經(jīng)典名方銀翹散薄層鑒別標(biāo)準(zhǔn)提升研究

張會(huì)敏，宋健，徐林，董學(xué)，鐘方曉*

(1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)操作簡便、成本低、時(shí)間短、設(shè)備簡單，是中藥單味藥及復(fù)方制劑質(zhì)量控制的主要方法[1-4]，是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分。目前，已上市中成藥品種約有6萬個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，9 000多個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。2020版《中國藥典》中銀翹散由金銀花、連翹、桔梗、薄荷、竹葉、荊芥穗、淡豆豉、牛蒡子、蘆根、生甘草10味中藥組成，其薄層鑒別項(xiàng)下僅對(duì)金銀花和連翹進(jìn)行鑒別[5]，且連翹鑒別樣品制備需要通過大孔吸附樹脂柱，方法較繁瑣。研究人員對(duì)銀翹散袋泡茶[6]、銀翹口服液[7]及其他劑型[8]進(jìn)行了薄層色譜鑒別，共同存在的問題是對(duì)每一種藥材進(jìn)行鑒別時(shí)都需要單獨(dú)建立一種供試品制備方法，每展開一塊薄層板都需要不同的展開條件，耗時(shí)較長，有的操作較繁瑣，且多采用價(jià)格昂貴的單一對(duì)照品進(jìn)行鑒別。

系列薄層色譜法，也有學(xué)者稱之為系統(tǒng)薄層色譜法或“整體鑒別”，是一種適用于分離、鑒別中藥復(fù)方復(fù)雜體系中單味藥的薄層色譜法[9-10]。首先，對(duì)同一份中藥復(fù)方制劑，采用不同極性試劑(從小到大)進(jìn)行系統(tǒng)提取/萃取處理，得到不同極性部位的樣品供試品溶液，同法制備各單味藥的陰性供試品溶液，甲醇提取制備各對(duì)照藥材溶液；然后以對(duì)照藥材或?qū)φ掌窞閷?duì)照，根據(jù)供試品極性大小、分離度，考察一系列展開劑，確定適合每種單味藥分離、鑒別的供試品溶液及展開劑；最后，每一塊展開的薄層板分別按照可見光—紫外—噴顯色劑—紫外—加熱—可見光—紫外的順序進(jìn)行一系列觀察，確定適合鑒別每種單味藥的顯色方法；最終建立適合中藥復(fù)方中每一種單味藥的薄層色譜鑒別方法。近十年來，在利用不同極性溶媒分步提取制成幾種供試品溶液鑒別不同單味藥、同一種供試品溶液或同一種展開條件同時(shí)鑒別多個(gè)處方藥味、系列薄層色譜法鑒別單味藥方面已有不少探索[5,11-15]，但是多集中于單味藥或者小復(fù)方中幾味藥的鑒別，且未見采用系列薄層色譜法對(duì)銀翹散及其成方制劑中10味藥進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。

本文利用系列薄層色譜法分別對(duì)銀翹散的10種單味藥進(jìn)行鑒別探索，建立只制備一次供試品樣品，盡量使用對(duì)照藥材即可鑒別出銀翹散中的多種單味藥材的方法，為進(jìn)一步完善提升《中國藥典》中銀翹散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

SB-5200DTS超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BP211D型電子天平(德國Sartorius公司)；ZF-6型三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；精宏DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；貝爾德939薄層制版器(重慶市南岸貝爾德儀器技術(shù)廠)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)；薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)；GF254薄層板20 cm×10 cm(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所)；羧甲基纖維素鈉300～8 000 mPa·s(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、石油醚、乙酸丁酯、乙醇、氨水、甲苯、甲酸等均為分析純。

1.2 樣品及對(duì)照藥材

自制10批次銀翹散(S1～S10)；金銀花對(duì)照藥材(121060-201608)、連翹對(duì)照藥材(120908-201216)、薄荷對(duì)照藥材(120916-201812)、甘草對(duì)照藥材(120904-201620)、淡豆豉對(duì)照藥材(121594-201804)、荊芥穗對(duì)照藥材(121424-201505)、牛蒡子對(duì)照藥材(120903-201811)均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法及結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

(1)步驟1

稱取銀翹散10.0 g，加甲醇30 mL超聲30 min，放置室溫，濾過，濾液加水10 mL，用石油醚(30～60 ℃)20 mL、乙酸乙酯5 mL混合溶劑萃取兩次，萃取后的水液備步驟2用，合并有機(jī)溶液層；減壓回收有機(jī)溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，定容? mL，作為供試品溶液(A)(用于鑒別連翹和薄荷)。

(2)步驟2

(3)步驟3

步驟2中下層溶液1與下層溶液2合并，蒸干，用甲醇溶解定容至1 mL，作為供試品溶液(C)(用于鑒定金銀花)。

2.2 陰性對(duì)照溶液的制備

按銀翹散處方組成，分別稱取缺金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子、淡豆豉、荊芥穗、甘草的陰性樣品，按照2.1項(xiàng)下銀翹散供試品溶液制備方法制備各陰性對(duì)照溶液。

