基于拮抗及ITS 序列分析的河南香菇主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析

崔 筱，劉 芹，孔維麗，張玉亭，胡素娟，王彥坡，康源春，孔維威，袁瑞奇

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所 鄭州 450002； 2.西峽縣食用菌生產(chǎn)辦公室 河南 西峽 474599）

香菇（）隸屬于真菌門擔(dān)子菌綱香菇屬，是世界上重要的食用菌栽培品種之一。中國(guó)是世界上最大的香菇生產(chǎn)國(guó)，2020 年我國(guó)香菇總產(chǎn)量為1 188.21 萬t，占全國(guó)食用菌生產(chǎn)總量（4 061.43 萬t）的29.26%。我國(guó)香菇生產(chǎn)基地分布于河南、河北、湖北、浙江、福建、貴州、黑龍江等省，其中，河南省2020 年香菇產(chǎn)量為365.08 萬t，占河南省食用菌產(chǎn)量（561.85 萬t）的64.98%，居全國(guó)第一位。河南省香菇栽培主要分布在南陽(yáng)西峽、南召、桐柏，三門峽盧氏、靈寶，駐馬店泌陽(yáng)、驛城區(qū)，平頂山汝州、魯山等地，栽培規(guī)模接近30 億棒。但生產(chǎn)中由于引種混亂，同名異種、同種異名現(xiàn)象頻發(fā)，傷農(nóng)害農(nóng)事件屢次出現(xiàn)。河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所食用菌團(tuán)隊(duì)前期采用模糊數(shù)學(xué)和聚類分析的方法對(duì)河南省種質(zhì)資源庫(kù)保存的香菇表型性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，但無法確定品種基因序列遺傳差異，厘清菌株之間的差異性、避免香菇菌株的混淆是推動(dòng)香菇產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必要路徑。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，SSR、RAPD、ITS等方法在香菇、平菇、靈芝等食用菌種群的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性鑒定中廣泛應(yīng)用。而拮抗法是傳統(tǒng)的菌株鑒定方法，傳統(tǒng)鑒定和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合能夠較好地鑒定食用菌種內(nèi)種質(zhì)資源的特異性。前期，筆者已通過“拮抗+ITS”序列分析相結(jié)合的方法鑒定了54 個(gè)平菇菌株，筆者以河南省內(nèi)香菇生產(chǎn)大縣的不同菌種企業(yè)和栽培基地收集到的41 份香菇菌株為研究對(duì)象，應(yīng)用“ITS+拮抗”相結(jié)合的方法進(jìn)行菌種鑒定和遺傳多樣性分析，進(jìn)而為香菇種質(zhì)資源鑒定提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

參試菌株為收集的河南省內(nèi)栽培香菇菌株41個(gè)，編號(hào)及來源見表1。

表1 供試香菇菌株

母種培養(yǎng)基為PDA 綜合培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司的PDA 基礎(chǔ)培養(yǎng)基40 g·L，蛋白胨2 g·L，KHPO1 g·L，MgSO0.5 g·L。主要試劑及引物為PCR Master Mix聚合酶、DNA 純化試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑及4sGelRed 染液，均購(gòu)自上海生工有限公司；pMD-18T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；rDNA ITS 分析所用的ITS 通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗試驗(yàn) 2021 年6—8 月收集河南省科研單位、企業(yè)及種植戶栽培的香菇品種，2021 年10月，在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所將收集到的41 份香菇菌株在PDA 綜合培養(yǎng)基上經(jīng)活化后，采用直徑5 mm 的打孔器打取各菌株種塊于直徑90 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)，每皿放置6個(gè)菌塊，種塊間距1.0 cm，每個(gè)菌株3 次重復(fù)，于25 ℃培養(yǎng)7 d，按照拮抗試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的方法觀察記錄41 份參試菌株兩兩之間的拮抗線的形態(tài)。

