α-酮戊二酸二甲酯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

侯培鋒，陳　強(qiáng)（福建醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞醫(yī)學(xué)研究院，福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建福州　350001）

α-酮戊二酸二甲酯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

侯培鋒，陳強(qiáng)
（福建醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞醫(yī)學(xué)研究院，福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建福州350001）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-26 11：06網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160426.1106.058.html

α-酮戊二酸二甲酯（DM-2KG）是目前在基礎(chǔ)研究中廣泛被應(yīng)用為養(yǎng)料來(lái)營(yíng)救因營(yíng)養(yǎng)缺失導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制［1］。據(jù)報(bào)道，在多種代謝酶發(fā)生突變?nèi)鏘DH1或SDH突變的腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)應(yīng)用DM-2KG干預(yù)后，這類代謝物進(jìn)入細(xì)胞后即可轉(zhuǎn)化為PHD活化的輔助因子α-KG，激活PHD酶活性，促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）蛋白降解［2］，即HIF-1α蛋白的PHD經(jīng)典降解途徑。

在常氧且營(yíng)養(yǎng)成分充足的條件下，DM-2KG不僅沒有促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，反而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)產(chǎn)生一組干細(xì)胞樣的癌細(xì)胞［3］。本文深入探討其中的發(fā)生機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料DM-2KG、去鐵胺、二甲基草酰甘氨酸和環(huán)己酰亞胺（Sigma公司）；MG132（Calbiochem公司）。其他：HIF-1α（BD Bioscience），HIF-2α（Novus Biologicals），anti-Actin（Millipore），anti-CD44（Cell Signaling），anti-Ki67（Abcam），Hoechst 33342（Sigma），Image-Pro6.3軟件（Media Cybernetics），Gallios流式細(xì)胞儀（Beckman），TD-20e光度計(jì)（Turner）。

1.2方法采用無(wú)目標(biāo)基因的shRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞作為對(duì)照和針對(duì)HIF-1α的shRNA-沉默MDA-MB-231細(xì)胞（MDA-MB-231/shHIF-1α）。采用β-半乳糖苷酶染色試劑盒（Cell Signaling）檢測(cè)細(xì)胞衰老狀況。根據(jù)產(chǎn)品使用指南用ENLITEN? ATP Assay System（Promega，F(xiàn)F2000）測(cè)定ATP產(chǎn)量。采用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面的CD44標(biāo)志物；免疫熒光染色和成像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞總CD44標(biāo)志物。采用乳腺細(xì)胞球形成試驗(yàn)評(píng)估癌細(xì)胞致瘤能力。

2　結(jié)果

2.1DM-2KG抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)經(jīng)DM-2KG培養(yǎng)至10 d，DM-2KG明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)ATP生成，也可抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF7的集落生成大小和數(shù)量。MDA-MB-231細(xì)胞除癌細(xì)胞集落生成受抑制外，癌細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)明顯的肥大。將獲取的生長(zhǎng)抑制的癌細(xì)胞集落在沒有DM-2KG的培養(yǎng)液中重新培養(yǎng)10 d，癌細(xì)胞恢復(fù)了增殖和細(xì)胞集落形成能力。采用與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶試驗(yàn)也證實(shí)所獲取的生長(zhǎng)抑制的癌細(xì)胞并非衰老細(xì)胞，提示DM-2KG誘導(dǎo)的具備增殖可逆性的生長(zhǎng)停滯癌細(xì)胞是一靜止休眠期細(xì)胞亞群。在營(yíng)養(yǎng)成分充足的培養(yǎng)液中，DM-2KG對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用。

2.2DM-2KG誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)CD44采用Ki67low和Hochest 33342low雙染法來(lái)標(biāo)記靜止休眠期細(xì)胞（G0細(xì)胞）。MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)DM-2KG干預(yù)4 d后，和對(duì)照組比較，G0細(xì)胞的比例從12.7% 增大到24.5%，干預(yù)7 d，比例增至31.3%。在MCF7細(xì)胞觀察到相似結(jié)果（28.3%vs 45.3%）?？梢姡橄侔┘?xì)胞經(jīng)DM-2KG干預(yù)后可促進(jìn)癌細(xì)胞向G0靜止休眠期細(xì)胞轉(zhuǎn)化。并且MDA-MB-231細(xì)胞表面表達(dá)的CD44水平增加呈時(shí)間依賴性趨勢(shì)。同樣在MCF7細(xì)胞，DM-2KG也可誘導(dǎo)癌細(xì)胞表面CD44高表達(dá)?？梢奃M-2KG可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)產(chǎn)生一群細(xì)胞大小增大、細(xì)胞表面高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44的靜止休眠期細(xì)胞。

