疏肝溫膽湯對動脈粥樣硬化大鼠血脂和miR-613、LXRα mRNA表達(dá)的影響*

伍啟華 蔡海榮 張浩波 陳伯鈞 劉淑玲△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405）

動脈粥樣硬化（AS）是心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，與缺血性心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，2020年度我國近期發(fā)生腦血管事件患者中，高危頸動脈粥樣硬化斑塊的檢出率為28%[3]，可見AS防治在心腦血管疾病的防治中是必要的。臨床實踐中，規(guī)范的血脂管理、調(diào)脂穩(wěn)斑、抗血小板聚集配合血壓、血糖控制等已成為AS基礎(chǔ)治療方案，但服藥品類繁多的現(xiàn)狀，加重患者心理負(fù)擔(dān)，降低患者治療依從性，且不良反應(yīng)也值得關(guān)注。

疏肝溫膽湯是本文通信作者、廣東省名中醫(yī)陳伯鈞教授的經(jīng)驗方，為經(jīng)典名方柴胡疏肝散和溫膽湯的合方。陳伯鈞教授認(rèn)為“氣滯血瘀痰濕”是AS的核心病機(jī)，且團(tuán)隊在臨床實踐及動物實驗中發(fā)現(xiàn)，疏肝溫膽湯能夠保護(hù)內(nèi)皮功能、改善糖脂代謝、抗炎[4-6]，故擬疏肝溫膽湯為防治AS的基礎(chǔ)方。有文獻(xiàn)指出，MicroRNAs（miRNAs）參與調(diào)控與炎癥反應(yīng)及脂類代謝，其中有細(xì)胞實驗證明miR-613能夠靶向針對肝臟LXRα基因，從而參與脂肪酸的合成，進(jìn)而影響脂類代謝[7]。因此，本研究以miR-613、LXRα為切入點，觀察疏肝溫膽湯對miR-613、LXRα、血脂相關(guān)指標(biāo)及動脈內(nèi)皮損傷病理表現(xiàn)的影響，進(jìn)一步探討疏肝溫膽湯保護(hù)動脈內(nèi)皮的可能機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級4月齡健康SD大鼠60只，體質(zhì)量160～180 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2018-0002。分籠飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%。本研究通過廣東省中醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器 疏肝溫膽湯，組方：柴胡12 g，枳實15 g，半夏10 g，陳皮15 g，竹茹12 g，甘草6 g，茯苓20 g，白芍15 g，丹參15 g。中藥飲片均購自康美藥業(yè)股份有限公司。按照《藥理實驗方法學(xué)》[8]中人-鼠藥物劑量換算，高、中、小劑量分別按照生藥含量8.52、4.26、2.13 g/kg灌胃。阿托伐他汀鈣片，輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字號J20171062，批號為20180543，加生理鹽水配制成質(zhì)量濃度0.10 mg/mL的混懸液。高脂飼料按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配方：2%膽固醇、4%豬油、10%蛋黃粉及84%基礎(chǔ)飼料。普通基礎(chǔ)飼料和高脂飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。總膽固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒（南京卡米洛生物工程有限公司）；日立7180型自動生化分析儀（日本Hitachi公司）；低溫冷凍離心機(jī)TGL-16R（Hema公司）；基因擴(kuò)增儀 Hema9600（Hema廠家）；Real-time Quantitative PCR機(jī)器 Bio-Rad CFX-96（Bio-Rad公司）；Trizol（TR118-500，MRC公司）。

