泛耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜相關(guān)基因及整合子與耐藥性的關(guān)系

蔡 楊，凌保東

(1.成都醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500)

泛耐藥鮑曼不動桿菌(extensively drug-resis-tantAcinetobacterbaumannii，XDR-AB)具有極強(qiáng)的生物被膜形成能力和獲得性耐藥的特點(diǎn)，耐受抗菌藥物、消毒劑、干燥環(huán)境等惡劣環(huán)境的能力很強(qiáng)[1]，臨床檢出率逐年呈上升趨勢[2]，并且感染傳播迅猛，被美國感染病協(xié)會列為全球6個嚴(yán)重的醫(yī)院感染微生物之一[3]，已成為我國乃至國際上重要的“超級細(xì)菌”[4-5]。鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)生物被膜形成過程復(fù)雜，受多基因、多機(jī)制共同調(diào)控[6]。相對于AB浮游菌，XDR-AB在結(jié)構(gòu)、基因表型和生化特性等方面發(fā)生明顯改變，使其耐藥性與致病性大幅度增強(qiáng)，導(dǎo)致持續(xù)感染與反復(fù)感染。整合子作為一類可移動元件，可攜帶多種耐藥基因在物種間水平傳播，是細(xì)菌多重耐藥性產(chǎn)生的重要原因[7]。研究[8]表明,細(xì)菌存在的整合子有六類，僅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子與耐藥性有明確關(guān)系。本研究擬通過分析臨床分離AB的耐藥性,檢測其生物被膜相關(guān)基因和整合子的攜帶與分布情況，重點(diǎn)探討XDR-AB生物被膜相關(guān)基因及整合子與耐藥性的關(guān)系，為臨床防治XDR-AB感染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2019—2020年成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床標(biāo)本分離的AB 59株，來自6個不同類型標(biāo)本，痰標(biāo)本占64.41%(38株)，灌洗液標(biāo)本占18.64%(11株)，腹腔引流導(dǎo)管標(biāo)本占5.08%(3株)，血液標(biāo)本占1.69%(1株)，腦脊液標(biāo)本、尿液標(biāo)本、膿液標(biāo)本各占3.39%(各2株)。分離自59例患者，其中重癥醫(yī)學(xué)科患者21例(35.59%)，呼吸科重癥監(jiān)護(hù)病房12例(20.34%)，呼吸科6例(10.17%)，內(nèi)科5例(8.47%)，外科9例(15.25%)，感染科1例(1.69%)，其他科室5例(8.47%)。質(zhì)控菌金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922、鮑曼不動桿菌ATCC 19606，均為本實(shí)驗(yàn)室留存。

1.2 儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)、酶標(biāo)儀(SpectraMa190)、PCR擴(kuò)增儀器(ABI-Veriti)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(科茲莫生物科技有限公司)。PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，PCR產(chǎn)物測序(北京擎科生物科技有限公司)、2×Taq Master Mix(Dye Plus,南京諾唯贊生物科技股份有限公司)、DNA marker(大連寶生物公司)。

1.3 藥敏試驗(yàn) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI 2020)標(biāo)準(zhǔn)，采用微量肉湯稀釋法測定59株AB對碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類和多粘菌素類等17種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，并依據(jù)各種藥物的藥敏折點(diǎn)判定結(jié)果。

1.4 PCR擴(kuò)增生物被膜相關(guān)基因及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因 挑取對數(shù)期單克隆菌落懸浮于0.9%生理鹽水，重懸液作為模板。PCR檢測17種生物被膜相關(guān)基因(bfmR、bfmS、csuA/B、csuA、csuB、csuC、csuD、csuE、abaI、epsA、pgaA、pgaB、pgaC、pgaD、pglC、bap、ompA)，以及整合酶基因(intI-1、intI-2和intI-3)。引物序列見表1。擴(kuò)增體系參數(shù)參考文獻(xiàn)[9]，并設(shè)空白對照。判斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)XDR-GNB感染抗菌治療專家共識，對多重耐藥(multidrug resistance, MDR)定義為對在抗菌譜范圍內(nèi)的3類或3類以上抗菌藥物不敏感；XDR定義為1～2類抗菌藥物(主要指多黏菌素類和替加環(huán)素)外，幾乎對所有類別抗菌藥物不敏感[10]。