2.3DM-2KG誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞靜止休眠狀態(tài)和干細(xì)胞樣表型是HIF-1α介導(dǎo)驗(yàn)證MDA-MB-231/shHIF-1α細(xì)胞HIF-1α的敲減效率，采用兩株經(jīng)shRNA干預(yù)過的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。經(jīng)DM-2KG干預(yù)7 d后，MDA-MB-231/ shCON細(xì)胞和MDA-MB-231/shHIF-1α細(xì)胞相比，前者可明顯獲取更多的靜止休眠亞群癌細(xì)胞。DM-2KG明顯增加了MDA-MB-231/shCON細(xì)胞總 CD44蛋白的表達(dá)，而對(duì)于MDA-MB-231/shHIF-1α細(xì)胞，DM-2KG干預(yù)前后，總 CD44蛋白水平基本沒有太大改變，提示DM-2KG上調(diào)乳腺癌細(xì)胞高表達(dá) CD44是受HIF-1α介導(dǎo)的?？梢姡琀IF-1α在DM-2KG誘發(fā)干細(xì)胞樣癌細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。

3　討論

乳腺癌治療過程中常出現(xiàn)耐藥情況，導(dǎo)致多療程化療后療效變差，對(duì)信號(hào)通路的研究成為耐藥機(jī)制研究的一大熱點(diǎn)［4］。本研究證實(shí)常氧條件下，DM-2KG作用于乳腺癌細(xì)胞后會(huì)使細(xì)胞出現(xiàn)假缺氧反應(yīng)，并誘發(fā)癌細(xì)胞出現(xiàn)兩個(gè)結(jié)局：①DM-2KG抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘發(fā)一亞組處于靜止期的癌細(xì)胞；②DM-2KG誘發(fā)一腫瘤干細(xì)胞樣的癌細(xì)胞亞群，該亞群癌細(xì)胞具有自我更新，高致瘤能力等的特點(diǎn)。HIF-1α蓄積會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖停滯，DM-2KG不僅可以調(diào)控乳腺癌細(xì)胞向干細(xì)胞樣癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而且通過其誘導(dǎo)產(chǎn)生的HIF-1α使一群乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成干細(xì)胞樣癌細(xì)胞狀態(tài)，而且這群癌細(xì)胞具備有強(qiáng)致瘤能力和高腫瘤增殖力。推測(cè)DM-2KG通過HIF-1α誘發(fā)產(chǎn)生的靜止期癌細(xì)胞可能是乳腺癌細(xì)胞向干細(xì)胞樣癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的一個(gè)重要條件。代謝物DM-2KG可以通過調(diào)節(jié)HIF-1α的蛋白水平而誘導(dǎo)產(chǎn)生干細(xì)胞樣癌細(xì)胞。

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［2］MacKenzie E D，Selak M A，Tennant D A，et al.Cell-permeating α-ketoglutarate derivatives alleviate pseudohypoxia in succinate dehydrogenase-deficient cells［J］.Mol Cell Biol，2007，27（9）：3282-9.

［3］Hou P，Kuo C Y，Cheng C T，et al.Intermediary metabolite precursor dimethyl-2-ketoglutarate stabilizes hypoxia-inducible factor-1α by inhibiting prolyl-4-hydroxylase PHD2.［J］.PLoS One，2014，9（11）：113865.

［4］ 張梅，袁霞，徐波，等.蛋白酶體抑制劑YSYO1A不依賴NF-κB通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（3）：330-5.

［4］Zhang M，Yuan X，Xu B，et al.YSY01A as the NF-κB-independent proteasome inhibitor inhibits proliferation and induces apoptosis in breast cancer cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30 （3）：30-5.

Mechanism of inhibition of breast cancer cell proliferation by α-dimethyl 2-oxoglutarate

HOU Pei-feng，CHEN Qiang

（Stem Cell Institute for Medical Research of Fujian Medical University，Key Laboratory of Tumor of Translational Medicine of Fujian Province，Dept of Medical Oncology，F(xiàn)ujian Union Hospital，F(xiàn)uzhou350001，China）

α-酮戊二酸類似物；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；靜止期細(xì)胞；乳腺癌干細(xì)胞；脯氨酰羥化酶2；靶點(diǎn)

DM-2KG；HIF-1α；quiescent cell；breast cancer stem cell；PHD2；target

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.05.029

A文章編號(hào)：1001-1978（2016）05-0738-02中國(guó)圖書分類號(hào)：R329.24；R737.902.2；R916.4

2016-02-15，

2016-03-21

福建省衛(wèi)計(jì)委醫(yī)學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目（No 2015-CXB-15）

侯培鋒（1976-），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤基礎(chǔ)與臨床，E-mail：peifenghou@sina.com