基于脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)探究熱處理和發(fā)酵對(duì)乳脂質(zhì)的影響

高文浩，尹乾隆，王筱迪，滕翔宇,2，任皓威,2，劉 寧,2,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱騰凝科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150030）

酸乳是世界上最受歡迎的發(fā)酵乳制品之一，作為健康食品已獲得消費(fèi)者的廣泛認(rèn)可。酸乳不僅能提供全面營(yíng)養(yǎng)，還具有許多健康益處，其生產(chǎn)是一個(gè)長(zhǎng)期的、不斷變化的過(guò)程。酸乳的質(zhì)量特性受諸多因素影響，其中熱處理和發(fā)酵是最重要兩方面。在20世紀(jì)后期，酸乳實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)工業(yè)和生產(chǎn)過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化，其中熱處理一般采用高溫巴氏殺菌，要求溫度在85 ℃持續(xù)20～30 min或90～95 ℃持續(xù)5 min，在此條件下除孢子外，大多數(shù)微生物被殺死，大多數(shù)酶失活，從而確保了產(chǎn)品的安全性。在商業(yè)化酸乳制作中最常用的發(fā)酵劑是嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種，在42 ℃左右條件下發(fā)酵，這一階段誘導(dǎo)凝乳的形成，促使酸乳產(chǎn)生質(zhì)地特征和獨(dú)特風(fēng)味。然而，目前關(guān)于酸乳加工過(guò)程中熱處理和發(fā)酵會(huì)對(duì)產(chǎn)品脂質(zhì)影響的研究較少。

脂質(zhì)組學(xué)是組學(xué)的重要分支，作為食品科學(xué)領(lǐng)域中高效、敏感和強(qiáng)大的分析工具應(yīng)用范圍十分廣泛，如食品加工及轉(zhuǎn)化和食物對(duì)人類(lèi)健康影響等研究。然而，以酸乳為中心的脂質(zhì)組學(xué)研究有限。章麗等基于脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定了嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳的脂質(zhì)構(gòu)成；Lordan等基于超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）結(jié)合高分辨率質(zhì)譜分析發(fā)酵對(duì)羊乳極性脂質(zhì)的影響，并探究極性脂質(zhì)對(duì)血小板活化因子和凝血酶的抑制作用；Furse等用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析市售牛乳、酸乳和乳酪的脂質(zhì)特性，但并未深入研究發(fā)酵對(duì)脂質(zhì)的影響。因此，本研究基于非靶向脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)闡明牛酸乳和羊酸乳制造過(guò)程中脂質(zhì)組成及動(dòng)態(tài)變化，深入探究熱處理-巴氏殺菌（物理因素）和發(fā)酵-菌種脂質(zhì)代謝（生物化學(xué)因素）對(duì)牛乳和羊乳脂質(zhì)的影響，并篩選出可作為鑒別產(chǎn)品是否經(jīng)熱處理和發(fā)酵的潛在標(biāo)志物，用于商業(yè)化生產(chǎn)酸乳過(guò)程中加工工藝終點(diǎn)及產(chǎn)品狀態(tài)的判斷，并在分子水平上探索熱處理和發(fā)酵對(duì)不同乳基產(chǎn)生的共同脂質(zhì)的變化，以期推動(dòng)對(duì)酸乳最終產(chǎn)品質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)特性的理解。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂牛乳和全脂羊乳分別購(gòu)自中國(guó)黑龍江省哈爾濱市當(dāng)?shù)啬翀?chǎng)，品種分別為荷斯坦乳牛和薩能山羊，飼喂日糧均為玉米、黃豆和青貯飼料。采集10 頭乳牛和乳山羊擠出的新鮮牛乳和羊乳，分別混合后立即轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行酸乳制作。

發(fā)酵劑MY105（嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種按1∶1混合） 法國(guó)丹尼斯克公司；乙腈、異丙醇、甲醇 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；其余試劑均為色譜級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC Nexera LC-30A系統(tǒng) 日本Shimadzu公司；Q-Exactive Plus質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀美國(guó)Thermo Scientific公司；ACQUITY UPLC CSH C色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 酸乳制作