表1 基因引物序列及預(yù)期目的產(chǎn)物長度

1.5 Ⅰ類整合子耐藥基因盒擴(kuò)增 對Ⅰ類整合酶陽性菌株的耐藥基因盒進(jìn)行擴(kuò)增，序列如下：intCS-F 5’-GGCATCCAAGCAGCAAG-3’，intCS-R 5’-AAGCAGACTTGACCTGA-3’，基因盒為預(yù)計長度800～3 000 bp，高保真酶擴(kuò)增。陽性菌株送測序，測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行對比分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，基因檢出陽性菌株和陰性菌株數(shù)量為計數(shù)資料，兩組間比較采用Fisher’s精確概率法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIC 除對替加環(huán)素和多粘菌素敏感率為100%外，59株AB對米諾環(huán)素耐藥率為1.69%，對碳青霉烯類的亞胺培南、美羅培南耐藥率分別為67.80%、71.19%，對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為76.27%，對左氧氟沙星耐藥率為59.32%，對哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、阿米卡星、及其他抗菌藥物的耐藥率均大于76%。依據(jù)XDR-GNB感染抗菌治療專家共識和CLSI 2020標(biāo)準(zhǔn)判定：XDR-AB 40株，占67.80%；多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-AB)5株，占8.47%；敏感AB 14株，占23.73%。見表2。

表2 臨床分離的59株鮑曼不動桿菌抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2 AB生物被膜相關(guān)基因與整合酶基因擴(kuò)增結(jié)果 59株AB均攜帶11種以上生物被膜相關(guān)基因，最多可攜帶17種生物被膜相關(guān)基因，其中6種基因bfmR、bfmS、csuC、csuD、csuE、pgaD檢出率均為100%，csuA/B、csuA、csuB、abaI、epsA、pgaA、pgaB、pgaC、pglC、bap、ompA檢出率分別為98.31%、98.31%、96.61%、91.53%、76.27%、74.58%、93.22%、94.92%、94.92%、98.31%、88.14%。見圖1。

注：M為100 bp DNA Marker，kb為陰性對照，其他泳道為espA陽性菌株。

擴(kuò)增intI-1、intI-2、intI-3整合酶基因，作為判定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子的存在依據(jù)。59株AB均未檢測出intI-2和intI-3；intI-1檢出率為66.10%(39株)，陽性菌株分別為XDR-AB 36株和MDR-AB 3株。見圖2。

注：M為500 bp DNA Marker，其他泳道為intI-1陽性菌株。

2.3 XDR-AB與敏感AB相關(guān)基因檢出情況 59株AB中XDR-AB占67.80%(40株)，MDR-AB占8.47%(5株)，敏感AB占23.73%(14株)。abaI、epsA、pglC、ompA 4種生物被膜相關(guān)基因檢出率：XDR-AB分別為100%、95.00%、87.50%、100%，高于敏感AB菌株的64.29%、7.14%、42.86%、50.00%(均P<0.05)。Ⅰ類整合基因陽性的XDR-AB 36株，占90.00%，敏感AB未攜帶Ⅰ類整合子(P<0.01)。見表3。

表3 XDR-AB與AB相關(guān)基因檢出情況

2.4 Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增及測序結(jié)果 對39株Ⅰ類整合酶陽性菌株可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測到可變區(qū)陽性菌株38株，片段大小約2 000 bp，其中XDR-AB 35株，MDR-AB 3株，產(chǎn)物序列在GenBank進(jìn)行同源性對比，均攜帶耐藥基因盒(aacA4、catB8和aadA1)。見圖3。

圖3 intI CS區(qū)部分測序圖片

3 討論

生物被膜的形成從菌毛的黏附、胞外多糖(EPS)的產(chǎn)生，以及從成熟到脫離，都涉及到特定基因的表達(dá)[11]。而整合子作為一種可移動的遺傳元件，通過特異的重組位點(diǎn)捕獲和整合單個或多個外源性基因，使不同耐藥基因盒在細(xì)菌種內(nèi)或種間進(jìn)行傳播，在AB耐藥性的形成和傳播中均具有重要的作用。

