沒食子酸對金線魚魚糜凝膠特性及其體外消化產(chǎn)物活性的影響

鐘坦君，洪鵬志,2，周春霞,2,*，宋春勇，肖丁浩，張若蘭，劉 璐

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東 湛江 524088；2.大連工業(yè)大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

魚糜是一種穩(wěn)定的肌原纖維蛋白濃縮物，由于其獨特的凝膠性，可以加工成各種魚糜制品，例如魚糕、魚丸和魚腸等，深受消費者喜愛。魚糜制品具有高蛋白、低脂肪、高營養(yǎng)性和味美等特點，能夠滿足不同消費者的消費需求。據(jù)2020年中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計，我國魚糜制品的加工量為139.4萬 t，僅占水產(chǎn)品加工量的6.4%，具有巨大的開發(fā)潛力。金線魚肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高、產(chǎn)量大且熱凝膠特性好，是加工成魚糜及魚糜制品的主要海水魚原料之一。近年來，隨著生活水平的提高，人們對健康性、營養(yǎng)性的功能食品需求量日益增加?？勺鳛閮?yōu)質(zhì)蛋白來源的魚糜制品具有良好的市場前景。因此，開發(fā)高品質(zhì)的魚糜制品勢在必行。

越來越多的研究將多酚類物質(zhì)用于改善魚糜凝膠性能。多酚類物質(zhì)大都具有較強的抗氧化性，能夠?qū)ρ趸瘬p傷導致的慢性疾病，如心血管疾病等起到預防作用，且多酚能夠促進蛋白質(zhì)的交聯(lián)，從而利于蛋白質(zhì)形成更為穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。用酪氨酸酶和單寧酸混合處理沙丁魚魚糜凝膠得到更細密的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，適宜添加量的咖啡酸或綠原酸能夠增強馬鮫魚魚糜凝膠性質(zhì)。沒食子酸化學名稱為3,4,5-三羥基苯甲酸，是化學結(jié)構(gòu)最簡單的天然多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎、降血脂、降血糖等多種生物活性，常作為一種低分子質(zhì)量的天然抗氧化劑而廣泛使用。張旭等研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸能顯著降低谷氨酸鈉誘導的肥胖小鼠的血脂水平；Rafiee等研究發(fā)現(xiàn)具有供電子羧酸陰離子的沒食子酸比聯(lián)苯三酚具有更強的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基清除能力。此外，沒食子酸能與蛋白質(zhì)發(fā)生共價和非共價結(jié)合，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，從而改變蛋白質(zhì)的凝膠特性。研究表明，超聲波輔助沒食子酸可有效改善海鱸魚肌原纖維蛋白的凝膠強度和質(zhì)構(gòu)特性，添加0.15%沒食子酸使海鰻肌原纖維蛋白-螺旋和-折疊含量增加，形成的凝膠結(jié)構(gòu)更為致密光滑。因此，在魚糜中添加沒食子酸可以改善魚糜的凝膠特性，有望開發(fā)功能性魚糜制品，且效果與添加量有關。

然而，在食品加工或食物消化過程中，胃腸道蛋白酶的作用會使一些多酚發(fā)生解聚，導致其生物活性改變。經(jīng)胃腸道消化后，牛至多酚抗氧化活性和-葡萄糖苷酶抑制活性降低，胰脂肪酶抑制活性增強，含樹莓和覆盆子的面條自由基清除率增加了4 倍。目前，添加到魚糜制品中的活性成分受加工和消化的影響尚不明確。因此，本研究以金線魚魚糜為原料，添加沒食子酸，研究其添加量對金線魚魚糜凝膠特性和分子間化學作用力的影響，通過體外模擬消化模型評估添加沒食子酸后魚糜凝膠消化產(chǎn)物的體外抗氧化活性和降膽固醇作用，為新型功能性魚糜制品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍金線魚魚糜購自北海豐華食品有限公司（2020年8月批次，AAA級，水分質(zhì)量分數(shù)為73.91%）。

沒食子酸、胃蛋白酶（1∶15 000）、胰蛋白酶（250 U/mg） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；膽鹽（膽酸含量≥60%）、膽固醇酯酶（49 U/mg）、膽固醇棕櫚酸酯、牛黃膽酸鈉、膽固醇、油酸、DPPH、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）上海源葉生物科技有限公司；總膽固醇試劑盒、游離膽固醇試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

