納米硒抗菌的研究進(jìn)展及其應(yīng)用

楊超群，陳璨羽，木拜西爾·麥麥提依明，劉 靜，鄧國(guó)英

(1.上海市第一人民醫(yī)院創(chuàng)傷中心，上海 201620；2.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；3.上海交通大學(xué)材料學(xué)院，上海 200240)

近年來(lái)，醫(yī)院內(nèi)獲得性感染和細(xì)菌的抗菌藥物耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重，給醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。發(fā)展中國(guó)家醫(yī)院感染發(fā)生率高達(dá)15.5%[1]，直接影響患者尤其是住院患者的預(yù)后。而多重耐藥菌的出現(xiàn)更加劇了此窘?jīng)r。據(jù)預(yù)測(cè)，到2050年因多重耐藥菌而死亡的人數(shù)將增加到每年1 000萬(wàn)人，造成全球GDP損失達(dá)100萬(wàn)億美元[2]?？梢?jiàn)，抗菌問(wèn)題仍困擾著當(dāng)下的醫(yī)療行業(yè)，尤其是在后抗生素時(shí)代，抗生素的作用逐漸弱化，迫切需要尋找新的抗菌機(jī)制，開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物。目前，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者致力于將納米材料發(fā)展為抗菌的新手段。相較于抗菌藥物，納米材料具有體積小、表面積大、易于吸收降解等優(yōu)點(diǎn)[3]，有利于提高藥物輸送效率、增強(qiáng)療效、防止多重耐藥菌的產(chǎn)生。目前，關(guān)于納米材料抗菌效能的研究主要集中于金、銀等顆粒，但是，這些材料不僅具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性、長(zhǎng)時(shí)間接觸還會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子增加，可能誘導(dǎo)抗菌藥物耐藥基因的轉(zhuǎn)移和新型突變[4]。

而硒作為人體內(nèi)必需的微量元素，已廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等領(lǐng)域[5]。相較于有機(jī)或無(wú)機(jī)形態(tài)的硒化合物，納米硒(SeNPs)具有更高的生物安全性[6]。試驗(yàn)表明，SeNPs對(duì)人真皮層纖維細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性，不易引起紅細(xì)胞溶血，具有較強(qiáng)的細(xì)胞相容性和血液相容性[7]。SeNPs除了能負(fù)載抗菌藥物，本身即有良好的抗菌作用，其在抗菌領(lǐng)域具有可觀的研究潛力?；诖?，已有較多學(xué)者聚焦于SeNPs的抗菌活性及其機(jī)制，并通過(guò)研究表面修飾物來(lái)合成改良的SeNPs材料，以期達(dá)到增強(qiáng)療效，降低不良反應(yīng)等目的。但國(guó)內(nèi)對(duì)SeNPs抗菌效能的報(bào)道仍較少，尚無(wú)文獻(xiàn)系統(tǒng)陳述其抗菌機(jī)制。因此，本文依據(jù)現(xiàn)有的研究對(duì)影響SeNPs的抗菌活性因素、抗菌機(jī)制和改良SeNPs材料的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)其臨床應(yīng)用進(jìn)行闡述與展望，以期為抗菌材料的研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 SeNPs抗菌活性及其影響因素

1.1 SeNPs的抗菌活性 目前，研究[7-8]表明，SeNPs能有效抑制常見(jiàn)的醫(yī)院感染菌，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等，對(duì)肺炎克雷伯菌等棘手的多重耐藥菌也呈現(xiàn)出良好的預(yù)防與治療效果。Dorazilová 等[9]合成的材料展現(xiàn)了良好的抗耐藥菌能力，濃度為10 mg/L時(shí)，其對(duì)耐藥菌株抑制率可達(dá)85%。此外，SeNPs還能有效預(yù)防和清除細(xì)菌致病性和耐藥性相關(guān)的生物膜。生物膜是細(xì)菌通過(guò)分泌細(xì)胞外聚合物形成的高度組織化的膜狀結(jié)構(gòu)，能夠抵抗抗菌藥物、殺菌劑；同時(shí)，生物膜中的細(xì)菌常處于休眠狀態(tài)，代謝不活躍，對(duì)不良環(huán)境的耐受能力較強(qiáng)[10]。生物膜常附著于醫(yī)療衛(wèi)生器械上，難以清除，而現(xiàn)有的抗菌藥物中尚無(wú)有效治療方案[11]。相較于抗菌藥物，SeNPs能直接作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，從而預(yù)防細(xì)菌生物膜形成并清除已形成的生物膜[12]。Shakibaie等[13]報(bào)道，SeNPs能有效抑制重要醫(yī)院感染病原菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和奇異變形桿菌的生物膜形成。Cremonini等[14]試驗(yàn)表明，SeNPs能有效降解銅綠假單胞菌的細(xì)菌外多糖基質(zhì)，從而抑制生物膜合成。當(dāng)SeNPs濃度為50～100 μg/mL時(shí)，抑制率高達(dá)70%～90%，降解率為50%～70%?？梢?jiàn)，SeNPs在抗多重耐藥菌和細(xì)菌生物膜等方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用價(jià)值，將是未來(lái)研究的重點(diǎn)。