本研究測定的MIC結(jié)果顯示，AB對多粘菌素B和替加環(huán)素100%敏感，對青霉素類(哌拉西林、氨芐西林)、三代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢曲松和頭孢噻肟)的耐藥率達(dá)76.27%～84.75%，對氨基糖苷類(慶大霉素、阿米卡星)、氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)的耐藥率達(dá)59.32%～76.27%，對碳青霉烯類(亞胺培南、美羅培南)和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑(頭孢哌酮/舒巴坦)的耐藥率高達(dá)67.80%～76.27%；AB耐藥情況十分嚴(yán)峻，泛耐藥菌高達(dá)67.80%。AB對米諾環(huán)素耐藥率(1.69%)低于其他抗菌藥物，提示米諾環(huán)素在本地區(qū)可作為治療XDR-AB感染的選用藥物。但需要注意的是，37.50%(15/40)的XDR-AB MIC值處于中介范圍(8 μg/mL)，建議治療時需要在安全范圍內(nèi)加大劑量或者聯(lián)合用藥來提高療效。

研究檢測59株AB的17種生物被膜相關(guān)基因，31株(52.54%)菌株100%檢出，而且主要分布在XDR-AB和MDR-AB(XDR-AB 29株和MDR-AB 2株)；6種生物被膜相關(guān)基因bfmR、bfmS、csuC、csuD、csuE、pgaD在59株AB中檢出率為100%，其他11種生物被膜相關(guān)基因檢出率為74.58%～98.31%；檢出率高于相關(guān)文獻(xiàn)報道的檢出結(jié)果[12]；而基因abaI、bap、ompA的檢出率低于皇甫昱嬋等[13]的檢出結(jié)果。XDR-ABabaI、epsA、pglC、ompA 4種生物被膜相關(guān)基因檢出率分別為100%、95.00%、87.50%、100%，在敏感AB分別為64.29%、7.14%、42.86%、50.00%，XDR-AB中的檢出率均高于敏感AB(均P<0.05)。最新研究表明，AbaI廣泛分布于AB中，是表面相關(guān)運(yùn)動必不可少的，且與耐藥性、上皮細(xì)胞的侵襲力和毒力顯著相關(guān)[14]。abaI編碼乙酰高絲氨酸內(nèi)酯自誘導(dǎo)合成酶基因，介導(dǎo)群體感應(yīng)系統(tǒng)感知信號分子并且引起大量細(xì)菌聚集參與生物被膜形成。epsA編碼EPS，EPS作為生物被膜中最重要的成分，EPS基質(zhì)的性質(zhì)和組成與細(xì)菌菌株、培養(yǎng)條件和生物膜成熟度有關(guān)[6]。pglC編碼O-連接蛋白糖基化系統(tǒng)，與黏附到非生物表面的EPS和生物被膜的成熟有關(guān)。細(xì)菌中蛋白質(zhì)糖基化的進(jìn)化起源多樣化，糖基化系統(tǒng)可作為細(xì)菌適應(yīng)性耐高糖環(huán)境的策略[15]。ompA編碼外膜蛋白，外膜蛋白有助于上皮細(xì)胞和塑料表面生物被膜的形成，同時也是控制抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的重要通道。外膜蛋白的改變可影響細(xì)胞膜的通透性，使?jié)B透至細(xì)菌體內(nèi)的抗菌藥物減少，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥[16]。

細(xì)菌中整合子類型的地域差異性明顯，在中國以Ⅰ類整合子為主。不同地區(qū)Ⅰ類整合酶基因攜帶率也有差異，本研究中在59株AB Ⅰ類整合酶基因的檢出率為66.10%(39株)，且均為XDR-AB和MDR-AB菌株所攜帶。40株XDR-AB中Ⅰ類整合酶基因檢出率為90%(36株)，而在14株敏感AB中并未檢測出Ⅰ類整合子，推測Ⅰ類整合子的存在與XDR-AB耐藥性之間具有密切的關(guān)系[17-18]。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。