UMC5斬拌機 德國Stephan公司；TU-20T恒溫水浴鍋 英國Bibby Scientific公司；TA.XT plusC質(zhì)構(gòu)儀英國Stable Micro Systems公司；色差儀 深圳市3nh科技公司；NMI20-060H-I核磁共振成像分析儀 蘇州紐曼分析儀器公司；Avanti J-26sxp高速落地冷凍離心機美國Beckman公司；7610F掃描電子顯微鏡 日本電子公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜凝膠的制備

參考Buamard等的方法制備金線魚魚糜凝膠。將冷凍魚糜置于4 ℃解凍8～10 h，稱取300 g魚糜，斬拌10 s，加入質(zhì)量分數(shù)2.5%的NaCl斬拌2 min，分別添加質(zhì)量分數(shù)0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的沒食子酸粉末，調(diào)節(jié)水分質(zhì)量分數(shù)80%，繼續(xù)斬拌3 min。斬拌均勻的魚糜混合物經(jīng)抽真空、灌腸、密封后，進行二段式熱處理（40 ℃，30 min；90 ℃，20 min）、冰水冷卻至室溫，4 ℃保存過夜。以不添加沒食子酸的魚糜凝膠為對照組。

1.3.2 凝膠強度和凝膠全質(zhì)構(gòu)的測定

將魚糜凝膠置于室溫平衡30 min，剝?nèi)ツc衣，切成20 mm高圓柱體。用配有探頭P/0.5和P/0.5 S的質(zhì)構(gòu)儀分別測定凝膠強度和全質(zhì)構(gòu)。參數(shù)設定為：測前速率5 mm/s，測中速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，觸發(fā)力5 g，壓縮距離10 mm，應變50%。每個樣品測6 次取平均值。

1.3.3 凝膠白度的測定

采用色差儀測定凝膠的白度。將凝膠在室溫下平衡30 min，剝?nèi)ツc衣，切成10 mm薄片，測定其、、，其中*表示樣品的亮度，*表示紅/綠值，*表示黃/藍值。每個樣品測5 次取平均值。凝膠白度（）按式（1）計算：

1.3.4 凝膠持水性的測定

采用離心法測定魚糜凝膠的持水性。精確稱取凝膠質(zhì)量（約3 g），用雙層濾紙包裹，放入50 mL離心管中離心（10 000 r/min，10 min），取出凝膠稱質(zhì)量，記為。每個樣品測5 次取平均值。凝膠持水性按式（2）計算：

1.3.5 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

將魚糜凝膠切成約2 mm薄片，用2.5%，pH 6.8戊二醛溶液浸泡固定，4 h后用磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 6.8）洗滌2 次，每次15 min，依次用梯度乙醇溶液洗脫，每次10 min，隨后按無水乙醇-叔丁醇體積比1∶1比例及純叔丁醇各洗滌1 次，每次15 min，冷凍干燥，貼樣，鍍金，加速電壓10 kV下放大18 000 倍觀察。

1.3.6 化學作用力的檢測

參考Liu Haimei等的方法檢測魚糜凝膠的化學作用力。配制5 種溶液，即0.05 mol/L NaCl（A液）、0.6 mol/L NaCl（B液）、0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L尿素（C液）、0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素（D液）、0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素＋0.5 mol/L-巰基乙醇（E液）。準確稱取2.0 g魚糜凝膠樣品5 份，分別加入上述溶液10 mL，勻漿均質(zhì)3 min，4 ℃冰水浴條件下磁力攪拌溶解1 h后離心（10 000h，15 min），采用Lowry測上清液的蛋白含量，分別用S1、S2、S3、S4、S5表示。每個樣品測5 次取平均值。離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵含量分別為：離子鍵=S2－S1；氫鍵＝S3－S2；疏水相互作用＝S4－S3；二硫鍵＝S5－S4；結(jié)果以每毫升溶液所含的溶出蛋白質(zhì)量表示（mg/mL）。

1.3.7 凝膠的體外消化

參照Minakus等標準化體外靜態(tài)模擬消化方法并稍作修改。按照表1分別配制模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）、模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）原液，進行體外模擬胃-腸兩步消化。

表1 模擬消化液原液的配制Table 1 Preparation of stock solutions of simulated digestion fluids