1.2.2 DNA提取 將培養(yǎng)的香菇菌絲體置于1.5 mL無菌離心管中，在全自動(dòng)快速研磨儀中研磨成粉，提取各樣品的基因組DNA，基因組DNA 提取采用微波法，采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA 樣品質(zhì)量和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 選用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板1.0 μL，PCR Master Mix 聚合酶12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L）各1.0 μL，ddHO 4.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃5 min，95 ℃1 min，58 ℃30 s，72 ℃50 s，72 ℃10 min，30 個(gè)循環(huán)。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序擴(kuò)增 反應(yīng)完畢后，取5.0 μL 的PCR 產(chǎn)物與1.0 μL 4sGelRed 染液混合，加樣于瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，全自動(dòng)凝膠成像分析儀JS-680D 下檢測(cè)擴(kuò)增條帶?；厥照_的擴(kuò)增條帶（700～800 bp）連于pMD-18T 載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌（）DH5α 菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布在含有Amp 的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，菌落PCR 法驗(yàn)證單克隆大腸桿菌菌株，將驗(yàn)證正確的大腸桿菌菌株送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 測(cè)序獲得的序列經(jīng)DNAMAN 軟件多序列比對(duì)重排后，于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)上比對(duì)，采用MEGA-X 軟件計(jì)算遺傳距離，以Genebank 中平菇（）為外類群，構(gòu)建基于ITS 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗結(jié)果分析

41 個(gè)香菇菌株共設(shè)計(jì)拮抗組合861 組，拮抗現(xiàn)象明顯的有480 組，占55.75%；拮抗現(xiàn)象不明顯的有298 組，占34.61%；無拮抗的有83 組，占9.64%。其中，香9608（LE-1）、香931-2（LE-2）、慶元2 號(hào)（LE-10）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、靈仙1 號(hào)-1（LE-25）、香931（LE-34）、香升龍1-1（LE-37）、香856（LE-38）、香泌陽(yáng)18-1（LE-39）、泌陽(yáng)17（LE-40）、香泌陽(yáng)18-2（LE-41）之間無拮抗，與其他各菌株之間拮抗明顯，表明這些菌株親緣關(guān)系較近，初步鑒定為同一菌株；同理，朕迪CGL-10（LE-20）、豫香1 號(hào)（LE-31）之間無拮抗，與其他各菌株之間拮抗明顯，表明這些菌株親緣關(guān)系較近，為同一菌株；DM-18（LE-24）、靈仙1 號(hào)-3 分（LE-27）之間無拮抗，與其他各菌株之間拮抗，明顯被鑒定為同一菌株；靈仙1 號(hào)（LE-4）、靈仙1 號(hào)-5（LE-5）、雨花3 號(hào)（LE-6）、申香215（LE-8）、朕迪XZL-3（LE-17）、朕迪ZSL-8（LE-18）之間無拮抗，與其他各菌株間拮抗不明顯，鑒定為同一菌株；L18（LE-3）、滬農(nóng)1 號(hào)（LE- 9）、朕 迪CGL- 9（LE- 19）、朕 迪CGL- 11（LE-21）、朕 迪DM-12（LE-22）、朕 迪DM-13（LE-23）、靈仙1 號(hào)-2（LE-26）、南山1 號(hào)-3（LE-28）、香菇分（LE-29）、盧香（LE-30）、香808（LE-33）、香ZX-4（LE-35）、香939 1-2（LE-36）與其他各菌株之間拮抗明顯，表明這些菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；武香1 號(hào)-2（LE-7）、香25（LE-11）、香27（LE-12）、香平頂18-04（LE-15）、朕迪XZL-2（LE-16）、夏1（LE-32）與其他各菌株間拮抗不明顯，鑒定為疑似同一菌株。拮抗試驗(yàn)結(jié)果可將41 個(gè)香菇菌株初步分為16 個(gè)不同菌株及7 個(gè)不同亞種（圖1～2）。

圖1 41 個(gè)香菇菌株拮抗試驗(yàn)結(jié)果

2.2 rDNA ITS區(qū)段PCR測(cè)序及NCBI比對(duì)結(jié)果

41 株香菇菌株的rDNA ITS 區(qū)段PCR 擴(kuò)增均擴(kuò)增到了目的條帶。經(jīng)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增條帶在700～800 bp 之間，符合測(cè)序要求。經(jīng)檢驗(yàn)條帶正確的陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序后，將測(cè)序正確的核酸序列提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得Genebank 登錄號(hào)，并與Genebank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，得到與其最相似的物種名、登記號(hào)及序列相似性。結(jié)果表明，41 個(gè)菌株核酸序列在NCBI 上的序列相似性在99.17%～100%（表2），均為香菇.。

