摩洛哥自然發(fā)酵駝乳中乳酸菌分離鑒定及特性研究

柳 青， 史 迪， 劉文俊， 張和平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

畜牧業(yè)是摩洛哥王國(guó)非常重要的支柱產(chǎn)業(yè)，駱駝、牛、羊等為主要飼養(yǎng)對(duì)象。當(dāng)?shù)卦鷳B(tài)的生活方式和獨(dú)特自然條件下造就出的自然發(fā)酵乳中含有豐富的微生物，且具有一定的地域特征，所以研究摩洛哥王國(guó)自然發(fā)酵乳中蘊(yùn)含的菌種資源有較大的應(yīng)用價(jià)值和理論意義[1-2]。

自然發(fā)酵乳制品包含豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其低pH值造就的獨(dú)特微生態(tài)環(huán)境，孕育了種類頗豐的乳酸菌資源[3]。駝乳是摩洛哥王國(guó)阿尤恩地區(qū)牧民在特殊的生存環(huán)境下經(jīng)常飲用的飲品之一，其乳汁濃厚，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分[4-5]。因此以駝乳為原料制成的酸駝乳、酸駝奶酪、駝奶酒等深受當(dāng)?shù)啬撩裣矏?，是阿尤恩地區(qū)的傳統(tǒng)食品。酸駝乳有較好的保健作用，包括提高人體免疫力、降血脂等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，駝乳有較低致敏性，一項(xiàng)為期3年的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嬰幼兒飲用駝乳較山羊奶更安全。酸駝乳還有預(yù)防癌癥的功效[7-8]。

駝乳產(chǎn)品的保健作用和優(yōu)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)令人矚目，乳酸菌的作用不容忽視。因此，世界各國(guó)都在發(fā)掘自然發(fā)酵駝乳中具有優(yōu)良益生特性的乳酸菌。樊哲新等[9]發(fā)現(xiàn)新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳中Lactobacillusplantarum和Lactobacillushelveticus豐度較高。張哲等[10]研究表明，內(nèi)蒙古阿拉善盟的發(fā)酵駝乳中，乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)乳酸菌屬。張苗苗等[11]發(fā)現(xiàn)哈密市原駝乳中，乳明串珠菌為優(yōu)勢(shì)乳酸菌。Khedid等[12]對(duì)摩洛哥南部30份駱駝乳樣品中分離出的120株乳酸菌進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬和乳球菌屬分別占37.5%和25.8%，為優(yōu)勢(shì)菌屬，主要菌種為L(zhǎng)actococcuslactissubsp.lactis。本研究針對(duì)摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳進(jìn)行細(xì)菌多樣性研究，以增加對(duì)不同地區(qū)駝乳細(xì)菌多樣性的了解，豐富乳酸菌資源。

本研究通過純培養(yǎng)方法，分離、鑒定樣品中細(xì)菌菌種組成，并通過 PacBio SMRT 測(cè)序技術(shù)以不同樣品為研究對(duì)象研究菌種多樣性，并從優(yōu)勢(shì)菌種中篩選生物學(xué)特性較好菌株，進(jìn)一步進(jìn)行表型實(shí)驗(yàn)。研究旨在揭示阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳細(xì)菌多樣性，幫助后續(xù)益生菌發(fā)掘，細(xì)化單菌株生化特性，希望為保護(hù)和豐富不同國(guó)家、地區(qū)自然發(fā)酵乳中乳酸菌資源及其開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4份自然發(fā)酵駝乳樣品均采集自摩洛哥王國(guó)阿尤恩地區(qū)，使用無菌工具采集樣品并即時(shí)低溫寄回。采集過程中，將一組樣品置于已滅菌的2 mL凍存管內(nèi)，用于乳酸菌的純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將另一組相同的樣品每份20 mL置于50 mL無酶無菌管中，并在其中加入10～15 mL的DNA TaKaRa保護(hù)液，用于宏基因組多樣性測(cè)序[13]。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10，大豆蛋白胨10，酵母浸出汁粉5，葡萄糖20，醋酸鈉5，檸檬酸二銨2，吐溫80 1，硫酸鎂0.58，硫酸錳0.28。

