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    lncRNA GAS5調(diào)控miR-21抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化

    2022-07-30 04:26:04王冠賢李寶林唐愛民黃永湘
    中國老年學雜志 2022年14期
    關(guān)鍵詞:成骨成骨細胞批號

    王冠賢 李寶林 唐愛民 黃永湘

    (儋州市人民醫(yī)院骨科,海南 儋州 571700)

    骨缺損是常見的臨床問題,主要由創(chuàng)傷,生理性、病理性骨吸收導致〔1〕。在整形外科中,需要通過骨再生修復缺損提高患者的生活質(zhì)量,而在一些骨疾病中,需要通過骨再生治療恢復丟失的骨量〔2,3〕。人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSC)是具有多種分化潛能的細胞,主要向成骨細胞、脂肪細胞分化,對調(diào)控骨組織重建、代謝有重要作用〔4,5〕。微小RNA(miRNA)是一類由18~25個核苷酸組成的非編碼小分子RNA,通過調(diào)控靶基因的表達,影響細胞的增殖、凋亡、分化等過程〔6〕。研究發(fā)現(xiàn),miR-21在hBMSC的成骨分化調(diào)控中起重要作用〔7〕。長鏈非編碼RNA(lncRNA)生長特異抑制物(GAS)5作為一種lncRNA,與miR-21存在互補區(qū)域,可以競爭性與miR-21結(jié)合形成沉默復合體,進而影響miR-21發(fā)揮作用〔8〕。但lncRNA GAS5在成骨分化方面尚缺乏研究。本研究旨在探討lncRNA GAS5調(diào)控miR-21對hBMSC成骨分化的影響。

    1 材料與方法

    1.1主要試劑與儀器 hBMSC細胞(批號:os101059)購自美國ATCC細胞庫;α-MEM培養(yǎng)基(批號:MEP10-10LT)購自美國Caisson Labs公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(批號:11668019)購自美國Invitrogen公司;TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:R0016、D7168S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(批號:BB-3009、BB2108)購自上海貝博生物科技公司;實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒(批號:K1002S)購自美國Promega公司;成骨分化試劑盒(批號:A1007201)購自美國GIBCO公司;堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(批號:121862)購自北京凱瑞基生物科技有限公司;ALP活性測定試劑盒(批號:8258)購自美國Sciencell公司;Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)2抗體、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2抗體、骨唾液蛋白(BSP)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號:ab76956、ab14933、ab52128、ab181602)購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(批號:0295G-HRP)購自美國Santa公司;negative control-GAS5、GAS5 mimic、nonsense siRNA、GAS5 siRNA序列及GAS5、miR-21、RUNX2、BMP2、BSP、ALP、U6、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;恒溫培養(yǎng)箱(型號:MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司;顯微鏡(型號:CX31)購自日本Olympus公司;酶標儀(型號:ChemiDocXRS)、化學發(fā)光成像系統(tǒng)(型號:MODEL550)購自美國Bio-Rad公司;熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司。

    1.2實驗方法

    1.2.1細胞培養(yǎng) 含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基將hBMSC制成單細胞懸液,接種于多聚賴氨酸包被的T-75培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)基,此后每3天更換1次培養(yǎng)基。待細胞融合率達到85%左右時,用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。將對數(shù)期hBMSC以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板,分為:對照組、mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組和GAS5 siRNA組,其中對照組hBMSC不進行轉(zhuǎn)染,mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組和GAS5 siRNA組hBMSC使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染negative control-GAS5、GAS5 mimic、nonsense siRNA、GAS5 siRNA。

    1.2.2qRT-PCR檢測各組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5、miR-21及成骨相關(guān)因子mRNA表達情況 將轉(zhuǎn)染處理后的hBMSC培養(yǎng)48 h,收集細胞,qRT-PCR檢測lncRNA GAS5、miR-21表達水平,內(nèi)參基因為U6、GAPDH;將轉(zhuǎn)染處理后的hBMSC誘導成骨分化培養(yǎng)7 d,收集細胞,qRT-PCR檢測RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA表達水平,內(nèi)參基因為GAPDH。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應程序:95℃預變性10 min;95℃變性10 s,55℃退火35 s,72℃延伸1 min,循環(huán)40次。引物lncRNA GAS5上游:5′-AAGCCATTGGCACAGGCATTAG-3′,下游:5′-AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA-3′;miR-21上游:5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3′,下游:5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′;內(nèi)參U6上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;內(nèi)參GAPDH上游:5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游:5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′;RUNX2上游:5′-TTCACCTTGACCATAACCGTC-3′,下游:5′-GGCGGTCAGAGAACAAACTAG-3′;BMP2上游:5′-GGTATCACGCCTTTTACTGCC-3′,下游:5′-ACACCCACAACCCTCCACAA-3′;BSP上游:5′-CACTGGAGCCAATGCAGAAGA-3′,下游:5′-TGGTGGGGTTGTAGGTTCAAA-3′;ALP上游:5′-AGAATCTGGTGCAGGAATGG-3′,下游:5′-TCGTATTTCATGTCTCCAGGC-3′。相對表達量均以2-ΔΔCt法表示,Ct值為擴增產(chǎn)物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環(huán)數(shù)。

    1.2.3各組hBMSC ALP染色情況 經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后,將hBMSC誘導成骨分化培養(yǎng)7 d,按ALP染色試劑盒說明書進行ALP染色。棄上清液,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,4%多聚甲醛固定30 s,PBS洗滌,每孔加500 μl顯色反應液,37℃避光孵育30 min,蒸餾水漂洗直至不再脫色,顯微鏡照相。

