黃芪-白茅根治療慢性腎小球腎炎作用機制的可視化分析

祝曉麗，高家榮,2*，施苗苗，秦秀娟，魏良兵，劉濤，張魏

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學 中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis ，CGN)屬于中醫(yī)“水腫”“尿血”“腰痛”等范疇[1]，具有起病隱匿、遷延不愈、預后差等特點，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，是臨床研究的重點[2]。CGN是腎小球硬化和終末期腎病的最常見原因，常導致患者出現(xiàn)蛋白尿、血尿[3]。本病早中期無明確、有效的治療方法，應(yīng)用西藥有一定的治療作用，但經(jīng)常出現(xiàn)不良反應(yīng)且治療作用有限。中醫(yī)藥在CGN治療上優(yōu)點顯著，可改善患者臨床癥狀、減輕反跳現(xiàn)象，保護腎臟功能及延緩腎病進展[4-6]。黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，書中謂其味甘，微溫，可升可降，陽中之陽也，具有大補元氣、健脾補腎、利水消腫的作用，乃補氣之圣藥，常用來治療各種腎臟疾病[7]。研究表明，黃芪可促進蛋白質(zhì)合成，提高血漿蛋白水平，促進尿鈉排泄，改善機體水液代謝，消除水腫，緩解癥狀[8-10]，減少腎臟組織的損害。白茅根具有清熱利尿，利水消腫，導熱下行的功效[11]。陳蘭英等[12]以阿霉素造模，構(gòu)建大鼠模型，以白茅根的不同提取物為研究內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)其對模型大鼠有不同程度的保護作用，并且其作用機制可能是通過降低TGF-β1以及NF-κB p65的表達，抑制TNF-α的活性，進而改善阿霉素腎病大鼠腎組織病變。黃芪健脾益氣，白茅根清熱利尿，二藥配伍，扶正祛邪，標本兼治，共奏健脾益氣、清熱利濕之功。黃芪得白茅根，固表而不致留邪；白茅根得黃芪，祛邪而不傷正，補中寓疏，散中寓補，內(nèi)外兼顧。但是，黃芪-白茅根在CGN治療中的作用機制尚不清楚。因此，本研究借助可視化工具，初步對黃芪-白茅根在CGN治療中的作用進行探討，為臨床治療CGN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黃芪、白茅根的活性成分及CGN靶點的篩選

應(yīng)用BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、TCMSP(https://tcmsp-e.com/)檢索黃芪和白茅根相關(guān)的成分，為獲得黃芪、白茅根的活性成分，將口服生物利用度OB ≥30%以及類藥性DL ≥0.18 設(shè)為篩選條件[13-16]。通過SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和Uniprot(http://www.uniprot.org/)獲取活性成分的靶點信息[17-18]。關(guān)鍵詞為“chronic glomerulonephritis”，使用GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/) 、DisGeNET(https://www.disgenet.org/) 、Drugbank(https://go.drugbank.com/) 、DiGSeE(http://210.107.182.61/geneSearch/)數(shù)據(jù)庫收集CGN疾病靶點[19-23]。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確黃芪-白茅根與CGN潛在靶點間的相互作用，利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將藥物與CGN疾病靶點取交集，獲得潛在交集靶點。應(yīng)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建核心成分-靶點、藥物-活性成分-交集靶點-疾病以及靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。本文中藥物為黃芪與白茅根，核心成分是指在活性成分篩選出來的基礎(chǔ)之上，應(yīng)用Cytoscape3.7.1軟件“Network Analyzer”功能，以網(wǎng)絡(luò)整體的節(jié)點度值(degree)、介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)以及接近中心性(closeness centrality，CC)3個重要拓撲參數(shù)的中位數(shù)為篩選條件，篩選出來的成分。

1.3 核心蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將活性成分和疾病的交集靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/ )[24]，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用( protein-protein interaction， PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用Cytoscape3.7.1軟件“Network Analyzer”功能，分別以degree、BC、CC中位數(shù)為條件，篩選核心靶點，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點大小和顏色深淺反映degree值大小[25]。

1.4 GO和KEGG分析

將潛在靶點導入Omicshare(https://www.omicshare.com/)平臺，物種設(shè)置為人類，進行基因本體( gene ontology， GO)(http://geneontology.org/)分析(P<0.05)，并分別篩出前20個功能類別構(gòu)建圈圖，GO相關(guān)條形圖由軟件R 4.1.0完成。對靶蛋白進行京都基因與基因組百科全書( Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)(https://www.kegg.jp/)富集分析(P<0.05)，選擇前20條KEGG通路構(gòu)建圈圖。

1.5 分子對接

應(yīng)用AutoDock Vina以及LigPlot軟件進行分子對接。結(jié)合能 ≤ 0 kJ/mol表明該化合物能與靶結(jié)合并相互作用，而結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol表明表現(xiàn)出很強的結(jié)合力[26]。