Lysozyme、egg white，法國(guó)Solarbio公司；TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒，北京天根生化科技有限公司；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒，美國(guó)Omega公司；SMRTbell Template Prep Kit 1.0試劑盒，美國(guó)Pacific Biosciences公司；KAPA HiFi Hot Start Ready Mix PCR Kit試劑盒，美國(guó)KAPA公司；API50CHL試劑盒，法國(guó)bioMerieux公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX- 700型高壓蒸汽滅菌器，日本Kagoshima Seisakusyo公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；PacBio RS II型測(cè)序系統(tǒng)，美國(guó)Pacific Biosciences公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品乳酸菌計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備試管裝生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%，4.5 mL/支)及1 mL槍頭，滅菌后將槍頭烘干放入超凈工作臺(tái)待用。將4份樣品梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7梯度計(jì)數(shù)，稀釋前需震蕩30 s保證菌體混合均勻[14]。稀釋完成，將試管中菌液混勻后，吸取1 mL加入培養(yǎng)皿，把培養(yǎng)基冷卻至55 ℃后，在已有菌液的玻璃平皿中傾注25～30 mL培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，計(jì)算1 mL樣品中乳酸菌菌落總數(shù)。

1.3.2乳酸菌的分離純化及保藏

選取10-5、10-6、10-7這3個(gè)梯度，將每支試管梯度稀釋液經(jīng)振蕩器混勻后，吸取200 μL移于提前準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基上，并使用涂布棒均勻涂布至液體全干，之后將涂布菌液的平皿倒置，防止污染，在厭氧工作站內(nèi)37 ℃培養(yǎng)72 h；提前在經(jīng)培養(yǎng)的涂布平板上用記號(hào)筆及放大鏡輔助選擇形態(tài)與其他菌不同的獨(dú)立生長(zhǎng)的單個(gè)菌落，經(jīng)菌株純化后，將革蘭氏染色陽性、無半透明外層、內(nèi)部著色均勻，過氧化氫酶陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸的細(xì)菌暫定為乳酸菌。將這些細(xì)菌純培養(yǎng)物用相同培養(yǎng)基在試管內(nèi)繼續(xù)傳至3代增強(qiáng)活性；利用低速離心機(jī)將3代分離株菌泥與培養(yǎng)基分離，并使用磷酸緩沖液(NaCl 0.8 g、Na2HPO40.115 g、KH2PO40.02 g/100 mL)將培養(yǎng)基成分清洗2次，得到的菌體在試管內(nèi)混合入800 μL凍菌保護(hù)劑(凍菌保護(hù)劑配方為每100 mL蒸餾水中包含8 g脫脂乳粉、2 g酵母粉，脫脂乳粉需滅菌后急速冷卻)，使用吸針分裝在干熱滅菌的安瓿管及濕熱滅菌的凍存管中，安瓿管每支填滿底部即可，經(jīng)液氮速凍后，在-80 ℃的超低溫冰箱冷凍保藏[13]。

1.3.3乳酸菌分子生物學(xué)鑒定

1.3.3.1 菌株DNA提取與擴(kuò)增

將裝有二代菌株的試管更換鋁帽后經(jīng)3 800 r/min低速離心5 min，去除分離出的培養(yǎng)基廢液；加入3 mL磷酸緩沖液重復(fù)離心操作2遍；之后經(jīng)振蕩器混合均勻，吸取1 mL菌懸液到EP管內(nèi)，12 000r/min條件下離心2 min，用1 mL槍頭吸凈上清廢液，使用天根試劑盒提取DNA并檢驗(yàn)其品質(zhì)。PCR擴(kuò)增體系及條件參考史迪等[15]的方法。

將品質(zhì)良好的PCR產(chǎn)物與冰袋共同包裝在保溫箱內(nèi)及時(shí)寄送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3.2 16S rRNA基因同源性比對(duì)

使用SeqMan軟件對(duì)測(cè)序得到的DNA兩條序列進(jìn)行拼接，此過程亦可判斷菌株純度，如得到雙峰或DNA序列雜亂無法拼接，則可判斷菌株有污染。完整的DNA序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行分類學(xué)地位鑒定，選擇相似度和覆蓋率較高的結(jié)果，確定其菌種。在NCBI數(shù)據(jù)庫Genome欄目?jī)?nèi)下載對(duì)應(yīng)菌種模式株序列，選擇標(biāo)準(zhǔn)為樣品分離菌株與模式株之間同源性>98%，使用Mega7.0軟件的鄰接法構(gòu)建樣品分離株及模式株共同的系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.4 自然發(fā)酵駝乳中細(xì)菌多樣性分析

