PRO（21.71%）組中占比較CK（19.13%）組高，尤其在SHI組（2 271.62 μg/kg）中的含量最高，表明微生物發(fā)酵劑能改善風(fēng)干腸的風(fēng)味，己醛、壬醛、()-2-辛烯醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、3-甲基丁醇、乙偶姻、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯是風(fēng)干腸共有的特征風(fēng)味物質(zhì)，對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，()-2,4-壬二烯醛、3-甲基丁酸對CK、SHI組風(fēng)味貢獻(xiàn)最大，SHI、WBL組中含有OAV大于1呈果子香味的庚醛，呈菠蘿芳香氣味的丁酸乙酯（OAV＞1）是PRO組所特有的。結(jié)果表明，利用PRO-MIX5復(fù)合發(fā)酵劑更有利于提高風(fēng)干腸的風(fēng)味，改善滋味。