持續(xù)性次氯酸消毒對內(nèi)鏡終末漂洗水的消毒效果

王 萍，韓夢鴿，沈國鋒，李 娜，張 鑫，潘玥瑋，史慶豐，高曉東，孫 偉

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染管理科，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院感染管理科，上海 201199；4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院感染病科，上海 200032)

近年來，隨著內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展及在臨床中的廣泛應(yīng)用，軟式內(nèi)鏡使用后的清洗和消毒流程越來越受到關(guān)注。終末漂洗作為軟式內(nèi)鏡清洗、消毒后的最終處理過程，若漂洗水中細(xì)菌含量長期過高極易造成消毒流程的失敗，并導(dǎo)致內(nèi)壁生物膜的緩慢形成。為此，《軟式內(nèi)鏡清洗消毒技術(shù)規(guī)范》WS 507—2016[1]要求軟式內(nèi)鏡使用純化水或無菌水進(jìn)行終末漂洗，并應(yīng)保證純化水細(xì)菌總數(shù)≤10 CFU/100 mL。然而，國內(nèi)研究[2-3]指出自來水經(jīng)過純水制備系統(tǒng)后，水中細(xì)菌含量反而增高的現(xiàn)象，在新建內(nèi)鏡中心的水管路中尤為常見[4]。

上海市三級醫(yī)療機(jī)構(gòu)軟式內(nèi)鏡終末漂洗盡管已經(jīng)加裝純化水過濾裝置，但終末漂洗水合格率僅為63.09%，且水管路使用年限越久其合格率越低[5]。2021年11月，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心對消化內(nèi)鏡的終末漂洗水監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，純化水中菌落數(shù)明顯高于《軟式內(nèi)鏡清洗消毒技術(shù)規(guī)范》WS 507—2016的要求。為此，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心聯(lián)合醫(yī)院感染管理科對此進(jìn)行調(diào)查和分析，制定消毒和監(jiān)測措施，最終使終末漂洗用水符合要求。

1 對象與方法

1.1 調(diào)查對象 內(nèi)鏡中心自動清洗設(shè)備和手工清洗設(shè)備。其中胃鏡和腸鏡的手工清洗設(shè)備、18臺自動清洗設(shè)備、終末水管路均為2017年10月份新改造后投入使用。純化水制備的機(jī)器設(shè)在內(nèi)鏡中心獨立的處置室，由廠家每半年對純化水濾膜進(jìn)行更換，每月使用鄰苯二甲醛對水管路進(jìn)行消毒和水樣送檢。

1.2 研究方法

1.2.1 采樣方法 采集清洗消毒開始前胃鏡和腸鏡的手工清洗槽、胃鏡清洗機(jī)和腸鏡清洗機(jī)的終末漂洗水樣，每個采樣點采集100 mL的水樣，采樣時間為安裝前第30、15、3天，安裝后第1、2、4、7、10、14、21、28天。將收集好的終末漂洗水使用一次性過濾杯富集細(xì)菌至底部濾膜。將胃鏡手工清洗槽水樣本的濾膜裝至50 mL離心管中，加入5 mL無菌水后離心振蕩混勻，取其中1 mL進(jìn)行宏基因組二代測序(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)。剩余樣本的濾膜依據(jù)《中華人民共和國藥典(2020年版)》標(biāo)準(zhǔn)無菌操作轉(zhuǎn)移至R2A瓊脂培養(yǎng)平板，置于培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)5 d。

1.2.2 水路的改造和監(jiān)測 根據(jù)首次純水監(jiān)測結(jié)果，于2021年12月引入微酸性次氯酸水發(fā)生機(jī)，向純化水管路中恒定輸出次氯酸，使純化水中次氯酸終濃度為10 mg/L。在設(shè)備安裝后的第1、2、4、7、10、14、21、28天按照1.2的方法進(jìn)行采樣、培養(yǎng)和鑒定，以及mNGS測序分析。

1.2.3 細(xì)菌鑒定 使用無菌接種環(huán)挑取培養(yǎng)陽性標(biāo)本中典型、單個菌落涂抹至基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALID-TOF)儀樣品檢測板上，隨后滴加1 μL的α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液覆蓋，直至基質(zhì)液干燥后采用MALID-TOF進(jìn)行菌種鑒定。以VITEK MS置信度≥99%的細(xì)菌名稱作為菌種鑒定結(jié)果。

1.2.4 宏基因測序分析 樣本使用玻璃珠混合振蕩破壁，隨后使用TIANamp Micro DNA Kit試劑盒提取樣本的DNA；使用Agilent 2100 Bioanalyzer和定量PCR法進(jìn)行DNA文庫的打斷、構(gòu)建和質(zhì)控，隨后經(jīng)滾環(huán)復(fù)制生成DNB納米球，并滴加至測序芯片中。使用BGISEQ-200進(jìn)行測序分析，測序完成后去除低質(zhì)量和DNA片段<35 bp的數(shù)據(jù)，經(jīng)專用微生物大數(shù)據(jù)庫比對后生成細(xì)菌的種類、相對豐度、嚴(yán)格比對序列數(shù)(strict mapping reads number，SMRN)，標(biāo)準(zhǔn)化為1M序列值(reads per million，RPM)所包含的高質(zhì)量細(xì)菌序列數(shù)值等數(shù)據(jù)。