1.4.1細(xì)菌宏基因組DNA的提取

將樣品混勻后使用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取樣品DNA；與此同時(shí)，利用測(cè)定OD值與電泳的方法檢驗(yàn)DNA的品質(zhì)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為OD260/280需處于1.8～2.0，DNA質(zhì)量濃度>20 ng/μL，如低于標(biāo)準(zhǔn)較多將無法成功測(cè)序；片段化程度小的DNA視為符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，提取好的DNA放置在-20 ℃冰箱備用[17]。

1.4.2細(xì)菌 16S rRNA 基因擴(kuò)增

利用KAPA HiFi Hot Start Ready Mix PCR Kit試劑盒，通過PCR擴(kuò)增得到宏基因組DNA模板。PCR產(chǎn)物需純化流程提高品質(zhì)，使用Qubit@ dsDNA HS Assay Kit試劑盒檢測(cè)實(shí)時(shí)DNA質(zhì)量濃度，DNA質(zhì)量濃度在20～100 ng/μL可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)[18]。

1.4.3PacBio SMRT三代測(cè)序及生物信息學(xué)分析

將品質(zhì)達(dá)標(biāo)的PCR產(chǎn)物，用試劑盒Pacific Biosciences SMRT bell TM Template Prep Kit構(gòu)建文庫，使用PacBio RS II儀器進(jìn)行測(cè)序[14]；使用QIIME平臺(tái)根據(jù)菌株DNA序列分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。每條DNA序列使用PyNAST軟件排齊后，對(duì)樣品及樣品中菌株劃分分類操作單元(OTU)，相似度達(dá)到≥97%便可聚為一簇，同一類群菌株親緣關(guān)系較近，再使用Greengenes等數(shù)據(jù)庫對(duì)比樣品分離菌株測(cè)序結(jié)果的代表性序列，確定各菌株種類，并進(jìn)一步分析樣品的α多樣性，判斷各菌種在整體菌株中相對(duì)豐度，包含超1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)[18]。

1.5 菌株的生理生化特性分析

1.5.1菌株發(fā)酵特性研究

對(duì)自然發(fā)酵駝乳中的48株優(yōu)勢(shì)菌株Lactococcuslactis的發(fā)酵特性初選，將菌株在37 ℃下培養(yǎng)24 h，以發(fā)酵乳pH值和乳酸含量為指標(biāo)，選出2株具有較低pH值、較高乳酸含量特性的優(yōu)良乳酸菌。

1.5.2最適發(fā)酵條件測(cè)定

將2%已混勻的菌懸液接入MRS液體培養(yǎng)基，分別放置于不同溫度(10、20、30、37、45、55、58 ℃)下發(fā)酵24 h，改變培養(yǎng)基pH值(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5)和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%)，測(cè)定OD600以確定菌株最適發(fā)酵條件。

1.5.3發(fā)酵產(chǎn)酸能力及生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將菌液按2%接種量接入改良牛乳培養(yǎng)基，最適溫度下靜置培養(yǎng)30 h，以O(shè)D600及活菌數(shù)為指標(biāo)，每2 h測(cè)定1次，并繪制生長(zhǎng)曲線。將菌液以2%的接種量接入牛乳，在最適溫度下發(fā)酵30 h，每2 h取樣1次，取樣前需要充分搖勻，并繪制產(chǎn)酸曲線。

1.5.4碳水化合物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

碳水化合物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)采用API50CHL系統(tǒng)，整體操作流程按照制造商的說明進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin軟件繪圖便于后續(xù)分析。本研究相關(guān)菌株序列已提交到MG- RAST數(shù)據(jù)庫，菌株序列號(hào)暫未釋放。

2 結(jié)果與分析

2.1 摩洛哥阿尤恩地區(qū)樣品乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果分析

4份樣品中乳酸菌活菌計(jì)數(shù)見表1，由表1可知不同樣品間活菌數(shù)均有差異。結(jié)果表明，摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳中乳酸菌活菌數(shù)介于5.15×106～6.92×106CFU/mL。同一地區(qū)自然發(fā)酵乳的活菌數(shù)差異，可能與樣品發(fā)酵和貯存條件等有關(guān)[14]。

表1 乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 摩洛哥阿尤恩地區(qū)乳酸菌分離純化結(jié)果分析