參照前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行酸乳制作。牛乳和羊乳經(jīng)過(guò)多次紗布過(guò)濾去除固體雜質(zhì)，然后加熱至55 ℃采用二段法均質(zhì)（20/5 MPa），均質(zhì)后牛乳和羊乳在90 ℃下高溫巴氏殺菌5 min，冷卻至45 ℃準(zhǔn)備接菌。按照56 mg/L的比例接種丹尼斯克發(fā)酵劑MY105，接種后牛乳和羊乳于42 ℃恒溫培養(yǎng)，待牛酸乳和羊酸乳pH值達(dá)到4.6左右立即于4 ℃冷卻停止發(fā)酵。生鮮牛乳（CM）、生鮮羊乳（GM）、巴氏殺菌牛乳（PC）、巴氏殺菌羊乳（PG）、牛酸乳（FC）、羊酸乳（FG）和質(zhì)控（QC），等量取各組樣品混合制備。樣品于－80 ℃冰箱冷凍保存，備用。每組樣品各6 個(gè)重復(fù)。

1.3.2 脂質(zhì)提取

采用改良的甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）提取法，取樣本于4 ℃緩慢解凍后，將100 μL樣本加入200 μL超純水，混合，隨后加入240 μL預(yù)冷甲醇，渦旋混合，再加入800 μL MTBE，渦旋混合，室溫放置30 min后，14 000h、10 ℃離心15 min，取上層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈伞z測(cè)分析時(shí)加入200 μL異丙醇復(fù)溶、渦旋，14 000h、10 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件

UPLC條件：ACQUITY UPLC CSH C色譜柱（2.1 mmh100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為含10 mmol/L甲酸銨的體積分?jǐn)?shù)60%乙腈溶液；B為含10 mmol/L甲酸銨的乙腈-異丙醇（1∶9，/）。梯度洗脫程序：0～2 min，70% A、30% B；2～25 min，70%～0% A、30%～100% B；25～35 min，70% A、30% B；柱溫45 ℃，流速300 μL/min；進(jìn)樣口溫度10 ℃。為避免儀器檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)造成的影響，采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本連續(xù)分析。

MS條件：采用電噴霧電離源，采用正負(fù)離子模式。正離子模式參數(shù)設(shè)定：離子源溫度300 ℃；噴霧電壓3.0（正離子模式）、2.5 kV（負(fù)離子模式）；離子傳輸管溫度350 ℃；鞘氣流速45 arb；輔助器流速15 arb；吹掃氣流速1 arb；一級(jí)MS掃描范圍：200～1 800 Da。每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜，一級(jí)MS在/200時(shí)的分辨率為70 000，二級(jí)MS在/200時(shí)的分辨率為17 500。

采用LipidSearch進(jìn)行峰的識(shí)別和提取、脂質(zhì)鑒定（二級(jí)鑒定）等。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

將所有實(shí)驗(yàn)樣品和QC樣本提取到的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，如圖1A所示，6 個(gè)QC樣本緊密聚集在一起，相對(duì)位置位于6 組樣品中間并且接近原點(diǎn)，表明實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性。Hotelling通過(guò)多元變量建立模型對(duì)總體樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，紅色虛線定義了99%置信區(qū)間，可用于離群樣本的診斷，如圖1B所示，所有樣本均在99%置信區(qū)間內(nèi)，再次說(shuō)明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。

圖1 所有樣本的PCA（A）和Hotelling T2檢驗(yàn)（B）Fig.1 PCA plot (A) and Hotelling T2 test plot (B) for all samples