1.2 影響SeNPs的抗菌活性因素 研究已證明SeNPs的強(qiáng)抗菌活性，但是不同研究中SeNPs的抗菌活性具有一定的差異。有學(xué)者推斷，此差異性主要與SeNPs的顆粒特性和合成方式有關(guān)[15]。

1.2.1 SeNPs的顆粒特性 目前關(guān)于SeNPs粒徑大小和其抗菌特性的具體關(guān)系仍未闡明，有研究[16]提出，SeNPs的粒徑越小其抗菌活性越強(qiáng)，但在該研究中，SeNPs顆粒粒徑整體較大，不足以支持此推論。為此，研究[15]制作了尺寸為40～200 nm的球形SeNPs，比較不同直徑的SeNPs抗菌活性，結(jié)果表明，81 nm的SeNPs對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌和殺菌能力最強(qiáng)?？梢?jiàn)，SeNPs的抗菌能力與其粒徑相關(guān)，但非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。此外，SeNPs的抗菌作用與濃度相關(guān)。研究[17]比較四組不同濃度SeNPs的抗菌活性，隨著濃度增加，抑菌圈逐漸增大，且均高于加入氫氧化鈣、氯己定和次氯酸鈉組。Dorazilová等[9]試驗(yàn)評(píng)估SeNPs-殼聚糖支架抗傷口感染情況，發(fā)現(xiàn)濃度為1 mg/L的材料對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率為14%，而5、10 mg/L的抑菌率則分別增長(zhǎng)至33%、75%。因此，SeNPs的抗菌作用具有一定的濃度依賴性，在臨床應(yīng)用中也需結(jié)合其細(xì)胞毒性等綜合考慮，實(shí)際應(yīng)用中的最佳濃度仍待進(jìn)一步研究。

1.2.2 SeNPs的合成方式 研究表明，SeNPs的抗菌活性與其合成方式有關(guān)。Piacenza 等[18]研究用蕈狀芽孢桿菌還原亞硒酸鹽生成了生物SeNPs，用L-半胱氨酸或抗壞血酸生成化學(xué)SeNPs，對(duì)比兩者抗銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜的能力，發(fā)現(xiàn)生物SeNPs對(duì)兩種菌株的有效抗生物膜活性濃度為0.078、0.312 5 mg/mL。而即便是最高測(cè)試濃度(2.5 mg/mL)的化學(xué)SeNPs，抗菌活性僅為中等。鑒于微生物合成步驟復(fù)雜，有研究嘗試用植物合成SeNPs。Alam等[19]用番石榴葉的乙醇提取物還原亞硒酸鈉得到了一種大小在8～20 nm的SeNPs，經(jīng)過(guò)抗菌活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其抗大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為23、11.7 μg/mL，而化學(xué)SeNPs的MIC值為31 μg/mL。植物合成的SeNPs與地衣芽孢桿菌合成的SeNPs抗菌能力相當(dāng)，安全性更佳。因此，不同的合成方式直接關(guān)系到SeNPs的抗菌能力，但目前報(bào)道的大多合成方式僅限于實(shí)驗(yàn)室小批量生產(chǎn)，真正應(yīng)用還需綜合考慮綠色環(huán)保、簡(jiǎn)單便捷、成本低廉等因素，探索大批量綠色合成SeNPs的工藝將是未來(lái)研究的重要方向。

2 SeNPs抗菌機(jī)制

目前，關(guān)于SeNPs抗菌機(jī)制的研究仍在進(jìn)行中，現(xiàn)有的研究主要包括三種理論。

2.1 SeNPs可以誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生大量活性氧(ROS) 研究[20]認(rèn)為，SeNPs能誘導(dǎo)細(xì)菌生成大量ROS，破壞細(xì)菌內(nèi)的氧化還原平衡機(jī)制，使細(xì)菌發(fā)生氧化損傷，從而破壞氧化膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)。其機(jī)制可能為SeNPs緩慢釋放進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)加速產(chǎn)生ROS[21]的同時(shí)也可以直接與蛋白質(zhì)和核酸的氨基、巰基和羧基官能團(tuán)相互作用，產(chǎn)生蛋白質(zhì)凝固等毒性效應(yīng)[22-23]。Zonaro等[16]發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌生物膜和細(xì)菌懸液中，SeNPs誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS量均高于加入亞硒酸鹽組，隨著ROS產(chǎn)生量的增加，SeNPs對(duì)細(xì)菌的毒性逐漸增加。

