芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性及機(jī)制

李遠(yuǎn)頌， 何榮榮， 蔡佳欣， 陳 達(dá)， 陳文學(xué),*

(1.天津大學(xué) 精密儀器與光電子工程學(xué)院， 天津 300072； 2.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228； 3.海南大學(xué) 研究生處， 海南 ?？?570228)

食源性疾病已成為食品安全和公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的重要問(wèn)題，致病菌污染是引起食源性疾病的主要原因。假單胞菌屬可以產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶等多種酶，是冷藏和有氧條件下肉品中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌和致病菌[1]。莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonasfragi)是一種隸屬于假單胞菌屬的革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛存在于冷藏肉及肉制品中[2]，極易導(dǎo)致肉品變質(zhì)。食品工業(yè)中常采用添加防腐劑的方法進(jìn)行食品防腐，然而化學(xué)防腐劑的長(zhǎng)期使用、超標(biāo)使用或非法使用，會(huì)對(duì)人體健康造成一定損害，如誘癌、致畸、食物中毒等[3]，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題[4]。天然防腐劑根據(jù)來(lái)源不同可分為植物源、動(dòng)物源和微生物源三種[5]，因其具有抑菌性強(qiáng)、安全性高、來(lái)源范圍廣、風(fēng)味影響小等優(yōu)點(diǎn)，已成為食品添加劑研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。天然植物源中提取的植物精油在具有上述優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，還富含大量生理活性物質(zhì)，對(duì)關(guān)注食品安全和生命健康的消費(fèi)者及研究者來(lái)說(shuō)更具吸引力[6]。

芳樟醇(3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇)，別名里那醇，是一種無(wú)色或淺黃色、易揮發(fā)的液體，存在于多種植物精油中。芳樟醇具有較高的安全性，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.148—2015將芳樟醇列入食品添加劑，美國(guó)食品和藥物管理局將芳樟醇?xì)w類為“公認(rèn)安全使用物質(zhì)”(GRAS)[7]。芳樟醇可用作天然食用香料，也可用于配制食用香精，在食品生產(chǎn)加工過(guò)程中常用作增香劑和調(diào)味劑；同時(shí)，芳樟醇具有良好的抗菌活性。研究表明，芳樟醇對(duì)銅綠假單胞菌[8]、熒光假單胞菌[9]、腐敗希瓦氏菌[10]和大腸桿菌[11]等細(xì)菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)白色念珠菌[12]、皮膚癬菌[13]等真菌也具有抑菌活性，氣相的芳樟醇對(duì)大腸桿菌也具有較強(qiáng)的氣相抗菌活性[14]。研究認(rèn)為，芳樟醇在活性食品包裝中具有應(yīng)用前景，可通過(guò)微膠囊化[15]、制備抗菌膜[16]等方式釋放其抗菌活性，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。目前，芳樟醇的抑菌機(jī)制尚不明確，有關(guān)芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性及機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。

本研究擬以莓實(shí)假單胞菌為指標(biāo)菌，探討芳樟醇對(duì)其抑菌活性及作用機(jī)制。通過(guò)測(cè)定芳樟醇的最小抑菌濃度(MIC)，判斷其抑菌作用強(qiáng)弱；采用紫外分光光度法測(cè)定指標(biāo)菌的生長(zhǎng)曲線，評(píng)價(jià)芳樟醇的抑菌活性；通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察、結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)、二乙酸熒光素(FDA)染色實(shí)驗(yàn)以及測(cè)定電導(dǎo)率、核酸泄漏、呼吸代謝活力和呼吸鏈脫氫酶活性的變化，考察芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞作用和呼吸代謝的抑制作用，探究芳樟醇對(duì)指標(biāo)菌的抑菌機(jī)制，希望為其應(yīng)用于食品保鮮和開(kāi)發(fā)天然防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莓實(shí)假單胞菌(CGMCC1.3349)，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

芳樟醇，海南康馥納生物有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯、瓊脂、無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS，濃度為0.1 mol/L，pH值7.4)、二乙酸熒光素(FDA)、碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT)、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、無(wú)水乙醇、甲醇、丙酮、鹽酸、正丁醇，廣州化學(xué)試劑廠；結(jié)晶紫、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水葡萄糖，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR124CN型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；GI54DS型高壓滅菌鍋，致微(廈門(mén))儀器有限公司；SPX- 288型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；SW- CJ- 1FD型無(wú)菌超凈工作臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；TU1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用設(shè)備有限責(zé)任公司；Verios G4 UC型掃描電子顯微鏡，賽默飛世爾科技布爾諾有限公司；SP- Max3500FL型多功能酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技公司；SHA- 2型恒溫振蕩器、HH- 4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；CR22N型落地式高速冷凍離心機(jī)，日本日立(Hitachi)工機(jī)有限公司；F- 280型熒光分光光度計(jì)，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；DDS- 307型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化與菌懸液制備