2.2 牛乳和羊乳在加工過(guò)程中脂質(zhì)特性變化分析

基于UPLC-Q-Exactive-MS對(duì)牛乳、羊乳、巴氏殺菌牛乳、巴氏殺菌羊乳、牛酸乳和羊酸乳進(jìn)行非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。如圖2所示，實(shí)驗(yàn)樣本中檢測(cè)到脂質(zhì)亞類(lèi)共計(jì)27 類(lèi)，其中檢測(cè)到數(shù)目最多的脂質(zhì)分子為三?；视王ィ╰riglyceride，TG）共731 種，其次為379 種二酰基甘油酯（diglyceride，DG）和110 種己糖基神經(jīng)酰胺（hexa-ceramide，HexCer）（其中包括83 種Hex1Cer、25 種Hex2Cer和2 種Hex3Cer），之后依次為82 種磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、74 種磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、66 種鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、43 種神經(jīng)酰胺（ceramides，Cer）、31 種磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、21 種磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、14 種鞘氨醇（sphingosine，Sph）、9 種單?；视王ィ╩onoglyceride，MG）、6 種溶血性磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、6 種酵母甾醇（zymosterol，ZyE）、5 種溶血性磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）、5 種單半乳糖二?；视停╩onogalactosylmonoacylglycerol，MGDG）、5 種磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、4 種豆甾醇酯（stigmasterol ester，StE）、4 種蠟酯（wax exters，WE）、3 種磷酸神經(jīng)酰胺（ceramides phosphate，CerP）、3 種心磷脂（cardiolipin，CL）、2 種磷脂酰肌醇一磷酸（phosphatidylinositol(4)phosphate，PIP）、1 種神經(jīng)節(jié)苷脂（gangliosides，GD1a）、1 種溶血性磷脂酰甘油（lysophosphatidylglycerol，LPG）、1 種磷脂酰肌醇（lysophosphatidylinositol，LPI）、1 種植物鞘氨醇（phytosphingosine，phSM）。牛乳是一種復(fù)雜的脂質(zhì)混合物，含有數(shù)千種脂質(zhì)，雖然研究眾多，但許多低豐度的脂類(lèi)仍然未知。Li Mohan等對(duì)牛初乳和成熟乳脂質(zhì)進(jìn)行全面表征，共檢測(cè)出13 亞類(lèi)335 種脂質(zhì)分子；Liu Zhiqian等對(duì)牛乳中TG進(jìn)行綜合表征共鑒定出3 454 種脂質(zhì)分子，并對(duì)牛乳中磷脂、鞘脂、糖脂、Cer進(jìn)行綜合表征，共鑒定出15 亞類(lèi)514 種脂質(zhì)分子。本研究在正負(fù)離子模式下共檢測(cè)到1 607 種脂質(zhì)分子，對(duì)牛乳和羊乳在加工過(guò)程中各階段的脂質(zhì)分子及動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行表征，結(jié)果表明牛乳和羊乳在加工制備酸乳過(guò)程中脂質(zhì)家族具有巨大的多樣性和復(fù)雜性。

圖2 牛乳和羊乳的脂質(zhì)亞類(lèi)分析Fig.2 Analysis of lipid subclasses in cow and goat milk

2.3 熱處理對(duì)牛乳和羊乳的脂質(zhì)組學(xué)影響

如圖3A所示，TG（相對(duì)含量90%）是牛乳中檢測(cè)到最豐富的脂質(zhì)成分，其次是DG（8%），這表明牛乳脂肪主要以甘油酯形式存在，約占總脂質(zhì)含量的98%，而其他脂質(zhì)（2%）主要以磷脂、鞘脂、固醇類(lèi)和糖脂形式存在，這些脂質(zhì)是乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）的主要成分，確保了乳的水包油乳液的穩(wěn)定性。在2%的其他脂質(zhì)中，磷脂含量最為豐富，約占68%，其中亞類(lèi)及相對(duì)含量分別為PC（26%）、PE（15%）、SM（14%）、PG（10%）、PI（2%）和PS（1%），這與Zhang Xinhao等測(cè)定的牛乳磷脂組成較為相似，但PS含量相差較大，這可能是由地域、泌乳期、氣候、季節(jié)、飼料以及乳牛個(gè)體差異導(dǎo)致，這些因素均會(huì)對(duì)乳脂成分產(chǎn)生顯著影響；鞘脂相對(duì)含量約占24%，包括Hex1Cer（20%）、CerP（2%）、Cer（1%）和Hex2Cer（1%）；固醇類(lèi)約占4%，包括ZyE（3%）和StE（1%）；糖脂主要以MGDG（3%）形式存在；其余12 種亞類(lèi)含量極微量，共計(jì)1%。如圖3B所示，與生牛乳相比，熱處理后的巴氏殺菌牛乳DG相對(duì)含量下降1%，TG相對(duì)含量沒(méi)有改變，PC、SM、PI和MGDG相對(duì)含量有極小幅度上調(diào)，PE、PG、Hex1Cer和ZyE極小幅度下調(diào)。如圖3C、D所示，與生羊乳相比，巴氏殺菌羊乳DG相對(duì)含量也降低1%，TG相對(duì)含量不變，PC和SM相對(duì)含量分別上調(diào)1%，Hex1Cer相對(duì)含量下調(diào)2%。表明熱處理對(duì)牛乳和羊乳脂質(zhì)特性的影響基本趨同，即熱處理對(duì)PC、SM相對(duì)含量有輕微上調(diào)作用，這與Gallier等探究生牛乳和巴氏殺菌后牛乳的極性脂質(zhì)變化一致；而DG、Hex1Cer相對(duì)含量輕微下降、TG相對(duì)含量基本保持不變，這一結(jié)果與Xu Qingbiao等研究結(jié)果一致；其他磷脂、鞘脂、糖脂在熱處理后沒(méi)有變化?？偟膩?lái)說(shuō)，高溫巴氏殺菌處理未導(dǎo)致牛乳和羊乳脂質(zhì)亞類(lèi)的顯著變化。Bezie等研究表明牛乳中的脂肪基本不會(huì)受到熱處理影響。