根據(jù)菌落形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)挑菌進(jìn)行純培養(yǎng)。4份自然發(fā)酵駝乳樣品分離得到82株菌，在涂布板上觀察樣品分離出的菌落形態(tài)。菌落呈圓形，邊緣呈鋸齒狀或光滑圓形，表面或有凸起，菌落顏色大多為純白色或者淡黃色，部分呈透明形態(tài)。將培養(yǎng)的菌株純培養(yǎng)物在顯微鏡下觀察，菌株球菌居多，呈圓或橢圓形，成對(duì)、四聯(lián)或成鏈狀均勻排列；桿菌鏡檢著色深淺不同、粗細(xì)及長(zhǎng)短不一，鏈狀或分散排列[19]。

2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果分析

82株乳酸菌分離株使用TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒提取DNA，菌株基因組質(zhì)量濃度均在100～300 ng/μL；OD260/280均處于1.8～2.0且0.8%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果合格，DNA質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和乳酸菌鑒定結(jié)果

4份樣品分離出的乳酸菌菌株見表2。乳酸菌被鑒定為3個(gè)屬、8個(gè)種，共82株乳酸菌。通過Seq-Man軟件拼接得到所需序列，比對(duì)確定其菌種，并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行比較。結(jié)果可知，4份自然發(fā)酵駝乳中的82株分離株顯示為乳酸菌。將分離株基因序列和參考菌株的基因序列使用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。MLGⅡ- 27(IMAU98045)與模式菌株EnterococcusitalicusDSM 15952T(AJ582753.1)聚為一類群，菌株間同源性為99%，對(duì)比結(jié)果為Enterococcusitalicus；MLGⅢ- 17(IMAU98083)、MLGⅣ- 20(IMAU98105)與LactococcuslactisATCC19435T(AB100803.1)可聚為一簇，同源性符合標(biāo)準(zhǔn)，故可知菌株為L(zhǎng)actococcuslactis；MLGⅣ- 5(IMAU98094)與模式菌株LactobacillusplantarumATCC14917T(AF404710.1)聚成一簇，同源性為99%，故為L(zhǎng)actobacillusplantarum；MLGⅠ- 8(IMAU98008)與模式菌株LactobacillusparacaseiATCC25302T(D79212.1)同源性為99%，鑒定其為L(zhǎng)actobacillusparacasei；MLGⅠ- 2(IMAU98002)、MLGⅡ- 16(IMAU98038)與模式菌株LactobacillusfermentumATCC 14931T(X61142.1) 同源性符合標(biāo)準(zhǔn)，鑒定為L(zhǎng)actobacillusfermentum；MLGⅣ- 27(IMAU98133)與模式株LactobacillushelveticusATCC 15009T(FR683085.1)聚在一簇，同源性為99%，故鑒定為L(zhǎng)actobacillushelveticus[20-21]。

表2 乳酸菌分離鑒定結(jié)果

圖1 乳酸菌分離株16S rRNA基因序列進(jìn)化樹

2.5 摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳菌株多樣性分析

摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳菌株多樣性分析結(jié)果見表3、圖2。表3列出了4份樣品中菌株序列信息和α多樣性指數(shù)；圖2展示了樣品稀釋曲線和香農(nóng)曲線的趨勢(shì)。4份駝乳樣品的宏基因組測(cè)序獲得了26 626條DNA序列。將獲得的序列進(jìn)行分組，可得1 905個(gè)代表性O(shè)TUs，MLGⅣ代表性O(shè)TUs最少，為395個(gè)；MLGⅠ的最多，為604個(gè)，OTUs數(shù)量與測(cè)序深度呈正相關(guān)。由圖2(a)可以看出，4份樣品曲線隨測(cè)序深度增大不再升高，表明此次測(cè)序量充足。由圖2(b)可知，4份樣品在4 000測(cè)序量時(shí)已經(jīng)趨于飽和，說明在此條件下可以充分了解樣品的多樣性信息。

圖2 摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳稀釋曲線及香農(nóng)曲線

表3 摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳中序列信息和α多樣性指數(shù)

2.5.1摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

研究表明，4份自然發(fā)酵駝乳樣品中細(xì)菌鑒定屬于7個(gè)細(xì)菌門、78個(gè)菌屬、143個(gè)菌種，7個(gè)菌門分別是Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Deinococcus-Thermus、Acidobacteria、Bacillariophyta、Bacteroidetes。摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵乳細(xì)菌門水平分析結(jié)果見表4。由表4可知，樣品中主要菌門是Proteobacteria(54.64%)和Firmicutes(41.77%)。