將莓實(shí)假單胞菌接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行傳代活化。

莓實(shí)假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl)洗脫，菌懸液以6 000 r/min低溫離心10 min，所得菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次并重懸；采用麥?zhǔn)媳葷岱╗17]，將菌懸液的濃度調(diào)至106～107CFU/mL備用。

1.3.2最小抑菌濃度的測(cè)定

采用培養(yǎng)基稀釋法[18]測(cè)定芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌作用的最小抑菌濃度(MIC)。將芳樟醇溶解于體積分?jǐn)?shù)為1%的乙醇溶液后，稀釋配成濃度(芳樟醇含量)分別為120.00、60.00、30.00、15.00、7.50、3.75 mL/L的抑制液。取2 mL不同濃度的抑制液分別與18 mL溫度為40～60 ℃的營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基混勻，使芳樟醇的終濃度分別為12.000、6.000、3.000、1.500、0.750、0.375 mL/L；以加入等量無(wú)菌水、1%乙醇溶液分別作為空白組和陰性對(duì)照組。培養(yǎng)基凝固后，取100 μL菌懸液于平板上均勻涂布，30 ℃下培養(yǎng)24 h；觀察菌落情況，以肉眼看不見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小稀釋濃度作為MIC。

1.3.3細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的繪制

采用紫外分光光度法[19]測(cè)定莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)曲線。按1.3.1方法制備菌懸液，以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；以加入濃度為1倍MIC(1MIC)和2倍MIC(2MIC)的芳樟醇為實(shí)驗(yàn)組，按1.3.2方法設(shè)置空白組和陰性對(duì)照組，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣，并測(cè)定600 nm處的吸光值(OD600)，連續(xù)24 h。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，所測(cè)吸光值為縱坐標(biāo)，繪制莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)觀察

參照Yi等[20]的方法并做適當(dāng)修改。制備菌懸液并設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、空白組和陰性對(duì)照組，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)4、8 h的菌懸液離心，菌體用PBS洗滌3次后，用乙醇溶液(20%、40%、60%、80%)進(jìn)行梯度脫水并用無(wú)水乙醇洗脫3次，于-20 ℃預(yù)凍后再真空冷凍干燥12 h，取完全干燥的菌體上樣、鍍金，用掃描電子顯微鏡放大8 000倍觀察細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)

結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)參照Kang等[21]的方法并做適當(dāng)修改。制備菌懸液并設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、空白組和陰性對(duì)照組，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)4、8 h的菌懸液，6 000 r/min低溫離心10 min，菌體用PBS洗滌3次，與結(jié)晶紫溶液混勻，室溫避光孵育15 min，離心取上清液，測(cè)定其OD590值。

1.3.6二乙酸熒光素染色實(shí)驗(yàn)

二乙酸熒光素(FDA)染色實(shí)驗(yàn)參照曾哲靈等[22]的方法并做適當(dāng)修改。制備菌懸液并設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、空白組和陰性對(duì)照組，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)0、4、8 h的菌懸液離心收集菌體，PBS洗滌后離心棄上清液，加入250 μL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的FDA-丙酮溶液，共同孵育20 min，低溫離心，用PBS洗滌3次并重懸，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其平均熒光強(qiáng)度。

1.3.7電導(dǎo)率的測(cè)定

電導(dǎo)率的測(cè)定參照Diao等[23]的方法并做適當(dāng)修改。莓實(shí)假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將菌懸液離心，用PBS洗滌3次并重懸；設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、空白組和陰性對(duì)照組，每隔15 min用電導(dǎo)率儀測(cè)定1次菌懸液的電導(dǎo)率，連續(xù)90 min。

1.3.8核酸泄漏的測(cè)定

核酸泄漏的測(cè)定參照Shi等[24]的方法并做適當(dāng)修改。制備菌懸液并設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、空白組和陰性對(duì)照組，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。取培養(yǎng)0、2、4、6、8 h的菌懸液低溫離心10 min，分別測(cè)定各上清液的OD260值并繪制曲線。

1.3.9呼吸代謝活力的測(cè)定

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液低溫離心收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次并重懸，將重懸液濃度調(diào)至OD600為0.5。向所得重懸液中加入不同濃度的芳樟醇，設(shè)置空白組和陰性對(duì)照組，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)0、2、4、6、8、10 h的菌懸液低溫離心，所得菌體用無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，重新將菌體的OD600值調(diào)至0.5。用甲醇溶液配制INT溶液，濃度為0.01 mol/L，將150 μL的INT溶液加入1 350 μL菌懸液中使INT溶液終濃度為1 mmol/L，30 ℃孵育30 min，測(cè)定各組菌懸液的OD630值。

