大柴胡湯對(duì)重癥中暑大鼠腸道黏膜屏障的保護(hù)機(jī)制研究*

陳冬杰 黃永蓮 彭曉洪 黃亞秀 王 評(píng)

[北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗），廣東 深圳 518000]

中暑是夏季高發(fā)的危重癥之一，其中重癥中暑的死亡率仍較高，達(dá)10%～50%[1]?，F(xiàn)階段研究認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、全身炎癥反應(yīng)和凝血功能紊亂是導(dǎo)致重癥中暑發(fā)生的主要病理生理機(jī)制[2]，而熱打擊后腸道黏膜損傷所致的腸源性毒素血癥則是以上過(guò)程的始動(dòng)因素之一[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)重癥中暑早期，熱打擊致腸道黏膜屏障損傷，通透性改變，腸道菌群失調(diào)，內(nèi)毒素入血，誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起臟器功能損傷[4]。而腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP）、D-乳酸水平在腸黏膜受損時(shí)會(huì)明顯升高，因此被認(rèn)為是腸道黏膜受損的標(biāo)志物，并且可通過(guò)其水平反映腸道的受損傷程度。本課題前期組研究發(fā)現(xiàn)大柴胡湯對(duì)重癥中暑患者有較好療效，能減輕患者的全身炎癥反應(yīng)程度，改善預(yù)后[5]。因此，本研究觀察大柴胡湯對(duì)重癥中暑大鼠血清白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP）及D-乳酸（D-LA）水平的影響，探討大柴胡湯對(duì)重癥中暑大鼠腸道黏膜屏障的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，質(zhì)量（200g±30）g，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)醫(yī)院倫理審查，大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試藥與儀器 大柴胡湯，組方：柴胡15 g，黃芩9 g，芍藥9 g，半夏9 g，生姜15 g，枳實(shí)9 g，大棗10 g，大黃6 g。藥材由北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院中藥房提供，濃煎成含原生藥1 g/mL，過(guò)濾除菌分裝4℃保存?zhèn)溆?。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司），大鼠IL-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒、大鼠DLA ELISA試劑盒、大鼠I-FABP ELISA試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司。高溫氣候動(dòng)物培養(yǎng)箱（寧波戴維醫(yī)療器械有限公司）、低溫冷凍離心機(jī)（Thermo公司）、MultiSkan3酶標(biāo)儀（Thermo公司）、超聲波破碎儀（無(wú)錫沃信儀器制造有限公司）

1.3 分組與造模 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組：空白對(duì)照組、模型組、大柴胡湯標(biāo)準(zhǔn)劑量組、大柴胡湯高劑量組，各15只。將大鼠置于高溫氣候動(dòng)物培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度（40.5±0.5）℃，濕度（65.0±2.0）%，經(jīng)直腸測(cè)中心體溫（Tc），造模期間每隔1 h測(cè)1次中心體溫，Tc達(dá)41℃后每隔15 min測(cè)1次體溫。以動(dòng)物直腸溫度達(dá)42℃作為重癥中暑標(biāo)準(zhǔn)。記錄動(dòng)物達(dá)到重癥中暑標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間，造模成功后，置于常溫環(huán)境（23.0±0.5）℃進(jìn)行自然降溫。

1.4 給藥方法 造模后6 h開始給藥。大鼠灌胃劑量參照血清藥理學(xué)等效劑量換算公式進(jìn)行換算：Db=Da×Dab，正常大柴胡湯用藥量為1.37 g/（kg·d），成人-大鼠的換算系數(shù)Rab=6.17，則200 g大鼠的等效劑量折算為1.69 g/（kg·d），高劑量組為標(biāo)準(zhǔn)劑量組2倍，即3.38 g/（kg·d），中藥湯劑用生理鹽水稀釋至5 mL，每8小時(shí)灌胃1次，連續(xù)2 d?？瞻讓?duì)照組、模型組同時(shí)間以等量生理鹽水灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 在造模成功后6、24、48 h分別隨機(jī)取5只大鼠處死，收集腹主動(dòng)脈血，離心分離血清后采用ELISA檢測(cè)IL-1、TNF-α、IFABP、D-LA水平含量，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-1水平比較 見表1。模型組血清TNF-α、IL-1水平持續(xù)升高，較空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高（P＜0.01）；中藥各組血清TNF-α、IL-1水平48 h后逐漸下降，較空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高（P＜0.01）；大柴胡湯兩組血清TNF-α、IL-1水平在給藥后同時(shí)間點(diǎn)均顯著低于模型組（P＜0.05），且高劑量組降低更明顯（P＜0.01）；兩組血清TNF-α、IL-1水平比較，高劑量組上述指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)均較標(biāo)準(zhǔn)劑量組顯著下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-1水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-1水平比較（pg/mL，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與大柴胡湯標(biāo)準(zhǔn)劑量組比較，△P＜0.05。下同。

