參芪益心方對心力衰竭大鼠心功能及其心肌細(xì)胞凋亡率的影響*

陳 鵬 李嘉寧 劉 莉 崔 璇

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

心力衰竭常常由于心室泵送血液或充盈功能過低，心血排出量無法滿足人體的新陳代謝要求，流向組織和臟器間的血液不足所致，是心臟的各種病變進(jìn)展到嚴(yán)重階段時(shí)的一種臨床綜合征[1-2]。隨著人口增加、人口老齡化和各種并發(fā)癥的增加，心力衰竭患者數(shù)量預(yù)計(jì)將在未來大幅上升[3]。研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭發(fā)生發(fā)展常常與心肌細(xì)胞代謝障礙、心肌重構(gòu)密切相關(guān)[4]。西醫(yī)治療上結(jié)合中醫(yī)辨證療法可以有效改善心力衰竭患者的臨床癥狀，提高生活質(zhì)量[5]。參芪益心方是我院劉莉教授的經(jīng)驗(yàn)方，具有理氣、溫陽、活血、利水之效，療效較佳[6]。以往研究發(fā)現(xiàn)參芪益心方可以有效地改善心肌細(xì)胞的功能[7]。在本研究中，我們將參芪益心方用于阿霉素腹腔注射誘導(dǎo)的心力衰竭模型[8]，并追蹤其對大鼠心功能和心肌細(xì)胞凋亡率的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只Wistar大鼠，雄性，購自長春市億新實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，體質(zhì)量（200±20）g，生產(chǎn)許可證：SCXK-（吉）2011-0004；使用許可證號：SYXK-（黑）2008-007。常溫房間飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.2 藥物與試劑 參芪益心方由太子參、黃芪各20 g，赤芍、茯苓、丹參、五味子、麥門冬、五加皮、葶藶子各15 g，桂枝、炙甘草各10 g組成。飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，加水濃煎后分別制成含量為1.696 g/mL和3.392 g/mL的水煎劑備用。卡維地洛（齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020535，規(guī)格6.25 mg/片），用滅菌注射用水配成0.558 mg/kg溶液備用。阿霉素（浙江海正藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H44024359，規(guī)格10 mg/瓶），用滅菌注射用水配成0.8 mg/mL溶液備用。芪藶強(qiáng)心膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字Z20040141，規(guī)格0.3 g/粒），用滅菌注射用水配成0.3214 g/kg溶液備用。PBS緩沖液（杭州四季青生物生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：020311）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國羅氏公司），電熱恒溫箱（上海一恒），2135型輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)（德國萊卡公司），BX60光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，日本）病理圖像分析系統(tǒng)（CIMAS Med 6.0，麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司）。

1.4 分組與造模 大鼠喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組，每組15只，即正常對照組、模型組、西藥對照組、芪藶強(qiáng)心組、參芪益心方低劑量組、參芪益心方高劑量組。參考文獻(xiàn)[8]，除正常對照組外，其余各組于造模的第1、3、5周，用配制好的阿霉素溶液以3 mg/mL給藥，第2、4、6周以2 mg/mL的劑量給藥。正常對照組腹腔注射等容積的生理鹽水。每周1次，共注射6周。

1.5 給藥方法 造模成功后，正常對照組大鼠自由飲食、飲水，模型組大鼠注射10 mL/kg生理鹽水，西藥對照組注射0.558 mg/kg卡維地洛，芪藶強(qiáng)心組灌服0.3214 g/kg的芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液，參芪益心方低劑量組灌服1.696 g/mL的參芪益心方煎劑，參芪益心方高劑量組灌服3.392 g/mL的參芪益心方煎劑，每日1次，共4周。

1.6 心功能檢測 各組大鼠在灌胃結(jié)束后4周后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖。腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位，胸部備皮，選用10 MHz射頻探頭，與胸骨呈20～30°，顯示沿二尖瓣口至心尖方向的左心室長軸切面。B超獲取胸骨旁左心室長軸的二維圖形，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M超，用M超確定左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDD）和收縮末期的內(nèi)徑（LVSD），并用Teichholtz公式計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）。每個(gè)數(shù)據(jù)集取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均數(shù)。