模擬胃消化階段：取10 g絞碎的魚糜凝膠，加入10 mL蒸餾水搖勻后與20 mL模擬胃液（含19 mL SGF原液、0.3 mg CaCl、60 mg胃蛋白酶）混合均勻，用1 mol/L的HCl溶液或者1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 2.0，37 ℃振蕩水浴2 h，反應結(jié)束后用0.5 mol/L的NaHCO溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。

模擬腸消化階段：取40 mL上述胃消化液，加入40 mL模擬腸液（含39 mL SIF、32 mg胰蛋白酶、327 mg膽鹽、0.6 mg CaCl）混合均勻，37 ℃振蕩水浴2 h，反應結(jié)束后用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH 2.0，8 000h離心15 min，收集上清液，用于消化產(chǎn)物的活性檢測。

體外消化率按式（3）計算：

式中：為消化液總體積/mL；為消化液上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為消化所用凝膠質(zhì)量/mg；為凝膠中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)/%。

1.3.8 經(jīng)體外消化后消化產(chǎn)物的抗氧化活性檢測

DPPH自由基清除率參考Spripokar等的方法：取1.3.7節(jié)的消化液（0.5 mL）與50 μg/L的DPPH工作液（2.5 mL）混合，室溫避光靜置30 min后在517 nm波長下測吸光度。DPPH自由基清除率按式（4）計算：

式中：為未加樣品溶液的吸光度；A為加樣品溶液后的吸光度。

ABTS法根據(jù)Solari-Godino等的方法做適當修改。ABTS溶液（7 mmol/L）與過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）按2∶1比例混合，室溫避光靜置12～16 h，制得ABTS原液。使用時用蒸餾水稀釋，使其在734 nm波長下吸光度為0.70f0.02。0.05 mL待測樣品與2.9 mL ABTS工作液混合均勻，室溫避光10 min，734 nm波長下測吸光度。ABTS陽離子自由基清除率按式（5）計算：

式中：為未加樣品溶液的吸光度；A為加樣品溶液后的吸光度。

羥自由基清除活性參考鄧永平等的方法并略作修改。試管中加入1 mL硫酸亞鐵溶液（10 mmol/L），2 mL HO溶液（10 mmol/L），2 mL水楊酸-乙醇溶液（5 mmol/L），搖勻后加入5 mL樣品溶液，37 ℃反應30 min，在510 nm波長下測吸光度。羥自由基清除率按式（6）計算：

式中：為未加樣品溶液的吸光度；A為加樣品溶液后的吸光度。

1.3.9 經(jīng)體外消化后消化產(chǎn)物的降膽固醇活性檢測

對膽固醇酯酶活性的影響：參考朱維等的方法，配制膽固醇棕櫚酸酯底物緩沖液（5.16 mmol/L膽固醇棕櫚酸酯、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液、100 mmol/L NaCl，pH 7.0），37 ℃預熱10 min，按樣品與底物緩沖液體積比1∶5混合均勻，加入1 mL豬膽固醇酯酶（0.1 mg/mL，50 U/mg），振蕩水浴1 h。采用游離膽固醇試劑盒檢測生成的膽固醇含量。膽固醇酯酶抑制率按式（7）計算：

式中：為未加樣品溶液中膽固醇含量；A為樣品溶液中膽固醇含量。

對膽固醇膠束化的抑制作用：參考張宇等的方法，通過超聲均質(zhì)制備膽固醇膠束溶液。1 mL膽固醇膠束溶液中含有10 mmol/L牛黃膽酸鈉、5 mmol/L膽固醇、5 mmol/L油酸、132 mmol/L NaCl、15 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）。取5 mL膠束溶液加入1 mL魚糜凝膠消化液，37 ℃恒溫振蕩水浴2 h后離心（10 000 r/min，15 min），收集上清液，使用試劑盒測總膽固醇含量。膽固醇膠束化抑制率按式（8）計算：

式中：為未加樣品溶液中膽固醇含量；A為樣品溶液中膽固醇含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 次獨立實驗（不同日期）平均值使用SPSS 19.0進行方差分析，并采用Duncan多重檢驗分析各個平均值之間的顯著性差異（＜0.05）。使用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠性能的影響

