NOD1對甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA惡性生物學(xué)功能的影響及機制*

白寧，劉春燕，李穎，張曉樂，侯德強

214000江蘇 無錫，江南大學(xué)附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科(白寧、劉春燕、李穎、張曉樂)，口腔科(侯德強)

甲狀腺癌是一種起源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。盡管經(jīng)手術(shù)、放射性碘和促甲狀腺激素抑制等序貫治療后甲狀腺癌患者臨床預(yù)后良好，但仍有5%～10%患者發(fā)生甲狀腺或頸部淋巴結(jié)以外的轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[1]。因此，探索可靠的預(yù)后標(biāo)志物和轉(zhuǎn)移機制對甲狀腺癌患者的診療具有重要意義。核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域1(nucleotide-binding oligomerization domain 1，NOD1)，又稱CARD4和NLRC1，是一種胞漿內(nèi)模式識別受體，廣泛表達于所有細(xì)胞類型，在免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。近年來，NOD1已被證明可以調(diào)節(jié)癌癥的進展，包括乳腺癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌[2-4]。然而NOD1對甲狀腺癌細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究通過siRNA干擾甲狀腺癌細(xì)胞中NOD1表達，進而確定NOD1對甲狀腺癌的調(diào)控作用及分子機制，為甲狀腺癌治療策略的制定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人甲狀腺癌細(xì)胞株BPCPA購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。NOD1 siRNA購自上海吉瑪制藥公司。Lipofectamine 2000試劑、TRIzol試劑、RIPA裂解液、Maxima H Minus第一鏈 cDNA合成試劑盒購自美國Thermo公司。TB Green預(yù)混試劑日本Takara公司。EdU試劑盒購自廣州銳博生物公司。蛋白上樣緩沖液、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天生物公司。細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。兔抗人NOD1單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體、兔抗人p-P38單克隆抗體、兔抗人P38單克隆抗體、兔抗人p-ERK單克隆抗體、兔抗人ERK單克隆抗體和山羊抗兔IgG H&L(HRP)購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇人甲狀腺癌細(xì)胞株BCPAP，培養(yǎng)基為含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞置于37℃、5% CO2的恒溫生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將1×106個細(xì)胞種植于6孔板，待細(xì)胞密度達到70%左右進行轉(zhuǎn)染。取10 μL Lipofectamine 2000試劑與250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混合，取10 μL siRNA混合于250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，室溫孵育5 min。將兩混合液混勻，室溫孵育20 min。將siRNA-Lipofectamine 2000混合液加入含細(xì)胞及500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基的孔中，搖晃孔板混勻。37℃、5% CO2的恒溫生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒NC-siRNA的細(xì)胞為siNC組，轉(zhuǎn)染NOD1干擾質(zhì)粒NOD1-siRNA的細(xì)胞為siNOD1組。

1.4 實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)

使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，隨后通過Maxima H Minus第一鏈 cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TB Green預(yù)混試劑在Stepone熒光定量PCR儀上進行定量擴增。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。NOD1：5’-CCTAGACAACAACAATCTCAACGACTA-3’(上游)，5’-TTTACCCCACCGTCAGTGATC-3’(下游)。GAPDH：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(上游)，5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(下游)。以GAPDH為參照基因，通過2-ΔΔCt計算NOD1相對表達量。

1.5 Western blot檢測NOD1表達

使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，與蛋白上樣緩沖液混合后95℃加熱10 min。將等量蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶常溫封閉1 h后，加入兔抗人NOD1單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日PBST洗膜后加入羊抗兔IgG H&L(1∶2 000)，常溫孵育1 h。PBST洗膜后使用Tanon 5200發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并采集圖像。

1.6 細(xì)胞增殖檢測

將1×103個細(xì)胞種植于24孔板，進行siRNA轉(zhuǎn)染。將37℃預(yù)熱的EdU工作液加入24孔板中，37℃孵育2 h。去除培養(yǎng)液，加入1 mL多聚甲醛固定液，室溫固定15 min。去除固定液，每孔用1 mL洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。去除洗滌液，每孔加入1 mL通透液(含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10 min。去除通透液，清水洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 細(xì)胞周期檢測

常規(guī)消化細(xì)胞，將原培養(yǎng)基和細(xì)胞均收集到離心管中，1 000 g離心5 min，沉淀細(xì)胞。使用1 mL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，吸除上清，加入1 mL預(yù)冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定30 min。1 000 g離心5 min，吸除上清。每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，輕柔并充分重懸細(xì)胞沉淀， 37℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測

用不含EDTA的胰酶常規(guī)消化細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。取1×105個重懸的細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.9 細(xì)胞劃痕實驗

用記號筆在6孔板背后用直尺均勻地劃橫線，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。在6孔板中種植1×106個細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度達到90%以上。用200 μL槍頭沿著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。PBS漂洗3次后，加入無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。分別于0 h和24 h后顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 Transwell侵襲實驗