表2 供試菌株在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)結(jié)果

2.3 各菌株ITS序列比對(duì)分析

圖2 香菇部分拮抗試驗(yàn)結(jié)果

將經(jīng)測(cè)序的香菇屬的41 個(gè)菌株之間進(jìn)一步進(jìn)行ITS 序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，滬農(nóng)1 號(hào)（LE-9）與其他各菌株的序列相似性在95.97%～96.4%，為單一菌株；香931-2（LE-2）、靈仙1 號(hào)（LE-4）、靈仙1號(hào)-5（LE-5）、申香215（LE-8）、香27（LE-12）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、香平頂18-04（LE-15）、朕迪XZL-2（LE-16）、朕迪ZSL-8（LE-18）、朕迪CGL-9（LE-19）、朕 迪CGL-10（LE-20）、朕 迪CGL-11（LE-21）、朕迪DM-12（LE-22）、朕迪DM-13（LE-23）、朕 迪DM-18（LE-24）、靈 仙1 號(hào)-1（LE-25）、靈仙1 號(hào)-2（LE-26）、靈仙1 號(hào)-3 分（LE-27）、香菇分（LE-29）、盧香（LE-30）、夏1（LE-32）、香808（LE-33）、香ZX-4（LE-35）、香939 1-2（LE-36）、香升龍1-1（LE-37）、香856（LE-38）、香泌陽(yáng)18-1（LE-39）、泌陽(yáng)17（LE-40）、香泌陽(yáng)18-2（LE-41）與其他菌株之間的序列相似性在99.9%～100%，為同一菌株；L18（LE-3）與南山1 號(hào)-3（LE-28）序列相似性為100%，為同一菌株；香9608（LE-1）、雨花3 號(hào)（LE-6）、武香1 號(hào)-2（LE-7）、慶元2 號(hào)（LE-10）、香25（LE-11）、朕迪XZL-3（LE-17）、豫香1 號(hào)（LE-31）、香931（LE-34）與其他菌株序列相似性在98.07%～99.86%之間，為不同的亞種；41 個(gè)菌株可分為3 個(gè)不同的菌株和8 個(gè)不同的亞種。

2.4 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)測(cè)序獲得41 株供試菌的ITS 序列長(zhǎng)度為718～724 bp，與GeneBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的香菇菌種的ITS 序列相似度為99%以上（表2），初步認(rèn)定41 株供試菌株為香菇菌株。根據(jù)Kimura-2 參數(shù)的遺傳距離模型計(jì)算各樣本序列間的遺傳距離（數(shù)據(jù)未提供），41 份香菇的遺傳距離在0.000 0～0.006 5 之間。其中，滬農(nóng)1 號(hào)與其他菌株的遺傳距離在0.000 0～0.004 8 之間，香9608（LE-1）與豫香1 號(hào)（LE-31）的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.006 5，且豫香1 號(hào)與其他各菌株的遺傳距離在0.003 232～0.004 8 之間，遺傳距離也較遠(yuǎn)；香931-2（LE-2）、L18（LE-3）、滬農(nóng)1 號(hào)（LE-9）、慶元2 號(hào)（LE-10）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、朕迪XZL-2（LE-16）、朕迪DM-13（LE-23）、靈仙1 號(hào)-1（LE-25）、夏1（LE-32）、香931（LE-34）、香939 1-2（LE-36）與其他各菌株的遺傳距離在0.001 6～0.004 8 之間，遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。在Genebank 中下載平菇.（KY962509）ITS序列，長(zhǎng)度為640 bp，將其作為外類群，與各香菇菌株的遺傳距離為0.374，種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離。