2.2 SeNPs能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性 革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁主要由一層厚而致密的肽聚糖層組成，肽聚糖是多個(gè)分子交聯(lián)形成的碳水化合物聚合物。革蘭陰性菌的細(xì)胞壁則主要由較薄的肽聚糖層與脂多糖組成，脂多糖形成其外膜。這些成分使細(xì)菌細(xì)胞壁上帶負(fù)電荷，與帶正電荷的SeNPs產(chǎn)生靜電作用，從而損傷細(xì)菌細(xì)胞壁[24]；SeNPs誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS也可以引起脂質(zhì)過(guò)度氧化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，引起細(xì)胞裂解、質(zhì)壁分離[25]。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，改良SeNPs材料能使細(xì)菌細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯的損傷和凹陷現(xiàn)象，引起質(zhì)壁分離和內(nèi)容物流出[26]，酶標(biāo)儀定量分析的結(jié)果也顯示改良SeNPs材料可以對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)膜造成極大的損傷，從而發(fā)揮抗菌效能。Liu等[25]定量測(cè)定改良SeNPs材料抑制細(xì)胞膜組成原件的基因表達(dá)的能力，檢測(cè)大腸埃希菌的細(xì)胞膜基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，SeNPs處理組中孔道蛋白基因OmpA與OmpF的表達(dá)均下調(diào)，表明SeNPs可能會(huì)破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與通透性、損傷細(xì)菌泵出抗菌劑的能力。隨SeNPs濃度增加，黏附相關(guān)蛋白基因CsgA、CsgG的表達(dá)逐漸減少，表明SeNPs可以降低大腸埃希菌的黏附性。

2.3 SeNPs能破壞DNA結(jié)構(gòu) SeNPs破壞細(xì)菌膜系統(tǒng)后，可以滲透到細(xì)胞中，與DNA、蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的結(jié)合，使DNA濃縮而喪失復(fù)制能力[27]，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)量ROS引起細(xì)菌的氧化損傷，破壞大量蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)[23]，引起細(xì)菌生長(zhǎng)滯后、最大生長(zhǎng)速率顯著降低、細(xì)菌菌落減小。Beheshti等[28]研究SeNPs對(duì)細(xì)菌DNA的損傷作用，發(fā)現(xiàn)從SeNPs處理組中可以分離出DNA片段，其大小在100至1 000個(gè)堿基對(duì)之間，而對(duì)照組無(wú)明顯的DNA片段。研究[29]發(fā)現(xiàn)，隨著SeNPs材料濃度增加，大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的DNA與RNA表達(dá)水平逐漸下降。

3 改良SeNPs材料的研究進(jìn)展

為進(jìn)一步提高SeNPs的抗菌活性，有學(xué)者將SeNPs與其他抗菌材料耦合以達(dá)到協(xié)同抗菌作用，也有學(xué)者通過(guò)應(yīng)用修飾劑提高SeNPs的生物活性和靶向性。有研究[30]將 Se與Ag耦合，合成一種雙金屬納米粒子(Ag-SeNPs)，同時(shí)用槲皮素(QC)和沒(méi)食子酸對(duì)Ag-SeNPs包覆以穩(wěn)定納米顆粒性質(zhì)和增強(qiáng)抑菌效果，形成Qu-Gallic Acid@Ag-SeNPs并比較不同材料對(duì)革蘭陰性大腸埃希菌和革蘭陽(yáng)性枯草芽孢桿菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)Qu-Gallic Acid@Ag-SeNPs抑菌作用與氯霉素相當(dāng)，優(yōu)于硝酸銀和亞硒酸鈉的協(xié)同作用。Prateeksha等[31]將蜂蜜中的多酚化合物與SeNPs耦合，設(shè)計(jì)合成一種大小為12.4 nm HP-SeNPs。體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)均表明，HP-SeNPs抑制銅綠假單胞菌的能力均強(qiáng)于多酚化合物和SeNPs。4.5 μg/mL的 SeNPs@HP對(duì)細(xì)菌的生物膜抑制率超過(guò)90%，對(duì)銅綠假單胞菌的毒力因子蛋白酶、彈性蛋白酶、銅綠假單胞菌素和鼠李糖脂的抑制率分別為60.2%、52.7%、49.6%和59.6%。Yang等[29]用槲皮素對(duì)CdSe進(jìn)行修飾，并覆以ZnS合成了QCZ-NPs，此顆粒不僅能抑制多種耐藥菌的生長(zhǎng)，還具有較強(qiáng)的抗炎能力，給感染枯草芽孢桿菌的小鼠靜脈注射QCZ-NPs后，其組織中炎癥與壞死區(qū)域顯著減少。Huang等[26]將槲皮素和乙酰膽堿(Ach)修飾在SeNPs的表面，結(jié)合槲皮素的抗菌活性和乙酰膽堿靶向細(xì)菌細(xì)胞膜的能力，合成了一種新型的對(duì)抗多重耐藥菌的抗菌劑(Qu-Ach@SeNPs)，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)作用60 min時(shí)，25.0 μg/mL的Qu-Ach@SeNPs能殺滅91.7%的大腸埃希菌和 92.3%的金黃色葡萄球菌。將Qu-Ach@SeNPs 和多藥耐藥大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)30 代之后，Qu-Ach@SeNPs的MIC值并無(wú)明顯變化，說(shuō)明細(xì)菌難對(duì)Qu-Ach@SeNPs產(chǎn)生耐藥性。改良SeNPs材料是未來(lái)抗菌材料中不可或缺的一部分。