表4 摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵乳細(xì)菌門水平的相對(duì)含量

從樣品的菌屬水平來看，阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳中共包含78個(gè)細(xì)菌屬，相對(duì)含量較高的屬為L(zhǎng)actococcus(31.87%)、Acinetobacter(26.79%)、Enterobacter(7.44%)、Escherichia(7.39%)、Klebsiella(5.28%)、Lactobacillus(4.23%)、Thermus(3.09%)。MLGⅠ與MLGⅡ中Acinetobacter含量最多，達(dá)到43.49%；MLGⅢ與MLGⅣ中的Lactococcus的含量最高(17.63%)。

從種水平來看，樣品中主要菌種為L(zhǎng)actococcuslactis(24.75%)、Acinetobacterjohnsonii(19.17%)、Escherichiafergusonii(6.40%)、Enterobactercloacae(5.77%)、Klebsiellaoxytoca(5.27%)、Lactococcuschungangensis(4.28%)、Acinetobacterjunii(4.23%)、Lactobacillushelveticus(3.35%)、Thermuscotoductus(3.09%)、Lactococcusraffinolactis(2.64%)；相對(duì)含量高于1%的菌種還有Macrococcuscaseolyticus、Acinetobactervariabilis、Kurthiagibsonii、Exiguobacteriumindicum。

分析樣品主要菌種，相對(duì)含量達(dá)到25.42%的Acinetobacterjohnsonii是MLGⅠ、MLGⅡ、MLGⅢ樣品中的優(yōu)勢(shì)菌種，其中Lactococcuslactis、Lactococcuschungangensis在這3份樣品中相對(duì)含量也較高；MLGⅣ中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌種為L(zhǎng)actococcuslactis，相對(duì)含量高達(dá)63.45%，其次為乳酸菌中的Lactobacillushelveticus，相對(duì)含量為13.38%。

2.5.2OTU水平菌群結(jié)構(gòu)分析

OTU水平菌群結(jié)構(gòu)分析在α多樣性里有重要作用[19]，4份樣品產(chǎn)生1 301個(gè)OTU，只在單獨(dú)樣品中存在的OTU有922個(gè)，這些OTU有2 921條DNA序列，占OTU總數(shù)和質(zhì)控合格DNA序列數(shù)的比例為70.87%和10.98%。把4份樣品中均出現(xiàn)的OTU定義為樣品的核心OTU。58個(gè)OTU是所有樣品共同存在的，其中有DNA序列17 108條，4份樣品共有OTU分別占OTU總數(shù)和質(zhì)控合格DNA序列數(shù)的4.46%和64.25%。這些OTU隸屬于Acinetobacter(20個(gè)OTU)、Lactococcus(23個(gè)OTU)、Klebsiella(1個(gè)OTU)、Enterobacter(4個(gè)OTU)、Escherichia(5個(gè)OTU)、Pseudomonas(2個(gè)OTU)、Streptococcus(1個(gè)OTU)、Leuconostoc(1個(gè)OTU)、Leclercia(1個(gè)OTU)。

摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳中OTU出現(xiàn)次數(shù)和各樣品中OTU分析結(jié)果表明，OTU在樣品中也存在，MLGⅠ的OTU數(shù)量最少，僅為11個(gè)，MLGⅢ有25個(gè)OUT。Leuconostocfallax是MLGⅠ中特有的乳酸菌，Streptococcussalivarius、Streptococcusagalactiae這2種菌是MLGⅢ特有的乳酸菌，MLGⅣ獨(dú)有菌種為L(zhǎng)actococcuslaudensis、Lactobacillugasseri。除乳酸菌外，MLGⅠ特有的為Shigellaflexneri，MLGⅡ包含Acinetobacterbaumannii、Enterobactertabaci這2種特有菌種，MLGⅢ樣品特有菌種為Acinetobacterguillouiae，MLGⅣ樣品特有菌種為Massiliatimonae。

2.5.3自然發(fā)酵駝乳中菌群相關(guān)性分析

本研究對(duì)每組自然發(fā)酵駝乳中平均相對(duì)含量大于1%的核心菌群的相互關(guān)系利用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行分析，見圖3。屬水平結(jié)果顯示：Enterobacter與Kurthia、Acinetobacter呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，Exiguobacterium與Escherichia、Macrococcus呈顯著正相關(guān)(P<0.001)；Pseudomonas與Lactobacillus呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)，Lactococcus與Acinetobacter、Enterobacter呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)。種水平結(jié)果顯示：Lactococcusraffinolactis與Acinetobacterjohnsonii、Acinetobacterjunii、Acinetobactervariabilis、Kurthiagibsonii呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，Lactococcuschungangensis與Klebsiellaoxytoca呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，Lactobacillushelveticus與Lactococcuslactis呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，Lactobacillushelveticus與Lactococcuschungangensis呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