圖3 熱處理前后牛乳和羊乳的脂質(zhì)特性比較Fig.3 Comparison of lipid properties of cow and goat milk before and after heat treatment

PCA根據(jù)樣本的相似性或不同性對(duì)樣本進(jìn)行分組。如圖4A所示，[1]、[2]和[3]是對(duì)模型貢獻(xiàn)率最大的3 個(gè)PC，前3 個(gè)PC累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到49.4%，CM組和PC組之間觀察到較明顯差異，表明高溫巴氏殺菌對(duì)牛乳的脂質(zhì)分子產(chǎn)生一定影響。進(jìn)一步使用有監(jiān)督的OPLSDA，如圖4B所示，CM組和PC組明顯分離，再次驗(yàn)證了兩組樣本脂質(zhì)分子的差異性。如圖4C、D所示，GM組和PG組明顯分離，表明高溫巴氏殺菌使羊乳脂質(zhì)分子也發(fā)生變化。

圖4 熱處理前后牛乳和羊乳的脂質(zhì)特性PCA和OPLS-DAFig.4 PCA and OPLS-DA plots for lipid properties of cow and goat milk before and after heat treatment

選擇滿(mǎn)足＜0.05并且VIP＞1的脂質(zhì)分子，分別在CM組與PC組、GM組與PG組中篩選出65 種和170 種顯著差異脂質(zhì)分子。為使表征高溫巴氏殺菌對(duì)乳脂脂質(zhì)分子的影響更具普遍性和科學(xué)性，將上述牛乳和羊乳組的顯著差異脂質(zhì)分子進(jìn)行交集，根據(jù)豐度變化趨勢(shì)，進(jìn)一步篩選出27 種脂質(zhì)分子作為判別熱處理乳脂的潛在生物標(biāo)志物。如圖5所示，熱處理后，這27 種脂質(zhì)分子在牛乳組和羊乳組中的變化趨勢(shì)相同，其豐度均呈下降趨勢(shì)，表明高溫巴氏殺菌雖然未對(duì)牛乳和羊乳的脂質(zhì)亞類(lèi)特性產(chǎn)生顯著影響，但對(duì)乳脂分子層面產(chǎn)生影響。

圖5 熱處理前后牛乳（A）和羊乳（B）中27 種潛在標(biāo)志物熱圖變化Fig.5 Heat map showing changes in 27 potential markers in cow milk (A) and goat milk (B) before and after heat treatments

27 種脂質(zhì)分子以TG和PE為主，這可能反映了熱處理主要破壞了乳脂中TG和PE的脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，而其他脂質(zhì)亞類(lèi)分子受熱處理影響很小。這些脂質(zhì)分子豐度的顯著減少可能是因?yàn)樵诟邷匕褪蠚⒕鷹l件下，MFGM成分改變，蛋白質(zhì)含量升高而脂質(zhì)含量降低，熱處理對(duì)MFGM和脂肪球的損害導(dǎo)致部分游離TG和磷脂暴露；此外，牛乳中存在大量脂蛋白脂肪酶，具有脂肪分解活性，且對(duì)熱處理具有抗性，經(jīng)過(guò)高溫巴氏殺菌處理后，殘存的脂肪酶與從MFG（M）中游離出的TG和磷脂直接接觸并進(jìn)行脂解，生成游離脂肪酸，從而導(dǎo)致27 種脂質(zhì)分子豐度的顯著降低。事實(shí)上，比巴氏殺菌更高溫度的殺菌工藝對(duì)牛乳中的脂解程度更劇烈，因?yàn)楦叩臏囟葘?dǎo)致MFGM的脂質(zhì)表面暴露更多，從而可能導(dǎo)致更多的脂質(zhì)分子暴露。