2結(jié)果與分析

2.1 黃芪-白茅根活性成分及靶點篩選

從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索到黃芪35個成分，白茅根7個成分；TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到黃芪87個成分，白茅根33個成分。依據(jù)條件，共篩選出26個活性成分，其中黃芪22個，白茅根3個，1個為兩者共有，主要成分見表1(全表見OSID附表1)。利用SwissTargetPrediction和Uniprot兩個數(shù)據(jù)庫獲得271個活性成分靶點，其中黃芪有263個，白茅根有52個，44個為兩者共有，按照degree、BC、CC中位數(shù)為篩選條件獲得14個核心成分，并將獲得信息導入Cytoscape 3.7.1，構(gòu)建核心成分-活性靶點網(wǎng)絡(luò)，藍色三角形為成分，黃色為活性成分靶點，見圖1。

表1 黃芪-白茅根部分主要活性成分篩選結(jié)果Table 1 Screening results of part of the active components of Astragali Radix-Imperatae Rhizomain

注：藍色三角形為核心成分，黃色為相對應(yīng)的靶點。圖1 核心成分-活性靶點互作網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Core component-active target interaction network

2.2 黃芪-白茅根靶點與CGN靶點的交集分析

通過GeneCards、OMIM、DisGeNET、Drugbank、DiGSeE數(shù)據(jù)庫獲得2 360個CGN相關(guān)靶點，利用Venny將活性成分與疾病靶點取交集，獲得143個交集靶點，上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，去除游離靶點后將信息導出，通過Cytoscape 3.7.1軟件對交集靶點信息分析，獲得交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖,其顏色越紅表示degree值越大，見圖2。

圖2 成分和疾病交集靶點分析Fig.2 Analysis of the components and disease intersection targets

2.3 藥物-活性成分-交集靶點-疾病互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

藥物-活性成分-交集靶點-疾病互作網(wǎng)絡(luò)中共包括169個節(jié)點，517條邊，粉色菱形為藥物，紫色六邊形為CGN，綠色三角為活性成分，淺藍色長方形為活性成分和CGN的交集靶點，見圖3。

注：粉色菱形為藥物，紫色六邊型為疾病，綠色為活性成分，degree值越大綠色三角越大，淺藍色為活性成分和疾病的交集靶點。圖3 藥物-活性成分-交集靶點-疾病互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Drug-active ingredient-intersection target-disease interaction network

2.4 GO分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4.1 GO功能富集分析

對黃芪-白茅根治療CGN涉及的143個靶蛋白進行了分析，共獲得7 084個GO相關(guān)過程，以P<0.05為篩選條件，篩選出差異的生物過程(biological process，BP)有3 982個相關(guān)過程，細胞成分(cellular component，CC)有233個相關(guān)過程，分子功能(molecular function，MF)有448個相關(guān)過程。按照P值從小到大的順序選取前20做圈圖，圖4(a)列出了GO-BP富集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根主要涉及到含氧化合物的反應(yīng)、細胞增殖、激素反應(yīng)等過程。圖4(b)列出了GO-CC富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根主要作用于細胞膜、質(zhì)膜和胞外空間。對于GO-MF富集分析，其結(jié)果在圖4(c)中展現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根的靶標涉及信號受體結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚化活性以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。4(d)為各選取BP、CC、MF前10個相關(guān)過程所做的條形圖。圖4相關(guān)表格見OSID附表2～4。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

圖4(續(xù))

2.4.2 KEGG富集通路分析

對黃芪-白茅根治療CGN涉及的交集靶點進行分析，獲得230個KEGG信號通路，以P<0.05為篩選條件，篩選出差異KEGG條目159個，P值從小到大排序，對前20條信號通路分析，發(fā)現(xiàn)其涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、C型凝集素受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等，主要通路見表2(全表見OSID附表5)。圖5(b)中網(wǎng)絡(luò)圖紅色為P值較小的前20通路，紅色三角形表示通路黃色為富集在相關(guān)通路上面的相關(guān)靶點，見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

表2 藥物與疾病交集靶點的部分KEGG通路富集Table 2 Part of KEGG pathway enrichment of drug and disease intersection targets

2.5 核心PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將活性成分-疾病的交集數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.1軟件，利用degree、BC、CC中位數(shù)為篩選條件獲得55個核心靶點，再以degree值從大到小排序，篩選前10個靶點，IL-6、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、PTGS2、JUN、CASP3、MMP9、EGF用于分子對接，見圖6。

圖6 藥物-疾病交集靶點核心PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Core PPI network of drug-disease intersection targets

2.6 核心成分與核心靶點對接

結(jié)果顯示，所有分子與蛋白的結(jié)合能均小于-20.93 kJ/mol，說明配體能與受體自發(fā)結(jié)合，其中槲皮素(MOL000098)、異鼠李素(MOL000354)、山柰酚(MOL000422)、dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol(MOL000380)與核心靶點TNF結(jié)合能最好，見圖7。

圖7 活性化合物和靶點蛋白分子對接結(jié)果及MOL000098與TNF的分子對接圖Fig.7 Docking results of active compounds and target proteins and molecular docking diagram of MOL000098 and TNF