2.1.1 魚糜凝膠強度和質(zhì)構(gòu)特性

凝膠強度和破斷強度是評價魚糜制品質(zhì)量的重要參數(shù)，反映了魚糜形成熱致凝膠的能力。如表2所示，隨著沒食子酸添加量的增加，魚糜凝膠強度先增大后減小，凝膠強度和破斷強度均在0.15%時達到最大；魚糜凝膠的硬度、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復性均呈先增大后減小趨勢。當沒食子酸添加量為0.1%時，魚糜凝膠的硬度最大；當沒食子酸的添加量為0.15%時魚糜凝膠的內(nèi)聚性、咀嚼性和回復性最大。與空白組相比，添加沒食子酸顯著提高魚糜凝膠的彈性（＜0.05），而沒食子酸的添加量對凝膠膠著性影響不顯著（＞0.05）。綜合全質(zhì)構(gòu)指標分析，沒食子酸的添加量為0.15%最有利于改善魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)。

表2 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠強度和質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Effect of gallic acid addition on the texture properties of N.virgatus surimi gel

多酚可與魚糜蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用改變魚糜的凝膠特性。酚類物質(zhì)氧化成醌，與巰基共價結(jié)合對蛋白質(zhì)的凝膠特性有兩方面的影響。當多酚濃度較低時，多酚與巰基發(fā)生非二硫共價交聯(lián)，生成蛋白質(zhì)-硫-多酚-硫-蛋白質(zhì)交聯(lián)物，在蛋白質(zhì)分子間起連接作用，增加蛋白間的聚合，從而提高魚糜凝膠強度、破斷強度、硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復性；當多酚濃度較高時，多酚與巰基交聯(lián)過度，不利于凝膠形成過程中二硫鍵的形成，因而不利于凝膠網(wǎng)絡的形成。此外，低濃度多酚能夠增強魚糜凝膠的疏水相互作用，有利于魚糜蛋白質(zhì)的凝膠化；而高濃度的多酚使蛋白質(zhì)發(fā)生疏水性聚集，并且過剩的多酚物質(zhì)屏蔽肌原纖維蛋白中的巰基、氨基等反應性官能團，阻礙蛋白之間的交聯(lián)，使魚糜蛋白形成無序、松散的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，由此降低魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。本研究中，當沒食子酸添加量為0.15%時，可顯著提高魚糜凝膠強度、破斷強度和質(zhì)構(gòu)特性，而當沒食子酸的添加量繼續(xù)增加時，魚糜凝膠的凝膠強度和質(zhì)構(gòu)特性明顯減弱。因此，高濃度的沒食子酸不利于魚糜凝膠的形成。

2.1.2 魚糜凝膠的白度

白度是魚糜制品的重要感官指標，白度越高，消費者越容易接受。一般來說，魚糜制品要求高亮度（*）、低黃度（*）和高白度。如表3所示，未添加沒食子酸的魚糜凝膠白度顯著高于添加沒食子酸后的魚糜凝膠（＜0.05）。隨著沒食子酸添加量的增加，魚糜凝膠的亮度和黃度均顯著降低。因此，沒食子酸主要對魚糜凝膠的亮度不利，從而導致白度降低。這可能是沒食子酸在加熱過程中氧化成醌，顏色加深，從而使魚糜凝膠白度降低。Vate等報道在沙丁魚魚糜中加入單寧酸，由于單寧酸的自我氧化導致魚糜凝膠白度降低。與此類似，Arsyad等在紅鯛魚魚糜凝膠中加入橄欖葉粉末，因橄欖多酚的作用導致魚糜凝膠的白度降低。以上結(jié)果表明，加入酚類物質(zhì)會導致魚糜凝膠的白度降低。因此，應通過控制酚類的添加量將魚糜制品的白度控制在可接受水平。

表3 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠白度的影響Table 3 Effect of gallic acid addition on the color parameters and whiteness of N.virgatus surimi gel

2.1.3 魚糜凝膠的持水性

持水性指魚糜凝膠中蛋白質(zhì)的保水能力，與凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的強度有關。一般來說，凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)越致密，其截留水分的能力越好，持水性就越高。如圖1所示，與對照組相比，添加0.05%、0.10%和0.15%的沒食子酸對魚糜凝膠持水性的影響不明顯（＞0.05），而當沒食子酸的添加量增加到0.2%和0.25%時，魚糜凝膠的持水性顯著降低（＜0.05），表明高添加量的沒食子酸對魚糜凝膠的持水性有不利影響，與沒食子酸的添加對凝膠強度和質(zhì)構(gòu)特性的影響一致。沒食子酸與魚糜蛋白分子間相互作用，高濃度的多酚與蛋白質(zhì)分子過度結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，引起不良聚集，導致凝膠網(wǎng)絡松散，體系的持水性下降。與此類似，低添加量（10 μmol/g）的沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠持水性影響不顯著，而當沒食子酸添加量為50 μmol/g時，肌原纖維蛋白凝膠持水性顯著降低；低濃度綠原酸和咖啡酸能顯著提高馬鮫魚魚糜凝膠的持水性，而當濃度增加時，由于多酚的結(jié)合作用引起蛋白質(zhì)間過度交聯(lián)而使持水性降低。因此，添加適量的沒食子酸對魚糜凝膠的持水性沒有不利影響。