27 種脂質(zhì)分子中脂肪酸鏈大多為C～C、不飽和脂肪酸鏈多為C和C，以及極少數(shù)的奇鏈脂肪酸鏈（C和C），它們經(jīng)熱處理后被脂解生成游離脂肪酸，而游離脂肪酸較酯類(lèi)更易氧化，尤其是短鏈和中鏈脂肪酸（C～C），這些游離脂肪酸和氧化的脂質(zhì)產(chǎn)物導(dǎo)致風(fēng)味缺陷，這有可能是高溫巴氏殺菌后牛乳和羊乳產(chǎn)生“熟味”的原因，表明高溫巴氏殺菌處理使脂質(zhì)分子產(chǎn)生一定程度的脂解和氧化，對(duì)牛乳和羊乳風(fēng)味產(chǎn)生不利影響。

2.4 發(fā)酵對(duì)牛乳和羊乳的脂質(zhì)組學(xué)影響

如圖6A所示，巴氏殺菌牛乳經(jīng)發(fā)酵后，WE含量上升，CerP和MGDG含量基本一致，其余24 種脂質(zhì)亞類(lèi)含量均明顯下降，尤其是CL、GD1a、Hex2Cer、LPC、LPE、LPG、LPI、MG、PC、PE、phSM、PI、SM、StE和ZyE的含量下降了50%以上，表明發(fā)酵顯著改變了牛乳的脂質(zhì)特性。巴氏殺菌羊乳經(jīng)發(fā)酵后脂質(zhì)特性也表現(xiàn)出顯著變化。如圖6B所示，巴氏殺菌羊乳在發(fā)酵后CerP、GD1a、PG、PIP、StE和ZyE含量上升，MG、MGDG和Hex3Cer含量基本沒(méi)有變化，其余18 種脂質(zhì)亞類(lèi)含量均下降，尤其是LPC、LPE、LPG和LPI含量大幅下降。這些結(jié)果共同證明了發(fā)酵顯著改變了乳脂特性，值得注意的是，發(fā)酵對(duì)牛乳和羊乳在一些脂質(zhì)亞類(lèi)上表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，TG、DG、PC、PE、SM、PS、PI、CL、LPC、LPE、LPG、LPI、Cer、Hex1Cer、Hex2Cer、phSM和SPH均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，表明嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌代謝消耗這些脂質(zhì)，使其含量降低，值得注意的是，這兩種乳酸菌對(duì)LPC、LPE、LPG和LPI的代謝程度最劇烈，這可能是由于溶血型磷脂的結(jié)構(gòu)由一條烷基鏈或?；満蜆O性頭基形成，更易被嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌分解利用。溶血型磷脂是一類(lèi)生物活性脂質(zhì)，LPC是大腦發(fā)育和生長(zhǎng)過(guò)程中脂肪酸傳遞的重要途徑，在大腦生長(zhǎng)中扮演著重要角色；LPE具有抗細(xì)胞凋亡的作用，被證實(shí)可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）活化，從而激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；LPG參與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制；LPI可以上調(diào)脂肪生成基因的表達(dá)，與人類(lèi)肥胖呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明發(fā)酵降低了乳中溶血型磷脂含量，從而影響了其功能特性。

圖6 發(fā)酵前后牛乳和羊乳中27 種脂質(zhì)亞類(lèi)含量變化Fig.6 Changes in the contents of 27 lipid subclasses in cow and goat milk before and after fermentation