1.2.5 結(jié)果判定 根據(jù)《軟式內(nèi)鏡清洗消毒技術(shù)規(guī)范》WS 507—2016[1]要求將濾膜培養(yǎng)結(jié)果>10 CFU判定為水樣不合格，其余判定為合格。根據(jù)《高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識2021》《宏基因組學(xué)測序技術(shù)在中重癥感染中的臨床應(yīng)用專家共識(第一版)》[6-7]等指南與既往臨床分析經(jīng)驗，將SMRN≥50的細(xì)菌屬(或種)納入數(shù)據(jù)分析，并將種SMRN值

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 收集各樣本檢出細(xì)菌的種類、高質(zhì)量細(xì)菌序列、屬SMRN、種SMRN。將每個樣本的細(xì)菌種SMRN進(jìn)行排序，并取前10位進(jìn)行匯總。應(yīng)用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入和分析，率的比較采用Fisher’s確切概率法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 安裝前后水樣合格情況 安裝前共采集水樣27份，其中10份合格，合格率為37.03%；安裝后共采集水樣54份，54份均合格，合格率為100%，安裝前后合格率經(jīng)Fisher’s確切概率法比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表1。

表1 微酸性次氯酸水發(fā)生機(jī)安裝前后水樣合格情況

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果 17份不合格水樣經(jīng)MALID-TOF鑒定顯示，10份檢出放線根瘤菌，5份檢出嗜麥芽窄食單胞菌，2份檢出黃色微桿菌，5份檢出貪銅菌，4份檢出藤澤甲基桿菌，2分檢出少動鞘氨醇單胞菌。見圖1。

注：A檢出嗜麥芽窄食單胞菌和黃色微桿菌；B檢出放線根瘤菌；C檢出貪銅菌和藤澤甲基桿菌；D檢出水生根瘤菌和少動鞘氨醇單胞菌。

2.3 水樣本mNGS測序分析 mNGS測序數(shù)據(jù)顯示，各樣本的測序深度為1.40～61.90 M，RPM為231～3 063。消毒前，高質(zhì)量細(xì)菌序列平均為112 291，消毒后為23 626；消毒前，細(xì)菌屬SMRN平均為83 791，消毒后為11 496；消毒前，細(xì)菌種SMRN平均為61 274，消毒后為8 454。見表2。

表2 11份水樣本的mNGS測序結(jié)果

2.4 水樣本中細(xì)菌基因多態(tài)性分析 將各樣本中細(xì)菌種SMRN進(jìn)行排序，并取前10位進(jìn)行匯總。結(jié)果顯示，安裝前的樣本中可檢測出大量皮氏羅爾斯頓菌、耐金屬貪銅菌、奧斯陸莫拉菌、日本慢生根瘤菌、水生甲基桿菌、戈登分枝桿菌、新鞘氨醇桿菌等水生細(xì)菌。安裝后，所有樣本的測序結(jié)果為mNGS背景菌。見表3。

表3 11份水樣本的細(xì)菌種SMRN排序

3 討論

醫(yī)療用水主要來自市政自來供水或二次供水，停滯的水流和復(fù)雜而狹長的供水管道為水源性細(xì)菌的繁殖提供了有利條件，因此，醫(yī)療用水在使用、儲存、輸送過程中極易受到微生物的污染[8]。國內(nèi)外研究[9-10]表明，終末漂洗水的合格率僅為40%～70%，是造成后續(xù)內(nèi)鏡污染的重要原因之一。若終末漂洗水管路長期未消毒，內(nèi)鏡內(nèi)壁可形成以奧斯陸莫拉菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌、藤黃微球菌等水生類細(xì)菌為主的生物膜[11-12]，給內(nèi)鏡的消毒和感染預(yù)防帶來巨大挑戰(zhàn)。

本研究3次基線采樣顯示，終末漂洗水中可鑒定出大量的放線根瘤菌、嗜麥芽窄食單胞菌、黃色微桿菌、貪銅菌、藤澤甲基桿菌、少動鞘氨醇單胞菌等水源性細(xì)菌，總合格率僅為37.03%。盡管自動清洗機(jī)和手工槽的終末漂洗水均來源于內(nèi)鏡中心獨立的純化水處理室，且該處理室定期進(jìn)行濾膜更換和水管路消毒，但11份自動清洗機(jī)的終末水樣僅有1份合格，而16份手工清洗槽的水樣有9份合格。盡管缺乏對水管路中細(xì)菌生物膜的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)合既往研究[11]結(jié)論以及放線根瘤菌、貪銅菌、藤澤甲基桿菌在多次采集的樣本中反復(fù)存在，mNGS高測序數(shù)據(jù)也證實此類細(xì)菌大量存在，因而推測純化水制備點至出水口的管路已形成細(xì)菌生物膜，并持續(xù)性向純化水管路中播散多種細(xì)菌。研究[13]指出，隨水流播散的細(xì)菌易造成過濾的膜孔堵塞，導(dǎo)致純化水在濾過和儲存過程發(fā)生二次污染。王曉蕾等[14]對內(nèi)鏡終末漂洗水的連續(xù)監(jiān)測顯示，自來水經(jīng)純化水系統(tǒng)制備后細(xì)菌含量反而增高至218 CFU/mL。張梟然等[4]對新建內(nèi)鏡中心的驗收發(fā)現(xiàn)，盡管制水端的市政自來水、純水制備位點未檢出菌落，但進(jìn)入內(nèi)鏡手工清洗設(shè)備前的水樣與純水箱回水口檢出的菌落數(shù)較高，表明純化水的出水管路極易受到污染。