圖1 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠持水性的影響Fig.1 Effect of gallic acid addition on the water-holding capacity of N.virgatus surimi gel

2.1.4 魚糜凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

由圖2可知，空白對照組魚糜凝膠表面粗糙，孔洞較多且大小不均勻（圖2A）。添加0.05%的沒食子酸后，魚糜凝膠表面較粗糙，但表面孔徑變?。▓D2B）；添加0.10%沒食子酸后，魚糜凝膠樣品表面光滑，孔徑小且均勻，但表面孔洞較多（圖2C）；添加0.15%沒食子酸后，魚糜凝膠結(jié)構(gòu)變得緊實致密，孔洞相對較少，但表面較粗糙（圖2D），說明適當添加量的沒食子酸可以促進魚糜凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成。在魚糜中分別添加0.3%間苯三酚和1%褐藻多酚提取物可與蛋白質(zhì)生成共價鍵，起到“架橋”作用，增強蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，從而導致魚糜凝膠表面孔徑變小。研究表明，肌原纖維蛋白的交聯(lián)與凝膠強度和硬度有關，凝膠網(wǎng)絡越細密緊致，凝膠硬度越大。此外，蛋白網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)越精細，魚糜凝膠孔徑越小，越能捕獲更多的水分子，從而使魚糜凝膠具有更高的彈性和持水性。隨著沒食子酸添加量的進一步增加，魚糜凝膠表面孔洞變多，孔徑變大，結(jié)構(gòu)變得松散無序（圖2E、F）。與質(zhì)構(gòu)特性的檢測結(jié)果類似，含0.10%和0.15%沒食子酸的金線魚魚糜凝膠具有更高的凝膠強度、硬度和持水性，而當沒食子酸添加量超過0.15%時，魚糜的凝膠強度、硬度和持水性等都減小，這可能是由于高濃度的沒食子酸阻礙蛋白質(zhì)分子間的相互作用，從而使蛋白結(jié)構(gòu)分布不均勻，凝膠表面空隙增大。

圖2 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠掃描電鏡圖的影響（×18 000）Fig.2 Effect of gallic acid addition on the scanning electron microscopic photograph of N.virgatus surimi gel (× 18 000)

2.2 魚糜凝膠的化學作用力

影響魚糜凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的化學作用力主要是離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵。如圖3所示，魚糜凝膠的形成過程中，共價二硫交聯(lián)的作用貢獻最大，其次是非共價的疏水相互作用，而離子鍵和氫鍵的作用貢獻較小。隨著沒食子酸添加量的增加，離子鍵和氫鍵呈上升趨勢。維持魚糜凝膠的疏水相互作用和二硫鍵含量隨著沒食子酸添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并均在添加量為0.15%時達到最大。這是由于適量的沒食子酸促進蛋白質(zhì)展開，使表面疏水性適度增加，而高添加量的沒食子酸會使蛋白質(zhì)聚集甚至變性，蛋白質(zhì)進一步折疊使疏水性氨基酸埋藏在內(nèi)部，從而使疏水相互作用呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。二硫鍵是由相鄰的2 個半胱氨酸分子氧化后形成，說明適量沒食子酸能夠改變魚糜蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，暴露出更多的巰基，多酚再將其氧化成二硫鍵，從而使二硫鍵含量增加；當沒食子酸含量較高時，沒食子酸與蛋白質(zhì)結(jié)合過度，阻礙凝膠形成過程中巰基向二硫鍵的轉(zhuǎn)化，從而減少二硫鍵的生成?？傮w分析，二硫鍵才是魚糜凝膠形成過程中主要的化學作用力，且沒食子酸主要通過影響蛋白質(zhì)分子間的二硫共價交聯(lián)改變魚糜的凝膠特性。