2.3 對(duì)照藥材溶液的制備

取金銀花、薄荷各0.50 g，連翹、牛蒡子、甘草、淡豆豉、荊芥穗對(duì)照藥材各1.00 g，分別加甲醇2.0、2.0、1.5、1.5、1.5、1.5、2.0 mL浸泡過夜，分取上清液作為各對(duì)照藥材溶液。

2.4 薄層色譜鑒別

2.4.1 金銀花的鑒別

注：1—金銀花陰性溶液；2—金銀花對(duì)照藥材；3～12—供試品溶液C。圖1 金銀花TLC鑒別Fig.1 Identification of Lonicerae Japonicae Flos using TLC

2.4.2 連翹的鑒別

注：1～5、8～12—供試品溶液A；6—連翹陰性溶液；7—連翹對(duì)照藥材。圖2 連翹TLC鑒別(可見光)Fig.2 Identification of Forsythiae Fructus using TLC (visible light)

2.4.3 薄荷的鑒別

注：1—薄荷陰性溶液；2—薄荷對(duì)照藥材；3～12—供試品溶液A。圖3 薄荷TLC鑒別(365 nm紫外光)Fig.3Identification of Menthae Haplocalycis herba using TLC (365 nm ultraviolet light)

2.4.4 牛蒡子、甘草共同鑒別

注：1～5、10～14—供試品溶液B；6—牛蒡子對(duì)照藥材;7—牛蒡子陰性溶液;8—甘草陰性溶液;9—甘草對(duì)照藥材。圖4 甘草TLC鑒別Fig.4 Identification of Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma using TLC

注：1～5、10～14—供試品溶液B；6—牛蒡子對(duì)照藥材；7—牛蒡子陰性溶液；8—甘草陰性溶液；9—甘草對(duì)照藥材。圖5 牛蒡子TLC鑒別(可見光)Fig.5 Identification of Arctii Fructus using TLC (visible light)

2.4.5 淡豆豉、荊芥穗共同鑒別

注：1～5、10～14—供試品溶液B；6—淡豆豉對(duì)照藥材；7—淡豆豉陰性溶液；8—荊芥穗陰性溶液；9—荊芥穗對(duì)照藥材。圖6 淡豆豉TLC鑒別(254 nm紫外光)Fig.6 Identification of Sojae Semen Praeparatum using TLC (254 nm ultraviolet light)

注：1～5、10～14—供試品溶液B；6—淡豆豉對(duì)照藥材； 7—淡豆豉陰性溶液；8—荊芥穗陰性溶液；9—荊芥穗對(duì)照藥材。 圖7 荊芥穗TLC鑒別Fig.7 Identification of Schizonepetae Spica using TLC

3 討論

通過對(duì)銀翹散各單味藥材的系列薄層鑒別探索，發(fā)現(xiàn)蘆根在各展開劑條件下斑點(diǎn)稀少，在紫外和可見光下，與銀翹散各部分供試品溶液無對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)；淡竹葉中與銀翹散供試品溶液有一對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，但此成分不穩(wěn)定，放置1 h后，此斑點(diǎn)消失；桔梗與銀翹散供試品溶液有對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，但陰性對(duì)照的干擾較大。因此在對(duì)銀翹散進(jìn)行薄層鑒別時(shí)，只保留了金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、甘草、淡豆豉、荊芥穗等7味藥材的鑒別方法。

本文采用系列薄層色譜法對(duì)銀翹散樣品進(jìn)行系統(tǒng)提取，一次制備得到三個(gè)不同極性部位的供試品溶液，同法制備各單味藥陰性對(duì)照溶液；所有對(duì)照藥材溶液均采用甲醇浸泡過夜方法制備，操作非常簡單。然后對(duì)不同極性部位的供試品、陰性對(duì)照、對(duì)照藥材溶液進(jìn)行展開，找出適合鑒別該藥材的供試品溶液，建立該藥材的薄層鑒別方法；并且實(shí)現(xiàn)了一塊薄層板、一次展開即可分別對(duì)牛蒡子與甘草、淡豆豉與荊芥穗進(jìn)行共同鑒別。而傳統(tǒng)薄層鑒別中[6-8]，需要對(duì)中藥復(fù)方制劑中每一味藥材都建立一種供試品處理方法和一種展開條件，相比之下，本方法不僅節(jié)省了大量的供試品處理時(shí)間，且僅使用對(duì)照藥材作為對(duì)照，節(jié)省了中藥生產(chǎn)企業(yè)大量的檢測成本，具有可操作性強(qiáng)、檢測成本低、方法簡單等優(yōu)點(diǎn)。

本文建立的銀翹散中金銀花、連翹、牛蒡子、薄荷、甘草、淡豆豉、荊芥穗等7味藥材定性鑒別方法，找到了各單味藥的專屬斑點(diǎn)，斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)一致、清晰，Rf值適中，且陰性無干擾。此方法簡單快捷、重復(fù)性良好、可行性強(qiáng)，可以快速有效地鑒別銀翹散中7味藥材，為《中國藥典》中銀翹散薄層鑒別內(nèi)容補(bǔ)充和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其他銀翹散成方制劑的TLC鑒別提供了參考。