以平菇.為組外對(duì)照，與41 份香菇種質(zhì)資源的ITS 序列構(gòu)建NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），分析系統(tǒng)進(jìn)化樹的數(shù)值結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，41 份香菇品種可以聚為4 個(gè)大類，4 個(gè)大類遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)、獨(dú)立進(jìn)化。其中，朕迪XZL-2（LE-16）、滬農(nóng)1 號(hào)（LE-9）各自獨(dú)立為一支。香泌陽(yáng)18-2（LE-41）、香931（LE-34）、泌 陽(yáng)17（LE-40）、香 泌 陽(yáng)18-1（LE-39）、香856（LE-38）、香升龍1-1（LE-37）、南山1 號(hào)-3（LE-28）、靈 仙1 號(hào)-1（LE-25）、香LS-1（LE-14）、L18（LE-3）、香931-2（LE-2）、香939（LE-13）、慶元2 號(hào)（LE-10）、香9608（LE-1）聚為一支；香931（LE-34）、香泌陽(yáng)18-2（LE-41）2 個(gè)菌株組成姐妹群，其自展支持強(qiáng)度為39，且與泌陽(yáng)17（LE-40）親緣關(guān)系較近；香9608（LE-1）、慶元2 號(hào)（LE-10）、香939（LE-13）3 個(gè)菌株組成一個(gè)單系類群，其自展支持強(qiáng)度為50，親緣關(guān)系較近。其余25個(gè)品種為第四支，其中，香808（LE-33）、香ZX-4（LE-35）2 個(gè)菌株組成姐妹群，其自展支持強(qiáng)度為3；盧香（LE-30）、豫香1 號(hào)（LE-31）、香9391-2（LE-36）3 個(gè)菌株組成一個(gè)單系類群，其自展支持強(qiáng)度為6，親緣關(guān)系較近。

圖3 基于41 份香菇菌株ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

香菇在我國(guó)人工栽培歷史悠久，是我國(guó)主要的食用菌栽培品種之一。隨著國(guó)家精準(zhǔn)扶貧策略的推進(jìn)，香菇短、平、快的生產(chǎn)特性及較高的經(jīng)濟(jì)效益，驅(qū)動(dòng)我國(guó)的香菇產(chǎn)業(yè)進(jìn)入了快速發(fā)展階段。河南省是香菇生產(chǎn)大省，隨著產(chǎn)業(yè)發(fā)展，菌種作為食用菌產(chǎn)業(yè)的核心，同種異名、同名異種、菌種間遺傳關(guān)系問題一直未得到有效的解決，因此對(duì)香菇建立快速準(zhǔn)確的鑒定方法是十分必要的。

微生物與微生物之間拮抗現(xiàn)象是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程，具有防止遺傳上明顯不同的個(gè)體間融合的作用，以保持個(gè)體遺傳上的穩(wěn)定性。拮抗反應(yīng)試驗(yàn)可用于菌株之間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的預(yù)測(cè)，在真菌分類學(xué)上被廣泛應(yīng)用。筆者對(duì)河南省內(nèi)香菇主產(chǎn)區(qū)栽培的種質(zhì)資源進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。結(jié)果表明，41 個(gè)香菇菌株可確定為16 個(gè)不同菌株及7 個(gè)不同的亞種。其中在西峽、泌陽(yáng)、盧氏香菇種植基地收集到的香菇菌株雖然命名不同，分別命名為香9608、香931-2、香939、香LS-1、靈仙1 號(hào)-1、香931、香升龍1-1、香856、香泌陽(yáng)18-1、泌陽(yáng)17、香泌陽(yáng)18-2，但這些菌株之間并無拮抗現(xiàn)象，可初步認(rèn)定為同一菌株。在汝州收集到的命名為朕迪CGL-10 的菌株與三門峽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院保藏菌株豫香1 號(hào)無拮抗現(xiàn)象，可初步認(rèn)定為同一菌株。在汝州收集到的命名為朕迪DM-18 的菌株與在靈寶香菇基地命名為靈仙1號(hào)-3 分的菌株之間無拮抗現(xiàn)象，可初步認(rèn)定為同一菌株。在西峽、驛城區(qū)、泌陽(yáng)、上海市農(nóng)科院、汝州收集到的命名為靈仙1 號(hào)、靈仙1 號(hào)-5、雨花3 號(hào)、申香215、朕迪XZL-3、朕迪ZSL-8 菌株之間無拮抗現(xiàn)象，可初步認(rèn)定為同一菌株；認(rèn)定為同一菌株的菌株之間還需要借鑒分子生物學(xué)測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步比對(duì)。此外，雖然三門峽市農(nóng)科院保存的菌株靈仙1 號(hào)-1 與西峽及驛城區(qū)的靈仙1 號(hào)香菇菌株名稱相同，但二者拮抗現(xiàn)象明顯，可初步認(rèn)定為不同菌株。由此可見，雖然菌株間命名不同，可能為同一菌株，命名相同，卻不一定是同一菌株。