    1.2.4各組hBMSC ALP活性檢測 經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后,將hBMSC誘導成骨分化培養(yǎng)7 d,PBS洗滌,加入30 μl/孔細胞裂解液振蕩裂解30 min,加入50 μl/孔緩沖液及50 μl/孔基質(zhì)液,混勻后37℃恒溫水浴15 min,加入150 μl顯色劑,在酶標儀520 nm波長處測定每孔的ALP活性。

    1.2.5Western印跡檢測各組hBMSC中成骨相關(guān)因子蛋白表達 經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后,將hBMSC誘導成骨分化培養(yǎng)7 d,收集細胞,使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白,使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并進行定量。電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,分別加入RUNX2抗體、BMP2抗體、BSP抗體、GAPDH抗體(均為1∶500),4℃孵育過夜,TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,免疫反應化學發(fā)光法顯色,Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度,目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

    1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1各組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5、miR-21表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5、miR-21表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與mimic NC組相比,GAS5 mimic組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5水平顯著升高(P<0.05),miR-21水平顯著降低(P<0.05);與siRNA NC相比,GAS5 siRNA組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5水平顯著降低(P<0.05),miR-21水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

    表1 各組hBMSC中l(wèi)ncRNA GAS5、miR-21表達水平比較

    2.2各組hBMSC中成骨相關(guān)因子mRNA表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與mimic NC組相比,GAS5 mimic組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平顯著降低(均P<0.05);與siRNA NC相比,GAS5 siRNA組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平顯著升高(均P<0.05)。見表2。

    2.3各組hBMSC中ALP染色情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC細胞ALP染色無明顯差異;與mimic NC組相比,GAS5 mimic組hBMSC細胞ALP染色明顯減弱;與siRNA NC組相比,GAS5 siRNA組hBMSC細胞ALP染色明顯增強。見圖1。

    2.4各組hBMSC中ALP活性 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中ALP活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與mimic NC組相比,GAS5 mimic組hBMSC中ALP活性顯著降低(P<0.05);與siRNA NC相比,GAS5 siRNA組hBMSC中ALP活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

    2.5各組hBMSC中成骨相關(guān)因子蛋白表達情況 對照組、mimic NC組、siRNA NC組間hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與mimic NC組相比,GAS5 mimic組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與siRNA NC相比,GAS5 siRNA組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3、圖2。

    表2 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP、ALP mRNA水平及ALP活性比較

    圖1 各組hBMSC中ALP染色

    表3 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達水平比較

    1~5:對照組、mimic NC組、GAS5 mimic組、siRNA NC組、GAS5 siRNA組圖2 各組hBMSC中RUNX2、BMP2、BSP蛋白表達情況

    3 討 論

    骨缺損是全球性的健康問題,與創(chuàng)傷及骨質(zhì)疏松、骨折等多種骨疾病的發(fā)生有關(guān)。研究表明,骨主要包括促進骨形成的成骨細胞和促進骨吸收的破骨細胞,是一個連續(xù)的動態(tài)平衡組織,在正常的骨組織中,兩種細胞處于平衡狀態(tài),一旦平衡打破,成骨細胞的骨生成低于破骨細胞的骨吸收,就會導致骨破壞疾病的發(fā)生〔9,10〕。骨再生是由成骨細胞、破骨細胞、其他多種細胞及細胞因子共同參與的復雜修復過程,是破骨細胞介導骨吸收及成骨細胞介導的骨形成的一個動態(tài)平衡過程。hBMSC是骨組織工程的重要種子細胞,具有自我克隆增殖及向成脂細胞、成骨細胞等分化的能力,臨床常通過體外誘導使hBMSC分化成軟骨、成骨細胞等,在多種疾病的治療中發(fā)揮作用〔11〕。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子,缺乏較明顯的開放閱讀框,具有較低甚至不具有翻譯蛋白質(zhì)的功能,通過介導表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及其他的特定調(diào)控模式發(fā)揮作用〔12〕。研究發(fā)現(xiàn),許多l(xiāng)ncRNA與成骨細胞、破骨細胞相關(guān),參與骨再生過程的調(diào)控,同時與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系〔13,14〕。Li等〔15〕發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5的表達在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中上調(diào),并且可能通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-13、BMP-2和ADAMTS5 mRNA表達水平促進骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。Song等〔16〕發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中表達上調(diào),可能通過增加幾種MMPs的表達水平,影響軟骨退化和骨關(guān)節(jié)炎進展。本研究結(jié)果提示GAS5可能影響成骨分化過程中ALP、RUNX2、BMP2、BSP等成骨分化標志基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平,在hBMSC成骨分化過程中起負向調(diào)節(jié)作用〔17〕。研究表明,miRNA在細胞凋亡、分化等生理病理過程中有重要作用。彭建強等〔18〕研究表明,miR-21可外調(diào)控MC3T3-E1細胞成骨分化,在骨形成過程發(fā)揮作用。宋琪玲等〔19〕研究表明,miR-21可以通過增強BMP9/Smad信號通路的激活程度,促進hBMSC C3H10T1/2細胞成骨分化過程。而鄭偉等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),LncRNA-GAS5作為miR-21的“分子海綿”,通過“吸收”miR-21從而調(diào)控miR-21對靶基因的抑制。本研究結(jié)果提示在hBMSC中,GAS5可能通過調(diào)控miR-21,進而影響hBMSC細胞的成骨分化過程。

    綜上,lncRNA GAS5在hBMSC成骨分化過程中發(fā)揮負向調(diào)控作用,可能與抑制miR-21表達有關(guān)。lncRNA GAS5有望作為成骨分化的調(diào)控靶點,但將其應用在骨再生臨床治療中,還需進一步在體內(nèi)進行驗證。

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