1.3.10呼吸鏈脫氫酶的測(cè)定

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液1 mL于試管中，然后向管中依次加入2 mL的Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH值8.6)、2 mL葡萄糖溶液(0.1 mol/L)和2 mL的TTC溶液(1 mg/mL)并混勻。向所得混合物中加入不同濃度的芳樟醇，設(shè)置空白組和陰性對(duì)照組，將各試管置于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)0、2、4、6、8、10 h的實(shí)驗(yàn)試管，向各管中加入2滴濃HCl終止反應(yīng)，然后各加入5 mL正丁醇振蕩萃取，待產(chǎn)物完全進(jìn)入上層，靜置后取上層液體低溫離心10 min；用正丁醇調(diào)零，測(cè)定各上清液的OD490值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P<0.05表示存在顯著性差異；使用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性分析

2.1.1芳樟醇的最小抑菌濃度分析

最小抑菌濃度(MIC)是衡量和評(píng)價(jià)物質(zhì)抑菌能力的主要指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，較低的濃度即可抑制莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)，且抑菌效果隨芳樟醇濃度的增大而增強(qiáng)；當(dāng)芳樟醇的稀釋濃度最小達(dá)到1.5 mL/L時(shí)，培養(yǎng)基上肉眼看不見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，因此芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的MIC為1.5 mL/L。未添加芳樟醇的空白組(無(wú)菌水)和陰性對(duì)照組(1%乙醇)中均有大量菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明其對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)未產(chǎn)生抑制作用或作用不明顯。

2.1.2芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)的影響

細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線可以直觀反映其生長(zhǎng)情況及生長(zhǎng)速率。為研究芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)的影響，在研究抑菌活性的基礎(chǔ)上，測(cè)定了莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1。由圖1可知，空白組和陰性對(duì)照組的細(xì)菌生長(zhǎng)均呈典型的S型生長(zhǎng)曲線，空白組經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的延滯期后，OD值顯著增高，進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期；陰性對(duì)照組生長(zhǎng)略微緩慢于空白組，最終與空白組同時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，表明1%的乙醇有一定的抑菌作用，但對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響不大。含有1MIC和2MIC芳樟醇的實(shí)驗(yàn)組，生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)顯著差異，OD值基本處于低值波動(dòng)，數(shù)值和增長(zhǎng)幅度明顯低于空白組和陰性對(duì)照組，說(shuō)明細(xì)菌生長(zhǎng)較為緩慢。結(jié)果表明，芳樟醇延緩了莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，能有效抑制莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)。

圖1 莓實(shí)假單胞菌的生長(zhǎng)曲線

2.2 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞形態(tài)的影響

通過(guò)掃描電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察，更直觀地考察芳樟醇作用后莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果如圖2。由圖2中(a1)、(a2)可知，空白組的莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞呈正常的短桿狀，具有清晰的細(xì)胞邊界，結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)飽滿、表面光滑、分布均勻。從圖2中(b1)、(b2)可知，陰性對(duì)照組的莓實(shí)假單胞菌經(jīng)乙醇處理4 h和8 h后，細(xì)胞無(wú)褶皺變形，形態(tài)較為完好，未發(fā)生明顯改變，大部分仍呈正常的短桿狀，說(shuō)明1%乙醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞形態(tài)的影響較小。相比之下，實(shí)驗(yàn)組的變化則較為明顯，添加1MIC、2MIC的芳樟醇作用4 h后[圖2(c1)、(d1)]，莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大變化，細(xì)胞邊界變得模糊，細(xì)胞出現(xiàn)扭曲變形和堆疊黏連，部分細(xì)胞出現(xiàn)空洞干癟；芳樟醇作用8 h后[圖2(c2)、(d2)]，莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞形態(tài)受到嚴(yán)重破壞，菌體發(fā)生凹陷，細(xì)胞畸變?cè)黾樱霈F(xiàn)明顯的細(xì)胞破裂和黏合現(xiàn)象，基本沒(méi)有形態(tài)正常的細(xì)胞；添加2MIC芳樟醇的細(xì)胞形態(tài)影響更為顯著，細(xì)胞破損黏合成團(tuán)，完全失去其原有形態(tài)。細(xì)胞形態(tài)的改變可能是因?yàn)榉颊链计茐牧思?xì)菌的細(xì)胞膜，引起胞內(nèi)物質(zhì)外泄所致。本研究結(jié)果表明，芳樟醇能夠破壞莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