***表示顯著相關(guān)(P<0.001)。

2.5.4自然發(fā)酵乳核心微生物分析

根據(jù)乳酸菌分離結(jié)果可知，自然發(fā)酵乳種水平的核心微生物為L(zhǎng)actococcuslactis(100.0%)，其次為Acinetobacterjohnsonii(60.0%)、Lactobacillushelveticus(40.0%)，這3種乳酸菌共同構(gòu)成自然發(fā)酵駝乳樣品的核心微生物。

本研究涉及的4份樣品分離出Lactococcuslactissubsp. lactis 占分離菌株總數(shù)的66.67%，被認(rèn)定為摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳制品的優(yōu)勢(shì)菌群。此外，MLGⅠ樣品中分離出乳酸菌種類最為豐富，其中Lactobacillusplantarum、Leuconostocpseudomesenteroides、Lactobacilluscasei(paracasei)存在潛在益生功能，有待于進(jìn)一步深入研究，其余3份樣品分離出的菌株相似，優(yōu)勢(shì)菌群相同。MLGⅠ樣品分離出乳酸菌種類最為豐富，因此應(yīng)著重研究[21]。

2.6 摩洛哥阿尤恩地區(qū)菌株生化特性分析

根據(jù)樣品優(yōu)勢(shì)菌群、菌株發(fā)酵速率、生長(zhǎng)情況等因素，在樣品分離出的乳酸菌中選取2株進(jìn)一步分析。

2.6.1菌株最適溫度的確定

菌株最適溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4可知，37 ℃時(shí)，2株菌的OD600最大，生長(zhǎng)情況最佳，故37 ℃為最適生長(zhǎng)溫度。溫度低于37 ℃時(shí)，2株菌的OD600隨溫度增高而逐漸增加，且菌株IMAU98084的生長(zhǎng)情況優(yōu)于IMAU98054。溫度高于37 ℃時(shí)，2株菌的OD600均隨溫度的增高而逐漸降低，菌株活力降低，生長(zhǎng)受到抑制，但菌株IMAU98054生長(zhǎng)情況優(yōu)于IMAU98084，IMAU98054雖在低于37 ℃的環(huán)境生長(zhǎng)較慢，但整體生長(zhǎng)趨勢(shì)優(yōu)于IMAU98084。

圖4 菌株最適溫度的確定

2.6.2菌株對(duì)pH值及鹽耐受性分析

菌株最適pH值實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可知，在pH值為7.5時(shí)，2株菌的OD600最大，生長(zhǎng)情況最佳。在pH值低于7.5時(shí)，菌株的OD600逐步增高，2株菌的生長(zhǎng)情況隨pH值的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值低于2.5時(shí)，OD600趨于0，菌株生長(zhǎng)明顯受到抑制。pH值在5.5～7.5，菌株OD600趨于平滑，故此為菌株最適生長(zhǎng)pH值范圍。

圖5 菌株最適pH值的確定

菌株鹽耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖6可知，2株菌在一定程度上具有鹽耐受性，當(dāng)NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于2%時(shí)，菌株生長(zhǎng)幾乎不受影響；當(dāng)NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%時(shí)，菌株的OD600隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而逐漸減小，且NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大對(duì)菌株的生長(zhǎng)抑制越強(qiáng)；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)幾乎停止。