對(duì)PC組和FC組脂質(zhì)亞類(lèi)進(jìn)行PCA，如圖7A所示，前3 個(gè)PC累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到65.5%，在[1]（51.6%）上觀察到兩組存在明顯差異，OPLS-DA得分圖（圖7B）中兩組樣本點(diǎn)分離良好，表明發(fā)酵對(duì)牛乳脂質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。如圖7C所示，PG組和FG組PCA中前3 個(gè)PC累計(jì)貢獻(xiàn)率為45.2%，PG組和FG組樣本點(diǎn)相互包含，兩組樣本無(wú)明顯分離，但在有監(jiān)督的OPLS-DA得分圖（圖7D）中，PG組和FG組有效分離。

圖7 發(fā)酵前后牛乳和羊乳的脂質(zhì)特性PCA和OPLS-DAFig.7 PCA and OPLS-DA plots for lipid properties of cow and goat milk before and after fermentation

選擇滿(mǎn)足＜0.05且VIP＞1的脂質(zhì)分子，在PC組和FC組中篩選出191 種顯著差異脂質(zhì)分子，在PG組和FG組中篩選出46 種顯著差異脂質(zhì)分子。根據(jù)發(fā)酵前后的變化趨勢(shì)，在上述191 種和49 種顯著差異脂質(zhì)分子中進(jìn)一步篩選出23 種脂質(zhì)分子作為表征發(fā)酵對(duì)乳脂影響的潛在生物標(biāo)志物。如圖8所示，經(jīng)發(fā)酵后，這23 種潛在生物標(biāo)志物豐度在牛酸乳和羊酸乳中均呈下降趨勢(shì)。這23 種潛在生物標(biāo)志物由7 種PE、4 種溶血型磷脂、4 種PI、3 種TG、2 種SM、2 種PS、1 種PC構(gòu)成，這一結(jié)果與發(fā)酵對(duì)乳脂亞類(lèi)的影響結(jié)果一致，再次驗(yàn)證了發(fā)酵降低了TG、溶血型磷脂、磷脂（PE、PC、PS、PI和SM）的含量。磷脂對(duì)脂類(lèi)代謝失調(diào)、腸道生態(tài)失調(diào)、炎癥、心血管疾病、腸道健康和神經(jīng)發(fā)育有積極影響，其損失可能影響食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性。這些潛在標(biāo)志物的脂肪酸鏈大多由C和C家族組成，而且基本不包括短中鏈脂肪酸（C～C）和奇鏈脂肪酸（C和C），表明嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌基本不代謝短中鏈脂肪酸和奇鏈脂肪酸，它們更偏向于代謝C和C家族脂質(zhì)。Furse等的研究也表明牛乳和酸乳中的奇鏈脂肪酸含量相似。

圖8 發(fā)酵前后牛乳（A）和羊乳（B）中23 種潛在標(biāo)志物熱圖變化Fig.8 Heat map showing changes in 23 potential markers in cow milk (A) and goat milk (B) before and after fermentation

3 結(jié) 論

用UPLC-Q-Exactive-MS聯(lián)用技術(shù)表征了“牛乳-巴氏殺菌牛乳-牛酸乳”和“羊乳-巴氏殺菌羊乳-羊酸乳”的脂質(zhì)特性動(dòng)態(tài)變化，共檢測(cè)出27 種脂質(zhì)亞類(lèi)1 607 種脂質(zhì)分子。結(jié)果表明，巴氏殺菌熱處理對(duì)牛乳和羊乳的脂質(zhì)亞類(lèi)基本無(wú)影響，但對(duì)脂質(zhì)分子產(chǎn)生顯著影響，篩選出27 種脂質(zhì)分子可作為鑒定生與巴氏殺菌牛乳和羊乳的潛在生物標(biāo)志物；而發(fā)酵對(duì)牛乳和羊乳的脂質(zhì)特性具有顯著影響，大部分脂質(zhì)亞類(lèi)表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)，篩選出23 種脂質(zhì)分子可作為鑒定巴氏殺菌與發(fā)酵牛乳和羊乳的潛在生物標(biāo)志物。本研究為酸乳加工過(guò)程中熱處理和發(fā)酵階段對(duì)乳脂的影響提供了分子基礎(chǔ)，有利于加深對(duì)不同階段對(duì)酸乳終產(chǎn)品質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)特性影響的理解，并且潛在生物標(biāo)志物可用于商業(yè)化生產(chǎn)酸乳過(guò)程中判斷加工工藝的終點(diǎn)及產(chǎn)品狀態(tài)。