圖2 莓實(shí)假單胞菌的掃描電鏡圖

2.3 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜的影響

細(xì)胞膜能保護(hù)胞內(nèi)物質(zhì)和能量的平衡，從而使細(xì)胞維持正常的生命活動(dòng)。研究表明，抑菌物質(zhì)一般通過(guò)作用于細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，因此可通過(guò)考察芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜的影響，來(lái)揭示其抑菌作用機(jī)制。

2.3.1結(jié)晶紫染色結(jié)果分析

結(jié)晶紫是一種疏水染料，完整的細(xì)胞膜可抑制結(jié)晶紫進(jìn)入細(xì)胞；但當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，膜的通透性增大，結(jié)晶紫可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞膜吸收結(jié)晶紫而被染色。本研究采用結(jié)晶紫染色法考察細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷，進(jìn)而探討芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜的作用機(jī)制。不同培養(yǎng)時(shí)間莓實(shí)假單胞菌對(duì)結(jié)晶紫的吸收情況(OD590值變化情況)如圖3。由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組、陰性對(duì)照組、1MIC和2MIC實(shí)驗(yàn)組的OD值均降低，說(shuō)明8h時(shí)細(xì)胞對(duì)結(jié)晶紫的吸收程度低于4 h時(shí)。在兩個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)，加入芳樟醇處理的實(shí)驗(yàn)組OD值明顯高于空白組和陰性對(duì)照組，說(shuō)明芳樟醇可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)結(jié)晶紫的吸收，使得590nm處的OD值較未處理組增大。結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芳樟醇作用可導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，從而增加細(xì)胞膜的通透性，增強(qiáng)其對(duì)結(jié)晶紫的吸收。

不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。

2.3.2二乙酸熒光素染色結(jié)果分析

二乙酸熒光素(FDA)是一種脂質(zhì)分子，不帶熒光和電荷，容易通過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞中被酶水解為熒光素。采用FDA染色方法，通過(guò)測(cè)定菌懸液的熒光強(qiáng)度，判斷細(xì)胞膜是否被破壞，進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷。不同培養(yǎng)時(shí)間莓實(shí)假單胞菌的FDA熒光強(qiáng)度變化情況如圖4。由圖4可知，空白組和陰性對(duì)照組的熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，說(shuō)明熒光素留在了細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出黃綠色熒光，此時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，通透性變化?。欢颊链继幚淼膶?shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，2MIC組的熒光強(qiáng)度比1MIC組降低更多，熒光素的泄漏導(dǎo)致了熒光強(qiáng)度的降低，說(shuō)明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致FDA外泄。FDA染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芳樟醇作用能破壞細(xì)胞膜的完整性，隨著芳樟醇濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜的受損程度更加明顯。

不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著。

2.3.3對(duì)菌懸液電導(dǎo)率的影響

電導(dǎo)率變化是判斷細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的一個(gè)重要依據(jù)。通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌懸液的電導(dǎo)率大小及變化情況，研究芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5。由圖5可知，與空白組和陰性對(duì)照組相比，用芳樟醇處理的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的電導(dǎo)率均偏高。在正常生命活動(dòng)中，細(xì)胞內(nèi)外的離子在細(xì)胞膜屏障下，會(huì)維持動(dòng)態(tài)平衡，膜外環(huán)境的電導(dǎo)率基本不變。在抑菌物質(zhì)芳樟醇的作用下，莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞膜受損，失去保護(hù)能力和屏障作用，使原本細(xì)胞內(nèi)容物中的帶電離子(如K+、Na+、Ca2+、Mg2+等)泄漏到細(xì)胞膜外，內(nèi)部電解質(zhì)外泄，導(dǎo)致膜外環(huán)境的電導(dǎo)率升高。本研究結(jié)果表明，芳樟醇可通過(guò)損傷細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜的通透性，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

圖5 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌電導(dǎo)率的影響

2.3.4對(duì)核酸泄漏的影響

核酸具有編碼合成蛋白質(zhì)的功能，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，如果胞內(nèi)核酸丟失，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞外的核酸泄漏情況如圖6。

圖6 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌核酸泄漏的影響

由圖6可知，各組的OD值均隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，在測(cè)定時(shí)間點(diǎn)，芳樟醇處理的實(shí)驗(yàn)組OD值均高于空白組和陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組OD值在0～2 h時(shí)增長(zhǎng)最快，之后增長(zhǎng)速度放緩，說(shuō)明芳樟醇破壞了莓實(shí)假單胞菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核酸不斷從細(xì)胞膜內(nèi)流出，在0～2 h時(shí)破壞作用最明顯。本研究結(jié)果表明，芳樟醇不僅破壞了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，也導(dǎo)致了胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的泄漏，從而影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。這與郭俸鈺等[11]研究的芳樟醇對(duì)大腸桿菌的核酸泄漏影響結(jié)果相一致。