1.7 標(biāo)本采集與檢測 1）心臟組織形態(tài)學(xué)。采用頸椎脫臼法處死大鼠，修塊組織后清洗掉固定液，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，常規(guī)切片后裱于涂有聚賴氨酸的載玻片上，4℃存放備用。切片經(jīng)HE染色后用中性樹膠膠印封片，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織病理變化并攝片。2）細(xì)胞凋亡率檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加胃蛋白酶K，室溫下孵育30 min，PBS沖洗2次；擦干樣品周圍的水，滴加50 μL的Tunel反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS沖洗3次；擦干樣品周圍的水，滴加50 μL的轉(zhuǎn)化劑POD，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS沖洗3次；滴加顯色劑DAB，室溫下10 min，蒸餾水充分沖洗；蘇木素復(fù)染1 min；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。用CMIAS對細(xì)胞凋亡切片進(jìn)行分析，觀察心肌細(xì)胞凋亡密度。在200倍顯微鏡下，每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野并將圖像輸入計(jì)算機(jī)，選擇1個(gè)細(xì)胞凋亡模塊，用灰度對比調(diào)整方法計(jì)算視野內(nèi)的染色細(xì)胞面積。然后把已凋亡細(xì)胞的總面積與統(tǒng)計(jì)領(lǐng)域的總面積之比（即表面密度）作為統(tǒng)計(jì)數(shù)字，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料分別采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠的LVSD、LVDD均增加，F(xiàn)S、EF均有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各治療組與模型組對比，各指標(biāo)都有顯著改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；參芪益心方低劑量組與西藥對照組、芪藶強(qiáng)心組比較，各指標(biāo)都有顯著改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。參芪益心方高劑量組與低劑量組比較，LVSD、LVDD無差異，F(xiàn)S、EF有改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與西藥對照組比較，△△P＜0.01；與芪藶強(qiáng)心組比較，##P＜0.01；與參芪益心方低劑量組比較，▲P＜0.05。下同。

組別正常對照組模型組西藥對照組芪藶強(qiáng)心組參芪益心方低劑量組參芪益心方高劑量組n 15 10 13 12 11 13 LVSD（mm）3.736±0.297**5.154±0.455 4.315±0.195**4.313±0.186**4.836±0.166*△△##4.328±0.159**LVDD（mm）5.102±0.236**6.731±0.333 5.917±0.182**5.798±0.156**6.319±0.256*△△##5.695±0.162**FS（%）48.279±1.990**22.229±2.097 41.530±2.481**41.620±2.313**28.020±2.506*△△##42.495±1.725**▲EF（%）83.741±2.372**44.701±3.740 76.530±3.191**74.919±3.290**52.502±4.671*△△##73.790±2.301**▲

2.2 各組大鼠心肌病理變化 正常對照組：心肌纖維成束排列，結(jié)構(gòu)均勻，心肌間質(zhì)無腫脹或充血，無炎細(xì)胞浸潤。模型組：心肌纖維損傷、變性和壞死，間質(zhì)血管擴(kuò)張和充血，炎細(xì)胞浸潤和心肌成纖維細(xì)胞增殖。西醫(yī)對照組：心肌纖維輕微腫脹，少數(shù)纖維腫脹或破裂，間質(zhì)血管擴(kuò)張和充血，少量炎細(xì)胞發(fā)生浸潤。芪藶強(qiáng)心組：心肌纖維腫脹，部分心肌組織萎縮，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，炎細(xì)胞浸潤。參芪益心方低劑量組：心肌纖維充血和腫脹，有散在的炎細(xì)胞浸潤。參芪益心方高劑量組：心肌纖維呈束狀，輕微腫脹，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 正常對照組：大腦偶見凋亡細(xì)胞。模型組：凋亡細(xì)胞數(shù)目比正常對照組明顯增多。西醫(yī)對照組：凋亡細(xì)胞數(shù)目比模型組明顯減少。芪藶強(qiáng)心組：可見凋亡細(xì)胞，但數(shù)目比模型組減少。參芪益心方低劑量組：可見凋亡細(xì)胞，但數(shù)目比模型組減少。參芪益心方高劑量組：凋亡細(xì)胞數(shù)目比模型組明顯減少。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡觀察（電鏡，11 500倍）

模型組凋亡細(xì)胞的表面密度與正常對照組相比較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組調(diào)節(jié)細(xì)胞的表面密度明顯降低（P＜0.01）。各治療組之間比較無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠細(xì)胞凋亡面密度（±s）

表2 各組大鼠細(xì)胞凋亡面密度（±s）

組 別n 面密度正常對照組模型組西藥對照組芪藶強(qiáng)心組參芪益心方低劑量組參芪益心方高劑量組15 10 13 12 11 13 0.0668±0.0098**0.1130±0.0122 0.0777±0.0066**0.0809±0.0113**0.0813±0.0114**0.0740±0.0082**