在4℃條件下將Matrigel基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)基按比例稀釋(1∶4)，取100 μL混合液均勻覆蓋Transwell小室聚碳酸酯膜表面，37℃靜置1 h，使凝膠凝固。用DMEM培養(yǎng)基將待測細(xì)胞制成密度為5×105/mL的細(xì)胞懸液。在24孔板內(nèi)加入650 μL 含 20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱孵育48 h。取出小室，用棉簽輕輕拭去小室膜上表面細(xì)胞。4%多聚甲醛固定30 min。棄去固定液，將小室浸泡于0.2%結(jié)晶紫染色液10 min，清水漂洗小室三次。待小室風(fēng)干后，在高倍顯微鏡下選取5個視野觀察細(xì)胞并計數(shù)。

1.11 Western blot檢測MAPK信號通路變化

具體步驟詳見1.5，其中所用一抗分別為兔抗人p-P38單克隆抗體(1∶500)、兔抗人P38單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人p-ERK單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人ERK單克隆抗體(1∶1 000)。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗比較兩組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NOD1-siRNA干擾BPCPA細(xì)胞中NOD1表達

通過轉(zhuǎn)染siRNA，干擾甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA中NOD1的表達水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，siNOD1組細(xì)胞中NOD1 mRNA表達水平較siNC組細(xì)胞顯著下降(0.194±0.059vs1.00±0.000，t=19.220，P<0.001，圖1A)，抑制率達80.63%±5.93%。Western blot結(jié)果顯示，siNOD1組細(xì)胞中NOD1蛋白表達水平顯著低于siNC組(0.073±0.020vs0.352±0.040，t=8.852，P<0.001，圖1B)，抑制率達78.03%±5.64%。

圖1 轉(zhuǎn)染NOD1-siRNA后NOD1在BPCPA細(xì)胞中的表達

2.2 NOD1對BPCPA細(xì)胞增殖的影響

利用EdU增殖實驗檢測干擾NOD1后甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA增殖能力的變化。熒光顯微鏡下，藍色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為EdU陽性細(xì)胞。結(jié)果顯示，siNOD1組中EdU陽性細(xì)胞比例(76.41%±3.75%)相較于siNC組細(xì)胞(28.75%±3.79%)顯著升高(t=4.751，P<0.001，圖2)，說明siNOD1組中處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞多于siNC組。

圖2 NOD1表達對BPCPA細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 NOD1對BPCPA細(xì)胞周期的調(diào)控

通過流式細(xì)胞儀探究干擾NOD1對甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，干擾NOD1表達后，siNOD1組較siNC組G1期細(xì)胞比例降低(55.38%±3.11%vs66.23%±4.28%)，S和G2/M期細(xì)胞比例增加(36.00%±3.49%vs22.41%±2.87%，10.92%±1.08%vs6.84%±0.50%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(G1，t=2.902，P=0.044；S，t=4.249，P=0.013；G2/M，t=4.859，P=0.010，圖3)。

圖3 NOD1表達對BPCPA細(xì)胞周期的影響

2.4 NOD1對BPCPA細(xì)胞凋亡的影響

利用流式細(xì)胞儀檢測NOD1對甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA凋亡的調(diào)控作用。結(jié)果顯示， siNOD1組的凋亡細(xì)胞比例(8.47%±0.61%)和siNC組細(xì)胞(8.74%±1.03%)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.322，P=0.763，圖4)。

圖4 干擾NOD1表達對BPCPA細(xì)胞凋亡的影響

2.5 NOD1對BPCPA細(xì)胞運動能力的作用

細(xì)胞劃痕實驗檢測NOD1表達減少后甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA運動能力的變化。劃痕24 h后，siNOD1組細(xì)胞愈合距離多于siNC組細(xì)胞[(609.33±41.11)μmvs(316.63±24.05)μm，t=8.691，P=0.001，圖5]。

圖5 NOD1表達對BPCPA細(xì)胞運動能力的影響

2.6 NOD1對BPCPA細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控

Transwell侵襲實驗檢測干擾NOD1表達對甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，siNOD1組穿過小室的數(shù)量為(545.3±24.5)個，顯著多于siNC組(392.3±17.6)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.060，P=0.007，圖6)。

圖6 NOD1表達對BPCPA細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色)

2.7 NOD1對MAPK信號通路的調(diào)控作用

通過Western blot檢測NOD1對MAPK信號通路的影響。結(jié)果顯示，siNOD1組細(xì)胞的p-P38和p-ERK表達水平較siNC組顯著升高(p-P38，1.196±0.045vs0.357±0.030，t=21.961，P<0.001；p-ERK，0.764±0.039vs0.219±0.038，t=14.265，P<0.001)，P38和ERK表達水平無顯著變化(P38，0.818±0.047vs0.844±0.036，t=0.623，P=0.567；ERK，0.927±0.054vs0.974±0.082，t=0.685，P=0.531，圖7)。