圖3 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠化學作用力的影響Fig.3 Effect of gallic acid addition on the chemical forces of N.virgatus surimi gel

2.3 沒食子酸的添加對金線魚魚糜凝膠體外消化的影響

2.3.1 魚糜凝膠的體外消化率

體外模擬消化模型可用于模擬食物在人體中的消化過程，研究在模擬胃腸道環(huán)境下食物中營養(yǎng)成分的消化率和釋放行為。其中蛋白質(zhì)體外消化率直接定量反映食物中蛋白質(zhì)在胃腸道中的消化情況，進而反映沒食子酸添加量對蛋白質(zhì)消化程度的影響。由圖4可知，添加沒食子酸后，金線魚魚糜凝膠的蛋白質(zhì)體外消化率均明顯提高（＜0.05），且當沒食子酸添加量為0.15%時，蛋白質(zhì)的體外消化率最高為86.30%。說明沒食子酸的作用有助于魚糜凝膠的消化。

圖4 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠蛋白質(zhì)體外消化率的影響Fig.4 Effect of gallic acid addition on the in vitro protein digestibility of N.virgatus surimi gel

研究認為，多酚能與蛋白質(zhì)結(jié)合，降低蛋白質(zhì)的消化率。然而，對于小分子多酚類化合物，比如沒食子酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯對蛋白消化性能的影響報道結(jié)果與此并不一致。曹云剛研究發(fā)現(xiàn)，添加沒食子酸促使豬肌原纖維蛋白熱誘導凝膠二硫鍵及其他共價鍵的生成，但對肌原纖維蛋白的體外消化率沒有顯著影響。Shen Fei等研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚與卵清蛋白和溶菌酶的非共價結(jié)合提高了2 種蛋白的胃蛋白酶消化率，但降低了其胰酶消化率。消化過程中胃蛋白酶的活性起著至關重要的作用，胃蛋白酶的主要酶切位點為酪氨酸、色氨酸等疏水性氨基酸。少量沒食子酸的添加能提高蛋白質(zhì)消化率的原因可能是沒食子酸的苯環(huán)與魚糜蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的芳香族氨基酸相互作用，使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，疏水性基團暴露，利于胃蛋白酶的酶切作用，從而使蛋白質(zhì)的消化率增加，而當沒食子酸濃度較高時，蛋白質(zhì)聚集，不利于胃蛋白酶的酶切作用，這與維持魚糜凝膠的分子間疏水相互作用的變化規(guī)律相符。此外，由于沒食子酸的抗氧化作用，空白組的魚糜凝膠蛋白更易發(fā)生氧化，進而抑制與消化酶的結(jié)合，導致其消化率低。

2.3.2 體外消化產(chǎn)物的抗氧化活性

采用DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和羥自由基清除率，測定魚糜凝膠消化物的抗氧化活性。如圖5所示，未添加沒食子酸的魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物具有較高的DPPH自由基清除率（41.75%）和羥自由基清除率（72.81%），這是因為魚糜中的蛋白質(zhì)經(jīng)消化后產(chǎn)生的多肽或游離氨基酸可能具有多種生物活性，如Minkiewicz等發(fā)現(xiàn)鯉魚蛋白消化產(chǎn)物具有較好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性，并從中分離出了ACE抑制肽。添加0.05%的沒食子酸后，魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率均顯著提高（＜0.05），表明添加到魚糜中的沒食子酸經(jīng)過熱處理和體外消化后保留了自身的抗氧化活性。而隨著沒食子酸添加量的增加，DPPH自由基和羥自由基清除率變化不明顯，而ABTS陽離子自由基清除率隨添加量的增加顯著增加（＜0.05），沒食子酸添加量為0.25%時，ABTS陽離子自由基清除率達到93.78%。由此說明ABTS陽離子自由基清除率可能更適合于評價此魚糜凝膠樣品的抗氧化能力，這可能是由于反應機制的不同導致不同的結(jié)果。與此類似，在鳳尾魚肉糜中添加富含多酚的葡萄渣膳食纖維，肉糜的體外ABTS陽離子自由基清除率隨著膳食纖維添加量的增加而顯著上升，而鐵離子還原能力增加趨勢不明顯。綜合分析，添加沒食子酸能夠增強魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物的抗氧化活性，并且低添加量的沒食子酸即可獲得較強的DPPH自由基和羥自由基清除能力。大量研究已經(jīng)證實，自由基引起的氧化損傷與人類的各種慢性和退行性疾病的發(fā)病機制密切相關，因此添加沒食子酸的魚糜凝膠制品可能對人體具有潛在的健康益處。