物種內(nèi)的遺傳距離越小，則其用DNA 條形碼進(jìn)行分類和鑒定的效果越理想，ITS 序列在種間變異大，種內(nèi)保守性高，其中，ITS2 序列片段較短，容易與單對(duì)引物結(jié)合，易于測(cè)序與擴(kuò)增，且種間變異度高，在物種和亞種水平上的識(shí)別信息最為豐富，作為一種通用的DNA 條形碼，在植物中已被用于近緣種的鑒定，在絲狀真菌中，也作為菌種鑒定的一種手段。筆者前期對(duì)河南省山區(qū)部分野生食藥用菌種質(zhì)資源鑒定分析得出，菌株間序列相似性≥99.9%的定義為同一菌株，序列相似性為99.0%～99.9%的定義為不同亞種，序列相似性為95%～99%鑒別為相同屬的不同菌株。筆者對(duì)本試驗(yàn)中41 份樣本進(jìn)行DNA 提取、PCR 測(cè)序，并成功獲得ITS 序列，ITS 測(cè)序分析表明，41 個(gè)菌株可分為3 個(gè)不同的菌株和8 個(gè)不同的亞種，與前面拮抗試驗(yàn)香931-2（LE-2）、香939（LE-13）、香LS-1（LE-14）、靈仙1 號(hào)-1（LE-25）、香升龍1-1（LE-37）、香856（LE-38）、香泌陽(yáng)18-1（LE-39）、泌陽(yáng)17（LE-40）、香泌陽(yáng)18-2（LE-41）為相同菌株，DM-18（LE-24）與靈仙1 號(hào)-3 分（LE-27）為相同菌株，靈仙1 號(hào)（LE-4）、靈仙1 號(hào)-5（LE-5）、申香215（LE-8）為相同菌株及雨花3 號(hào)（LE-6）、武香1 號(hào)-2（LE-7）、香25（LE-11）、朕迪XZL-3（LE-17）與其他菌株為不同亞種的結(jié)果一致，更進(jìn)一步印證了無拮抗現(xiàn)象的菌株間距離的遠(yuǎn)近。此結(jié)果與前期平菇種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析結(jié)果相似，通過“拮抗＋I(xiàn)TS”法，可將41 份香菇菌株確定為26 個(gè)不同菌株及4 個(gè)不同亞種。本試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以有效地鑒定香菇種類，基本解決了河南省內(nèi)香菇品種命名混亂的問題。

使用MEGA7.0 軟件對(duì)41 株種內(nèi)遺傳距離進(jìn)行計(jì)算，種內(nèi)遺傳距離在0.000 0～0.006 5 之間，引用外源種.（KY962509）ITS 序列作為外類群，與各香菇菌株的遺傳距離為0.374，種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離，說明可以使用ITS 對(duì)供試樣本進(jìn)行分析鑒別。以平菇.為組外對(duì)照，與41 份香菇種質(zhì)資源的ITS 序列構(gòu)建NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹，41 份香菇品種可以聚為4 個(gè)大類，4 個(gè)大類遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)、獨(dú)立進(jìn)化，同時(shí)能夠觀察到不同種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度。

“ITS+拮抗法”結(jié)合可以明確地區(qū)分菌株間拮抗、無拮抗及拮抗不明顯現(xiàn)象基因序列的相似度，遺傳距離的差異及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，本研究結(jié)果可為厘清河南省香菇品種提供理論支撐。