圖7 NOD1表達對MAPK信號通路的影響

3 討 論

NOD1是一種模式識別受體，負(fù)責(zé)感知先天免疫中的致病肽。NOD1可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活，導(dǎo)致促炎反應(yīng)和抗菌反應(yīng)，因此NOD1被認(rèn)為能夠維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)[5]。隨著研究的深入，NOD1對腫瘤的影響越來越受到重視。人透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌腫瘤組織中NOD1的表達低于健康腎組織，而肝細(xì)胞癌細(xì)胞中NOD1相較于正常肝細(xì)胞則是高表達的[4, 6]。但Ma等[2]卻發(fā)現(xiàn)NOD1在肝癌組織中低表達，且可通過抑制MAPK信號通路抑制肝細(xì)胞癌的增殖并增強其對化療的敏感性。亦有報道稱激活的NOD1有助于胃癌的發(fā)展[7]。以上研究表明NOD1可能在惡性腫瘤的進展中發(fā)揮雙重作用。目前NOD1在甲狀腺癌中的作用尚不清楚。

Ma等[2]發(fā)現(xiàn)NOD1通過增加P21蛋白水平，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而顯著抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。P21被認(rèn)為是一種新型的腫瘤抑制因子，在G1檢查點抑制細(xì)胞周期蛋白，抑制細(xì)胞周期從G1期向S期過渡[8]。本研究通過靶向NOD1的siRNA干擾甲狀腺癌細(xì)胞中NOD1的表達，發(fā)現(xiàn)降低NOD1表達水平可促進甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。通過檢測細(xì)胞周期，本研究發(fā)現(xiàn)干擾NOD1表達可導(dǎo)致細(xì)胞加速從G1期進入S期，進而增加G2/M期細(xì)胞的比例。以上結(jié)果表明干擾NOD1可通過減少G1期阻滯促進甲狀腺癌細(xì)胞增殖，與已有文獻結(jié)果相似。不同腫瘤中NOD1對癌細(xì)胞凋亡的影響是不一致的。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)NOD1的激活促進了HPV16陽性宮頸癌細(xì)胞的凋亡。在肝癌中，抑制NOD1通路可誘導(dǎo)SMMC-7721和HepG2凋亡[4]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾NOD1表達后甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡并未發(fā)生顯著變化，NOD1對甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡可能無直接調(diào)節(jié)作用，具體機制仍需進一步研究。

腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是甲狀腺癌患者預(yù)后不良的主要因素，而NOD1在調(diào)控腫瘤細(xì)胞運動和侵襲中發(fā)揮重要作用。Jiang等[3]證明NOD1的激活可能促進結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附、遷移和轉(zhuǎn)移。存在淋巴血管侵襲的宮頸癌組織中的NOD1表達高于原位癌組織，NOD1通過激活NF-κB和ERK信號通路促進鱗狀宮頸癌的形成和轉(zhuǎn)移[10]。此外，NOD1在卵巢腫瘤中的表達顯著上調(diào)，且在轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中的表達高于非轉(zhuǎn)移性腫瘤[11]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾NOD1表達后，甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA的運動和侵襲能力增強，說明NOD1在甲狀腺癌轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮抑制性作用。

NOD1可通過與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(serine/threonine protein kinase 2， RIP2)相互作用，參與下游信號通路的激活[12]。RIP2是一種控制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和凋亡的蛋白激酶，并作為NOD1信號通路的下游中介[13]。RIP2被E3連接酶泛素化，激活抑制因子I-kappa B激酶(I-kappa B kinase，IKK)復(fù)合物和TGF-β活化激酶1(TGF-beta-activated kinase 1，TAK1)[14-15]。TAK1與IKK復(fù)合體相互作用，與P38和JNK結(jié)合，從而調(diào)控MAPK信號通路[16]。SRC是一種非受體蛋白-酪氨酸激酶，其過度激活與晚期疾病進展相關(guān)[17]。研究表明，NOD1通過抑制SRC磷酸化和SRC-MAPK軸發(fā)揮其抗腫瘤作用[2]。本研究檢測了NOD1表達改變后MAPK信號通路的變化，發(fā)現(xiàn)干擾NOD1表達可提高p-P38和p-ERK水平，表明NOD1通過降低MAPK信號通路磷酸化抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，干擾NOD1表達可促進甲狀腺癌細(xì)胞BPCPA的增殖、運動和侵襲，對細(xì)胞凋亡無影響，并降低MAPK信號通路磷酸化水平，表明NOD1可減少MAPK信號通路磷酸化進而抑制甲狀腺癌增殖和轉(zhuǎn)移。本研究為探討NOD1在甲狀腺癌中的作用提供了新視角，為甲狀腺癌患者的治療策略提供了新的理論依據(jù)。

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