2.4 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌呼吸代謝的影響

2.4.1對(duì)呼吸代謝活力的影響

活細(xì)胞在脫氫酶的作用下生成的活化氫離子能把碘硝基氯化四氮唑藍(lán)(INT)還原成紫紅色的INT甲臜，沉積在細(xì)胞中。根據(jù)INT甲臜的生成情況，可考察細(xì)胞的代謝活力強(qiáng)弱。不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞呼吸代謝活力變化情況如圖7。由圖7可知，空白組細(xì)胞的呼吸代謝活力基本維持不變；陰性對(duì)照組的呼吸代謝活力略低于空白組，且處于一個(gè)較高的水平，說(shuō)明乙醇對(duì)細(xì)胞呼吸代謝活力的影響較小；相比空白組和陰性對(duì)照組，芳樟醇處理的實(shí)驗(yàn)組OD值明顯較低，還原出來(lái)的INT甲臜的量較少，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的呼吸代謝活力被抑制，細(xì)胞代謝活力較弱，生成的活化氫離子較少。本研究結(jié)果表明，芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的呼吸代謝活力有較大影響。

圖7 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌呼吸代謝活力的影響

2.4.2對(duì)呼吸鏈脫氫酶活性的影響

呼吸鏈負(fù)責(zé)通過(guò)氧化還原反應(yīng)將電子從電子供體轉(zhuǎn)移到電子受體，是維持細(xì)胞正常代謝的能量來(lái)源。TTC是一種小分子無(wú)色化合物，可滲透到細(xì)菌細(xì)胞中，與呼吸鏈脫氫酶發(fā)生反應(yīng)，被還原成紅色的1,3,5-三苯甲臜(TF)。可根據(jù)TF的生成情況，來(lái)考察細(xì)胞的呼吸鏈脫氫酶活性強(qiáng)弱。不同培養(yǎng)時(shí)間的呼吸鏈脫氫酶活性的變化情況如圖8。

圖8 芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌呼吸鏈脫氫酶活性的影響

由圖8可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組和陰性對(duì)照組的OD值先升高，6 h時(shí)達(dá)到最大值，然后開(kāi)始降低，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)6 h后細(xì)胞逐漸衰老，呼吸鏈脫氫酶的活性有所減弱；培養(yǎng)過(guò)程中，空白組和陰性對(duì)照組的OD值相差不大，說(shuō)明乙醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌呼吸鏈脫氫酶活性的影響較小。芳樟醇處理的實(shí)驗(yàn)組OD值均明顯低于空白組和陰性對(duì)照組，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌的呼吸鏈脫氫酶活性均較低，電子釋放較少，還原過(guò)程被抑制，導(dǎo)致生成TF的量較少。本研究結(jié)果表明，芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的呼吸鏈脫氫酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。細(xì)菌的呼吸鏈位于細(xì)胞膜上，芳樟醇可能破壞了細(xì)胞膜屏障，抑制了呼吸鏈脫氫酶的活性，對(duì)呼吸鏈造成損傷，進(jìn)而影響了細(xì)胞呼吸代謝。

3 結(jié) 論

本文研究了芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌的抑菌活性及作用機(jī)制，結(jié)果表明：芳樟醇對(duì)莓實(shí)假單胞菌具有較強(qiáng)的抑制作用，其最小抑菌濃度為1.5 mL/L；芳樟醇能破壞莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞膜的完整性，增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)向外泄漏；芳樟醇抑制呼吸鏈脫氫酶活性，破壞呼吸鏈，引起細(xì)胞呼吸代謝活力降低，從而導(dǎo)致胞內(nèi)代謝紊亂，抑制菌體生長(zhǎng)。本研究表明，芳樟醇具有較好的抑菌活性，能夠通過(guò)破壞莓實(shí)假單胞菌細(xì)胞原有的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和抑制莓實(shí)假單胞菌的呼吸代謝而發(fā)揮抑菌作用。目前對(duì)于芳樟醇抑菌機(jī)理的研究主要為基于細(xì)胞水平的初步探究，未來(lái)可采用基于蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及多組學(xué)聯(lián)合分析的方法，從分子層面開(kāi)展深入研究，進(jìn)一步闡明芳樟醇的抑菌機(jī)理。