4 臨床應(yīng)用與展望

已有學(xué)者提出將SeNPs應(yīng)用于醫(yī)療器械的抗菌涂層，以防止細(xì)菌定植和生物膜形成[32]。研究[33]發(fā)現(xiàn)，由于聚合物表面性能的差異，不同SeNPs涂層的抗菌活性區(qū)別較大，其中，SeNPs聚氯乙烯涂層抑菌作用最佳，優(yōu)于市售的Ag聚氯乙烯涂層。有研究將SeNPs應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域，把SeNPs固定于球性PLGA顆粒中，并將這些粒子包覆在生物活性玻璃支架上，結(jié)果表明，該材料對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(骨科感染的主要病原體之一)的抗菌活性顯著[34]。TiO2納米管是臨床中整形外科與牙科常用的植入物，但其表面極易受到細(xì)菌污染。為提高其利用價(jià)值，將SeNPs摻入TiO2中合成了TNT-Se，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TNT-Se上大腸埃希菌的密度降低了94.6%，金黃色葡萄球菌的密度降低了89.6%[25]。進(jìn)一步比較含不同密度SeNPs的TNT-Se抗菌效能，僅作用4 h，低密度組TNT-Se上的大腸埃希菌減少了60%，而高密度組則減少了90%[35]。不難得出，SeNPs在醫(yī)療設(shè)備中有較大應(yīng)用潛力。

SeNPs的抗菌特性在傷口敷料中也有較大應(yīng)用價(jià)值。將SeNPs原位沉積于殼聚糖支架中合成傷口敷料材料(CS-Se)，CS-Se對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性[36]。同時(shí)，相較于CS-Ag、CS-Se對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的毒性顯著降低。Ramya等[37]對(duì)比SeNPs和慶大霉素對(duì)大鼠傷口愈合的影響，分別設(shè)置未處理組、標(biāo)準(zhǔn)抗生素組、SeNPs低濃度組和SeNPs高濃度組，結(jié)果顯示，SeNPs低濃度組和SeNPs高濃度組分別于第21天和第18天治愈了大鼠的傷口，而標(biāo)準(zhǔn)抗生素組和未處理組分別用了21、30 d。

可見(jiàn)，SeNPs有望應(yīng)用于傷口愈合治療中。

5 總結(jié)

目前，越來(lái)越多的研究聚焦于SeNPs的抗菌能力，并逐漸證實(shí)其在抗菌方面的應(yīng)用價(jià)值。但其抗菌的機(jī)制仍待進(jìn)一步研究和完善，也有一些問(wèn)題亟待解決：(1)SeNPs的毒性具有劑量依賴性，其體內(nèi)代謝過(guò)程仍未清楚，其臨床應(yīng)用的安全性仍待進(jìn)一步研究。(2)不同結(jié)晶度的SeNPs生物活性不同，需要對(duì)晶體態(tài)和非晶態(tài)SeNPs的生物活性進(jìn)行更系統(tǒng)的研究，以充分區(qū)分大小、形狀等對(duì)其活性的影響。(3)目前關(guān)于SeNPs抗感染活性的研究還主要集中在細(xì)胞研究階段，部分學(xué)者對(duì)其臨床應(yīng)用提出質(zhì)疑，有必要在動(dòng)物模型中進(jìn)行更深入的臨床前研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。