圖6 菌株對(duì)NaCl的耐受性

2.6.3菌株產(chǎn)酸能力測(cè)定及生長(zhǎng)曲線繪制

菌株IMAU98054和IMAU98084的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力如圖7。0～2 h時(shí)為菌株生長(zhǎng)的延滯期，2株菌的OD600變化很小，活菌數(shù)增長(zhǎng)也很少；2 h延滯期過后，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，2株菌的OD600及活菌數(shù)迅速增高，一直持續(xù)至14 h；之后菌株OD600增長(zhǎng)變慢趨于平緩進(jìn)入穩(wěn)定期，在18 h時(shí)，2菌株活菌數(shù)均達(dá)到最高值，且菌株IMAU98054較IMAU98084高。在菌株生長(zhǎng)至24 h之后，OD600開始有大幅下降趨勢(shì)。根據(jù)圖7中pH值曲線可知，0～2 h時(shí)，菌株pH值均變化不大；2～14 h時(shí)2株菌均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，由于活菌數(shù)大量增加，產(chǎn)乳酸能力增強(qiáng)，pH值大幅降低；20 h時(shí)菌株達(dá)到了pH最低值，IMAU98054為4.39，IMAU98084為4.41，并在此之后逐漸趨于穩(wěn)定；24 h后菌株進(jìn)入衰亡期，活菌數(shù)大幅減少，pH值有小幅增高情況。由此可知，菌株IMAU98054整體生長(zhǎng)情況及產(chǎn)酸速率優(yōu)于IMAU98084。

圖7 菌株產(chǎn)酸能力分析及生長(zhǎng)曲線

2.7 菌株IMAU98054和IMAU98084碳水化合物發(fā)酵結(jié)果

2株菌碳水化合物發(fā)酵結(jié)果見圖8。由圖8可知，在發(fā)酵48 h后，2株菌均可利用D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、苦甘仁苷、ARBULIN、水楊苷、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-乳糖、D-海藻糖、D-龍膽二糖。菌株IMAU98054發(fā)酵了17種糖，與另一株菌不同的有D-木糖、葡萄糖酸鉀(較弱)；菌株IMAU98084發(fā)酵了19種糖，與另一株菌不同的有山梨醇、D-密二糖、D-蔗糖、D-土倫糖。菌種IMAU98084可發(fā)酵碳水化合物的種類多于IMAU98054。本研究中，4份樣品均為自然發(fā)酵駝乳，發(fā)酵菌株均來自于自然條件，故無固定菌種來源。2株實(shí)驗(yàn)菌株來自不同樣品，發(fā)酵條件及生存環(huán)境不同導(dǎo)致環(huán)境適應(yīng)性存在差異[22]；并且目前菌株只進(jìn)行了16S rRNA鑒定，未準(zhǔn)確區(qū)分出亞種，可進(jìn)一步進(jìn)行全基因組測(cè)序及功能基因預(yù)測(cè)，探究菌株發(fā)酵特性與基因組間的聯(lián)系。

0.空白對(duì)照，1.甘露醇，2.赤藻糖醇，3. D-阿拉伯糖，4. L-阿拉伯糖，5.D-核糖，6.D-木糖，7.L-木糖，8.D-側(cè)金盞花醇，9. 甲基-β-D吡喃木糖苷，10.D-半乳糖，11.D-葡萄糖，12.D-果糖，13.D-甘露糖，14.L-山梨糖，15. L-鼠李糖，16.衛(wèi)矛醇，17.肌醇，18. 甘露醇，19.山梨醇，20.甲基-α-D-吡喃甘露糖苷，21.甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷，22.N-乙酰葡萄糖胺，23.苦杏仁苷，24.熊果苷，25.七葉靈檸檬酸鐵，26.水楊苷，27.D-纖維二糖，28.D-麥芽糖，29.D-乳糖，30.D-蜜二糖，31.D-蔗糖，32.D-海藻糖，33.菊粉，34.D-松三糖，35.D-棉子糖，36.淀粉，37.糖原，38.木糖醇，39.D-龍膽二糖，40.D-土倫糖，41.D-來蘇糖，42.D-塔格糖，43.D-巖藻糖，44.L-巖藻糖，45.D-阿拉伯醇，46.L-阿拉伯醇，47.葡萄糖酸鉀，48.2酮基葡萄糖酸鉀，49.5酮基葡萄糖酸鉀。

3 討 論

自然發(fā)酵乳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，是乳酸菌棲息的良好微生態(tài)環(huán)境，發(fā)掘不同分離地不同樣品中的乳酸菌，研究乳酸菌的相互關(guān)系，發(fā)掘菌株的特性是乳品領(lǐng)域研究的重要課題，利用純培養(yǎng)技術(shù)，分離乳酸菌，同時(shí)運(yùn)用宏基因組測(cè)序技術(shù)，探尋樣品的多樣性，可為乳酸菌持續(xù)開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