由于細(xì)菌生物膜表面通常由多種細(xì)菌以及多聚物、蛋白質(zhì)、核糖類物質(zhì)所組成的聚合物包圍，具有抵抗外界消毒劑的作用，并保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌結(jié)構(gòu)和功能完整[12, 15]。史慶豐等[5]的研究表明含氯消毒劑、過氧乙酸、戊二醛等化學(xué)消毒法或臭氧、紫外線等物理消毒法存在作用時間短、濃度不足或穿透力差等問題，無法清除管路中已形成的生物膜。為此，內(nèi)鏡中心于2021年11月初引入微酸性次氯酸水發(fā)生機(jī)，向純化水管路中恒定輸出10 mg/L的次氯酸，進(jìn)行持續(xù)性化學(xué)消毒。安裝后的第1、2、4、7、10、14、21、28天培養(yǎng)結(jié)果顯示，所有樣本均未培養(yǎng)出細(xì)菌，顯示該消毒方案的有效性。

本研究同時借助mNGS技術(shù)對終末漂洗水中細(xì)菌進(jìn)行深度測序分析，結(jié)果顯示消毒前水樣不僅存在耐金屬貪銅菌、奧斯陸莫拉菌、日本慢生根瘤菌、水生甲基桿菌、新鞘氨醇桿菌等與培養(yǎng)一致的細(xì)菌，同時還鑒定出皮氏羅爾斯頓菌[16]、戈登分枝桿菌[17]、約翰遜不動桿菌[18]等潮濕環(huán)境普遍存在，但受培養(yǎng)條件所限而無法鑒定的細(xì)菌，顯示mNGS對由復(fù)雜細(xì)菌所構(gòu)成生物膜的鑒定優(yōu)勢。此外，mNGS在定性識別感染性病原體與優(yōu)勢細(xì)菌的構(gòu)成研究中具有良好的應(yīng)用效果[19-21]，但對病原體的定量研究較為少見，尤其對同時涉及病原體種類和豐度的研究極為罕見。mNGS測序分析時，由于背景細(xì)菌的存在將影響臨床樣本以及環(huán)境樣本的結(jié)果解讀，前者可依據(jù)臨床經(jīng)驗和測序數(shù)據(jù)綜合分析而判別，但目前尚缺乏環(huán)境樣本中目標(biāo)菌和背景菌的判別標(biāo)準(zhǔn)和檢測閾值。本研究經(jīng)驗性將種(屬)SMRN>RPM的細(xì)菌考慮為目標(biāo)細(xì)菌，并結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果以及安裝前、后細(xì)菌種類和豐度的變化而綜合分析消毒效果。結(jié)果顯示，微酸性次氯酸水使用后的第1天，水樣中高質(zhì)量細(xì)菌序列、細(xì)菌屬SMRN、細(xì)菌種SMRN數(shù)值顯著降低，各樣本種SMRN值均未超過相對應(yīng)的RPM值。隨后多個時間點所檢測的水樣培養(yǎng)結(jié)果陰性，且種SMRN排序前10的細(xì)菌多為背景細(xì)菌，因此推測該持續(xù)性消毒法已將水管路中持續(xù)存在的生物膜清除，具有良好的實用價值和推廣意義。

本研究也存在以下局限：(1)采樣時，未對新生成的純化水添加中和劑，對培養(yǎng)結(jié)果具有一定的影響；(2)管路中的細(xì)菌生物膜是通過對純化水的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，以及對消毒前、后的mNGS數(shù)據(jù)量變化情況進(jìn)行間接驗證，未能直接對水管路進(jìn)行采樣以及鑒定分析，未來需改進(jìn)研究方法；(3)mNGS測序過程不可避免產(chǎn)生背景細(xì)菌數(shù)據(jù)，但國內(nèi)尚無統(tǒng)一的鑒別標(biāo)準(zhǔn)和排除原則。本研究根據(jù)既往臨床樣本的數(shù)據(jù)及陰性對照管的細(xì)菌數(shù)據(jù)集，經(jīng)驗性將SMRN值過低的細(xì)菌且所有樣本中頻繁出現(xiàn)的細(xì)菌判定為背景細(xì)菌，該判定方法需進(jìn)一步驗證與評估。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。