TNF-αIL-1組別48h 20.65±7.19 170.20±6.21#119.12±4.57#**84.12±5.08#**△空白對(duì)照組模型組大柴胡湯標(biāo)準(zhǔn)劑量組大柴胡湯高劑量組n 5 5 5 5 6h 13.28±2.91 23.39±3.90#22.73±5.07#25.76±3.63#24h 12.54±4.44 76.99±5.02#69.20±4.32#*59.37±4.30#**△48h 15.94±4.75 90.21±3.02#58.46±5.13#**38.98±5.53#**△6h 24.50±10.52 48.12±3.10#54.23±9.70#53.89±5.13#24h 27.43±6.06 146.75±10.12#132.68±4.93#*112.59±9.64#**

2.2 各組大鼠血清I-FABP、D-LA水平比較 見表2。模型組血清IFABP、D-LA水平持續(xù)升高，較空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高（P＜0.01）；大柴胡湯兩組血清I-FABP、D-LA水平48 h后逐漸下降，較空白對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)均明顯升高（P＜0.01）；大柴胡湯兩組血清IFABP、D-LA水平在給藥后同時(shí)間點(diǎn)均顯著低于模型組（P＜0.05），且高劑量組降低更明顯（P＜0.01）；兩組血清I-FABP、D-LA水平比較，高劑量組上述指標(biāo)同時(shí)間點(diǎn)均較標(biāo)準(zhǔn)劑量組顯著下降（PP＜0.05）。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清I-FABP、D-LA比較（μmol/mL，±s）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清I-FABP、D-LA比較（μmol/mL，±s）

I-FABP D-LA組別空白對(duì)照組模型組大柴胡湯標(biāo)準(zhǔn)劑量組大柴胡湯高劑量組n 5 5 5 5 6h 140.12±34.75 254.82±38.20#256.60±25.78#264.76±23.81#24h 146.24±27.35 542.58±13.82#504.34±22.23#*453.37±32.38#**△48h 150.57±23.02 618.79±12.31#436.04±27.63#**321.85±22.03#**△6h 41.74±4.50 56.06±4.94#58.14±6.11#57.38±9.12#24h 42.74±4.58 127.87±8.37#114.55±8.51#*90.57±3.09#**48h 20.65±7.19 154.14±10.83#87.35±6.84#**70.38±4.33#**△