3 討論

本文借助可視化相關(guān)工具，初步探究黃芪-白茅根治療慢性腎炎的作用。通過TCMSP及BATMAN-TCM兩個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果進行整合和刪減，最終得到與黃芪-白茅根相關(guān)的活性成分27個、271個靶點。通過挖掘GeneCards、OMIM、DisGeNET、Drugbank、DiGSeE這5個疾病數(shù)據(jù)庫，共獲得了2 360個CGN相關(guān)靶點。通過在線工具繪制了黃芪-白茅根相關(guān)靶點和CGN相關(guān)靶點的維恩圖，得到黃芪-白茅根治療CGN的143個潛在治療靶點。CGN作為一種自身免疫介導的腎小球損傷的慢性腎臟疾病，以循環(huán)炎癥細胞浸潤以及腎小球細胞增殖為特征[27-28]，其中槲皮素在藥物-活性成分-交集靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中degree最高，被認為是潛在的活性成分，在CGN的治療中起著關(guān)鍵的作用，表現(xiàn)出較強的抗炎和抑制增殖的作用。Yuan等[29]發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過抑制中性粒細胞炎癥反應(yīng)減輕炎癥進展；Liu等[30]發(fā)現(xiàn)槲皮素還可降低TNF-α誘導的系膜細胞增殖，抑制PTX3生成，參與NF-κB信號通路；Ishikawa等[31]通過對總細胞數(shù)、有絲分裂細胞的百分比和[(3) H]-胸苷的摻入進行評估，3種測定都表明槲皮素顯著減弱了大鼠腎小球系膜細胞的促有絲分裂活性。用過氧化氫或TNF-α 刺激，來研究槲皮素對細胞凋亡的影響，最終發(fā)現(xiàn)槲皮素具有在體外和體內(nèi)抑制腎小球細胞有絲分裂和凋亡的潛力。

對藥物和疾病的交集靶點進行GO分析，探討其生物學機制，提示黃芪-白茅根藥對CGN的治療機制是多個靶點的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根藥對主要涉及到含氧化合物的反應(yīng)、細胞增殖、激素反應(yīng)等過程?；谒幬锖图膊〗患悬c的KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)黃芪-白茅根治療CGN的潛在通路與IL-17信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等信號通路密切相關(guān)，IL-17A和IL-17F可以單獨誘導促炎基因表達，特別是與TNF-α、IL-6、G-CSF、IL-1、CXCL、CCL20和基質(zhì)金屬蛋白酶協(xié)同作用。IL-17通過激活NF-κB、MAPK和C/EBP級聯(lián)途徑上調(diào)這些致炎基因[32]。經(jīng)典的PI3K-AKT通路調(diào)節(jié)許多慢性腎臟疾病的發(fā)展過程，包括增殖和炎癥，是慢性腎臟疾病中上調(diào)最頻繁的途徑，包括CGN[33]。慢性腎小球腎炎炎性損傷主要包括炎性因子異常高表達、炎癥信號通路激活等，其中p38MAPK炎癥信號通路在腎組織炎性病變過程中具有重要意義[34]。

基于中藥活性成分與疾病潛在靶標之間的相互作用，網(wǎng)絡(luò)藥理學方法可從網(wǎng)絡(luò)拓撲分析中識別潛在的機制和關(guān)鍵靶標。可用于確定草藥成分的協(xié)同作用，了解中藥配方的組合規(guī)則，并最終幫助臨床醫(yī)生合理地設(shè)計中藥配伍[35]。分子對接技術(shù)在藥物靶標結(jié)合預測和合成藥物設(shè)計中起著重要作用，能夠預測藥物配體和蛋白質(zhì)受體的對接模式和結(jié)合親和力(表明對接模式的穩(wěn)定性)。我們對篩選出的核心成分和核心靶點進行了分子對接，以驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學的結(jié)果。IL-6、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、PTGS2等55個蛋白靶點是黃芪-白茅根治療CGN過程中的關(guān)鍵靶點，提示黃芪-白茅根可能通過調(diào)控這些靶點發(fā)揮作用，改善CGN。有研究發(fā)現(xiàn)[36]，腎組織中的細胞因子失衡表現(xiàn)為促炎性 IL-17、IL-6、TNF-α水平升高以及抗炎性IL-10和T調(diào)節(jié)細胞水平降低，細胞因子的失衡反映了CGN的高活性和疾病進展的風險?；诤诵腜PI網(wǎng)絡(luò)分析，我們選擇了10個靶點用于后續(xù)分子對接。從活性成分-活性靶點網(wǎng)絡(luò)中按照degree、BC、CC中位數(shù)為篩選條件獲得了靶向這些蛋白質(zhì)的14個核心成分，包括槲皮素、異鼠李素、山柰酚等。采用AutoDock Vina和LigPlot進行對接并且使用PyMOL軟件可視化，見圖7。在我們選擇的10個核心靶點中，TNF與槲皮素、異鼠李素、山柰酚以及dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol的結(jié)合親和力最低。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接闡述了黃芪-白茅根的活性成分、靶點及通路之間相互作用的關(guān)系，黃芪-白茅根的活性成分可通過多靶點、多通路發(fā)揮治療CGN的作用，為黃芪-白茅根治療CGN的提供了理論依據(jù)。