3 討論

研究表明，細(xì)胞凋亡是心血管疾病中介導(dǎo)的一種新的細(xì)胞死亡形式，多涉及幾個(gè)關(guān)鍵分子，如RIPK1、RIPK3和MLKL[9]。心肌細(xì)胞在心力衰竭的早期出現(xiàn)與演變發(fā)展中起了關(guān)鍵性的作用，大量人體心肌細(xì)胞凋亡或（和）纖維化是心力衰竭時(shí)細(xì)胞功能異常的主要原因[10]。細(xì)胞凋亡引起心室重塑[11]，心室重塑與心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)。在心肌細(xì)胞中，心臟重構(gòu)進(jìn)行收縮運(yùn)動(dòng)時(shí)最基本的結(jié)構(gòu)單元是肌絲，而肌絲超微構(gòu)造的改變也會(huì)影響整體的收縮運(yùn)動(dòng)功能。線粒體是心肌細(xì)胞能量代謝的基礎(chǔ)場所，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化在一定程度上反映了心功能的下降與否。成功建立心衰動(dòng)物模型是研究心衰的重要一步。大鼠價(jià)格便宜，易于飼養(yǎng)，耐受性好，心臟的解剖學(xué)和生理學(xué)與人類相似。歐洲心臟病學(xué)會(huì)常依據(jù)心功能水平高低來評定心力衰竭的程度[12]；超聲心動(dòng)圖可以準(zhǔn)確評估心腔的大小和心室功能，逐漸應(yīng)用于心血管疾病的小動(dòng)物模型研究[13]。故本研究主要通過B超評估心力衰竭大鼠的心功能，并通過公式來估算EF和FS。

中醫(yī)首次提到“心衰”一詞源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“心氣始衰，苦憂悲……故好臥”。通過歷代不同專家的探討，心衰原因大多歸于本虛標(biāo)實(shí)，本是心臟缺少陽氣，標(biāo)是血液瘀滯、水液和痰水潴留[14]。氣為血之帥，故氣既可生血，也能行血，因心氣不足故血瘀脈道；氣虛之極為陽虛，長期氣虛會(huì)導(dǎo)致陽氣不足，血液失于溫煦，亦可滯于脈中。氣既可生津，又可行津，氣虛則無法運(yùn)化水液，氣不行水，從而導(dǎo)致水液與痰液停滯。

我院劉莉教授在理氣、溫陽、活血、利水基礎(chǔ)上研究出參芪益心方[7]。筆者以參芪益心方加味，取其大補(bǔ)心陽且活血化痰之功，基本組成包括太子參、黃芪、桂枝、茯苓、赤芍、丹參、五味子、麥門冬、五加皮、葶藶子、炙甘草。方中君藥為太子參與黃芪，補(bǔ)中益氣，振奮心陽，令瘀血、水飲之邪去；《本草綱目》“丹參……能破宿血也”，丹參、赤芍合用祛瘀通絡(luò)利水；五加皮利水勝濕消腫；五味子益氣生津；葶藶子利水平喘。諸藥合用使心陽得溫，陽氣得充，瘀血得行，經(jīng)脈得通，諸癥得解。

現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)參芪益心方在治療心力衰竭療效顯著。藥理研究結(jié)果表明太子參可以改善心肌組織的氧化應(yīng)激，改善NOS-NO系統(tǒng)，減少心肌細(xì)胞的凋亡[15]。黃芪的藥理作用與它對細(xì)胞內(nèi)信號的影響有關(guān)，通過減少信號通路的激活來減弱細(xì)胞凋亡，并恢復(fù)左心室的收縮和舒張功能[16]。茯苓可以明顯減低炎癥因子的表達(dá)水平，如hs-CRP、TNF-α和IL-6，故可抑制炎癥反應(yīng)，抵抗神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度興奮，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)了心室重構(gòu)，黃芪和茯苓的組合可以修復(fù)心肌損傷[17]。經(jīng)吳繁等[18]研究發(fā)現(xiàn)，參芪益心方可以有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)衰竭心肌能量底物的代謝重構(gòu)，保護(hù)心肌細(xì)胞。

本研究結(jié)果證明參芪益心方可以有效改善心衰大鼠心臟功能、病理變化和細(xì)胞凋亡率，為進(jìn)一步研究和開發(fā)抗心衰的有效藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。