3 討論

重癥中暑大鼠在發(fā)病過(guò)程中，高熱的環(huán)境直接導(dǎo)致大鼠腸道黏膜受損，通透性增加，導(dǎo)致細(xì)菌/毒素更容易經(jīng)過(guò)腸道黏膜進(jìn)入血液，導(dǎo)致腸源性膿毒癥的發(fā)生，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥風(fēng)暴，最終造成多器官功能障礙[6-7]。同時(shí)，熱打擊下的大鼠腸道也同時(shí)出現(xiàn)了缺血、缺血再灌注的損傷過(guò)程[8-9]，進(jìn)一步加重了腸道黏膜屏障的損傷。而當(dāng)腸道的機(jī)械屏障、生物/化學(xué)等屏障被破壞后，各種生物標(biāo)志物會(huì)大量釋放入血。腸道黏膜完好的大鼠腸型脂肪酸結(jié)合蛋白在外周血液中近微量存在[10]。但一旦腸道缺血，可在15 min內(nèi)血清中濃度急劇上升，基于此，I-FABP被認(rèn)為可以反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷的程度[11]。血清D-LA是腸道內(nèi)多種細(xì)菌在腸道組織缺血、缺氧條件下葡萄糖無(wú)氧代謝的產(chǎn)物，產(chǎn)生的D-LA可在腸道黏膜通透性增加時(shí)進(jìn)入血液，并且由于哺乳動(dòng)物不產(chǎn)生分解代謝D-LA的酶系統(tǒng)，故臨床上常通過(guò)對(duì)其水平的檢測(cè)來(lái)反應(yīng)機(jī)體的缺氧情況以及腸黏膜受損程度和通透性變化[12]。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，在造模成功后重癥中暑大鼠的TNF-α、IL-1水平達(dá)持續(xù)升高，在觀察期間仍未達(dá)到最高水平，且同期I-FABP、D-LA均升高，而空白對(duì)照組中，大鼠的TNF-α、IL-1水平并沒有升高，而且同時(shí)期I-FABP、D-LA水平也未出現(xiàn)明顯變化，證明了重癥中暑大鼠在熱打擊后出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)時(shí)，大鼠的腸道黏膜會(huì)受到抑制并出現(xiàn)損傷，該結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果相一致。并且通過(guò)對(duì)比模型組和各劑量中藥組可以發(fā)現(xiàn)，大柴胡湯能夠有效降低TNF-α、IL-1及I-FABP、D-LA水平。

重癥中暑屬于中醫(yī)學(xué)“暑厥”“暑風(fēng)”范疇。傳統(tǒng)認(rèn)為暑熱傷陰耗氣，氣機(jī)逆亂，神明失養(yǎng)為本病主要病機(jī)，治以清暑益氣，養(yǎng)陰生津?yàn)榉?。近?lái)有學(xué)者認(rèn)為熱毒、血瘀與中暑的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并運(yùn)用清熱解毒，涼血活血及益氣養(yǎng)陰，醒腦開竅的中藥治療中暑患者取得較好療效[13-14]。本課題組長(zhǎng)期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，中暑的患者多出現(xiàn)胃腸功能障礙，以腹脹，大便難解為主要癥狀。基于此，我們認(rèn)為陽(yáng)明經(jīng)腑邪熱熾盛，少陽(yáng)樞機(jī)不利是本病的主要病機(jī)特點(diǎn)之一，理當(dāng)和解少陽(yáng)、通腑瀉熱。大柴胡湯出自《金匱要略》，為和解少陽(yáng)、內(nèi)瀉熱結(jié)的代表方，對(duì)多種伴隨腸道功能障礙的危重癥具有確切療效。而本研究也確實(shí)證明了大柴胡湯對(duì)重癥中暑大鼠的胃腸黏膜屏障有極好的保護(hù)作用。重癥中暑的啟動(dòng)器官是腸道，保護(hù)腸道功能，西醫(yī)強(qiáng)調(diào)積極降溫，早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，保持大便通暢，這與中醫(yī)學(xué)“保胃氣”“六腑以通為用”的觀點(diǎn)不謀而合。

對(duì)于大柴胡湯降低I-FABP、D-LA水平的機(jī)制，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)是由于大柴胡湯能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的生成，從而直接減少腸道黏膜的損傷。但是具體通過(guò)何種內(nèi)在途徑尚未清楚，因此本實(shí)驗(yàn)仍需進(jìn)一步研究其內(nèi)在機(jī)制，為明確大柴胡湯保護(hù)腸道黏膜的分子途徑提供證據(jù)。且本研究在觀察期間，模型組的炎癥反應(yīng)及腸道黏膜屏障受損仍在持續(xù)，中藥治療組已呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，證明了大柴胡湯不僅僅能有效治療重癥中暑，且能提早干預(yù)并減輕炎癥反應(yīng)，從而起到保護(hù)腸道黏膜的作用。

綜上，大柴胡湯能夠有效抑制重癥中暑大鼠的炎癥反應(yīng)，并且對(duì)腸道黏膜保護(hù)起到作用，其機(jī)制可能與通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子生成相關(guān)。