摩洛哥阿尤恩地區(qū)4份自然發(fā)酵駝乳樣品中分離獲得了82株乳酸菌，其中Lactococcuslactis、Lactobacillusplantarum、Lactobacilluscasei、Lactobacillusfermentum分離株數(shù)量較多，Lactococcuslactis為其優(yōu)勢(shì)菌種。本研究通過最適溫度實(shí)驗(yàn)、鹽及pH值耐受性實(shí)驗(yàn)、碳水化合物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等探究了自然發(fā)酵駝乳2株分離株Lactococcuslactis的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)2株菌特性優(yōu)良。并且菌株間存在相似部分，同時(shí)也存在差異。李遠(yuǎn)等[23]從新疆4個(gè)地區(qū)采集的發(fā)酵駝乳樣品包含22株乳酸菌，其中優(yōu)勢(shì)菌種為L(zhǎng)actobacillushelveticus(18.18%) 、Lactococcuslactissubsp.1actis(13.63%)。本研究中Lactococcuslactis為優(yōu)勢(shì)菌種，可體現(xiàn)不同環(huán)境及運(yùn)輸條件中相同樣品菌種的分布及豐度不同。張敏等[24]對(duì)新疆駝乳中細(xì)菌群落組成和多樣性進(jìn)行分析得出，發(fā)酵駝乳優(yōu)勢(shì)菌屬主要以Lactococcus和Lactobacillus為主，與本研究結(jié)果一致。在菌屬水平上，蘇尼特雙峰駝酸駝乳主要以乳桿菌屬和乳球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，阿拉善雙峰駝酸駝乳以乳桿菌屬和醋酸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。與本研究結(jié)果對(duì)比可知，發(fā)酵駝乳樣品中乳酸菌組成大體相似。Akhmetsadykova等[6]研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克斯坦地區(qū)發(fā)酵駝乳中球菌豐度更高，與摩洛哥發(fā)酵駝乳中菌種分布相似；哈密市原駝乳中包含Lactococcus、Lactobacillus等5個(gè)屬；除此之外，拉烏爾菌屬(Raoultella)等有食源致病性和環(huán)境污染性的菌屬被檢出，可能對(duì)人體造成危害[25]。前人研究結(jié)果與本研究樣品分離出的乳酸菌種類及豐度有所不同，因此，不同地區(qū)、不同采樣階段、不同運(yùn)輸條件產(chǎn)生的發(fā)酵駝乳中分離得到的乳酸菌種類及優(yōu)勢(shì)菌群存在差異性[7]。不同條件下產(chǎn)生的自然發(fā)酵乳蘊(yùn)含豐富的菌種多樣性，且2株特性優(yōu)良菌株也展示了這一結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用純培養(yǎng)的方法，從摩洛哥阿尤恩地區(qū)采集的4份酸駝乳樣品中分離出82株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別歸屬于3個(gè)屬、8個(gè)種，Lactococcuslactis占總分離株的58.54%，為優(yōu)勢(shì)菌。經(jīng)宏基因組16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)分析，4份樣品中包含78個(gè)細(xì)菌屬和147個(gè)菌種，其中優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria和Firmicutes，與其他自然發(fā)酵乳中優(yōu)勢(shì)菌門相似；優(yōu)勢(shì)菌屬為L(zhǎng)actococcus；優(yōu)勢(shì)菌種為L(zhǎng)actococcuslactis(22.95%)，同時(shí)也檢測(cè)到Streptococcusthermophilus、Lactobacillushelveticus相對(duì)含量較高。從自然發(fā)酵駝乳優(yōu)勢(shì)菌種Lactococcuslactis中分離得到2株成長(zhǎng)快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株IMAU98054和IMAU98084。2株菌最適生長(zhǎng)溫度均為37 ℃，最適pH值為5.5～7.5；在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)6% 以下時(shí)具有一定的耐鹽能力；且在18 h 時(shí)可達(dá)到最佳發(fā)酵狀態(tài)，活菌數(shù)最高且pH值最低；整體分析菌株IMAU98054特性略優(yōu)于IMAU98084。結(jié)果表明，Lactococcuslactis為摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌及優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，并且樣品細(xì)菌種類豐富。本研究分析了摩洛哥阿尤恩地區(qū)自然發(fā)酵駝乳的乳酸菌資源，明確了其細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性，并篩選得到了2株生化特性較好菌株IMAU98054和IMAU98084，研究旨在細(xì)化菌株優(yōu)勢(shì)，為乳酸菌的開發(fā)利用和傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的品質(zhì)提升提供指導(dǎo)。