圖5 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of gallic acid addition on the antioxidant activity of in vitro digested N.virgatus surimi gel

2.3.3 體外消化產(chǎn)物的降膽固醇作用

通過攝食進入人體的膽固醇有游離膽固醇和膽固醇酯2 種形式，膽固醇酯需要在膽固醇酯酶的作用下水解成游離膽固醇和脂肪酸后才能進入消化系統(tǒng)。此外，膽固醇酯酶促進膽固醇膠束化、有助于游離膽固醇向腸細胞的轉(zhuǎn)運。因此，抑制膽固醇酯酶活性可在一定程度上減少膽固醇吸收，起到降血脂作用。沒食子酸的添加對魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物抑制膽固醇酯酶活性的影響如圖6A所示。未添加沒食子酸的魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物對膽固醇酯酶活性的抑制率為27.43%，添加0.05%沒食子酸后，魚糜凝膠對膽固醇酯酶抑制率增加到52.10%，此后隨著沒食子酸添加量的增加呈現(xiàn)緩慢減小的趨勢，當添加量增加到0.25%時，抑制率降低到43.60%。這表明魚糜凝膠對膽固醇酯酶的抑制率可能與凝膠性質(zhì)有關，當多酚含量較高時，多酚與蛋白過度結(jié)合，降低蛋白消化率，從而減弱消化產(chǎn)物的功能活性。

圖6 添加沒食子酸對金線魚魚糜凝膠體外降膽固醇作用的影響Fig.6 Effect of gallic acid addition on the cholesterol-lowering capacity of in vitro digested N.virgatus surimi gel

經(jīng)水解后的膽固醇只有溶于混合膠束后才能被運輸?shù)叫∧c中吸收，本實驗通過模擬膽汁膠束，研究魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物對膽固醇吸收的影響。如圖6B所示，未添加沒食子酸的魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物對膽固醇膠束化抑制率較低（19.15%），添加沒食子酸后，魚糜凝膠體外消化產(chǎn)物對膽固醇膠束化抑制作用隨著沒食子酸添加量的增加而顯著增強（＜0.05），當沒食子酸添加量為0.25%時抑制率達到最大為55.99%。與之相比，乳清蛋白活性肽對膽固醇膠束化抑制率為47.82%，張氏馬尾藻多糖對膽固醇膠束抑制率最高為18.74%。

長期攝入含酚類成分的食物能夠降血壓、降血脂，推測其原因在于減少了腸道對膽固醇的吸收。Boruah等以不同劑量的大黃葉多酚粗提物喂養(yǎng)高血脂大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此多酚促進了大鼠膽固醇的排泄，使大鼠血漿中高密度脂蛋白膽固醇含量顯著升高、低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白含量顯著降低。綜合分析，本實驗所制備的沒食子酸魚糜凝膠具有較好的體外模擬降膽固醇效果，體外消化產(chǎn)物對膽固醇膠束的形成具有較強抑制作用，能夠減少膽固醇的吸收，從而起到降脂作用。

3 結(jié) 論

適量的沒食子酸能夠促進魚糜蛋白分子間的共價交聯(lián)，增強凝膠形成過程中的疏水相互作用和二硫交聯(lián)，從而有利于形成致密均勻的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，改善凝膠品質(zhì)，也能提高魚糜凝膠中蛋白質(zhì)的體外消化率，且消化產(chǎn)物的體外抗氧化活性和體外降膽固醇活性明顯提高；而較高添加量的沒食子酸與魚糜蛋白過度交聯(lián)，使蛋白質(zhì)變性聚集，阻礙二硫鍵的形成，不利于凝膠形成，但體外消化產(chǎn)物的活性仍然保持較好，表明沒食子酸添加到魚糜中經(jīng)熱處理和體外消化后仍保留了自身的生物活性。當沒食子酸添加量為0.15%時，魚糜凝膠性能最佳，體外消化產(chǎn)物的抗氧化活性、膽固醇酯酶抑制活性和膽固醇膠束化抑制活性較強。因此，凝膠體系對酚類物質(zhì)具有一定的穩(wěn)態(tài)化作用，適量沒食子酸可作為魚糜凝膠品質(zhì)改良劑和負載的功能活性成分。