1.3 分組與造模 60只大鼠平均分為正常組、模型組、阿托伐他汀組和中藥高、中、低劑量組，每組各10只。采用免疫損傷合并高脂飼料誘導(dǎo)合并束縛情志應(yīng)激法誘導(dǎo)大鼠AS模型。造模第1天正常組一次性尾靜脈靜脈注射40 mg/kg的生理鹽水，喂飼普通飼料，其余各組尾靜脈注射40 mg/kg牛血清白蛋白進(jìn)行免疫刺激，喂飼高脂飼料并配合束縛情志法干預(yù)：讓大鼠鉆進(jìn)束縛筒并調(diào)整好適當(dāng)?shù)幕顒涌臻g，水平地板上進(jìn)行建模，每次束縛30 min，每隔1 h束縛1次，每天束縛4次。束縛間期，實驗動物自由攝食。各組動物每日進(jìn)食總量相等，限制為100 g，分2次，每12小時1次。各組大鼠于8周末行血管超聲檢查，動脈內(nèi)膜有粥樣斑塊形成為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 給藥方法 于造模同時開始給藥。按照上述換算標(biāo)準(zhǔn)，中藥高、中、小劑量組分別按照8.52、4.26、2.13 g/kg予疏肝溫膽湯灌胃；阿托伐他汀組按照15 mg/kg予阿托伐他汀混懸液灌胃；正常組和模型組灌胃等量蒸餾水。各組每日給藥1次，共8周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 實驗過程中記錄大鼠死亡情況，8周末測量體質(zhì)量、血壓（收縮壓、舒張壓）。1）脂類代謝指標(biāo)測定。末次給藥后禁食不禁飲12 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，逐層打開腹腔，腹主動脈取血10 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，-80℃保存，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清TC、TAG、HDLC、LDL-C水平，計算血漿致動脈粥樣硬化指數(shù)（AIP），AIP=ln（TG/HDL-C）。2）血管病理變化。處死大鼠，取腹主動脈約2 cm，將新鮮組織標(biāo)本固定于4%甲醛中24 h以上，選擇組織標(biāo)本的最大切面進(jìn)行修整后放置于脫水儀依次梯度酒精脫水及浸蠟3 h，包埋、切片，38℃的溫箱內(nèi)過夜，取出室溫保存，進(jìn)行脫蠟水化，蘇木素-伊紅染液染色，染色后脫水中性樹膠封片，顯微鏡下鏡檢并拍照。3）miR-613、LXRα測定。取一定量的肝組織，采用RT-qPCR檢測miR-613、LXRα的mRNA表達(dá)水平。在NCBI上搜索到目的基因，再用primer5.設(shè)計引物，引物為miR-613-QPCR-Rat-RT、LXRa-QPCR-Rat-F、LXRa-QPCR-Rat-R，提取組織樣品中的總RNA，檢測總RNA的純度、濃度及完整性。cDNA 逆轉(zhuǎn)錄；95℃ 120 s（熱變性），95℃ 15 s（變性），60℃ 30 s（退火延伸），60～95℃（溶解曲線），總45個循環(huán)；再進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算靶基因的mRNA相對表達(dá)水平，所有靶基因的表達(dá)在正常組都設(shè)為1。每個樣品均重復(fù)3次。GraphPad Prism軟件計算定量結(jié)果和數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計量數(shù)據(jù)以夏皮洛-威爾克方法（S-W法）結(jié)合圖示法（直方圖、P-P圖、Q-Q圖）檢驗正態(tài)性，正態(tài)數(shù)據(jù)以（）表示，偏態(tài)數(shù)據(jù)以中位數(shù)（P25，P75）[M（P25，P75）]表示。多組比較，正態(tài)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，偏態(tài)數(shù)據(jù)采用秩和檢驗，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、血壓比較 見表1。共有51只大鼠造模成功，各組間體質(zhì)量、收縮壓差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），舒張壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組體質(zhì)量及收縮壓均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，中藥高劑量組、阿托伐他汀組收縮壓均顯著降低（P＜0.05），中藥高、中劑量組及阿托伐他汀組體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05）。與阿托伐他汀組比較，中藥高劑量組收縮壓降低（P＜0.05），體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血壓比較

2.2 各組大鼠動脈內(nèi)膜損傷的病理變化比較 正常組：主動脈標(biāo)本內(nèi)膜多光滑平整，鏡下見內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平狀，平滑肌細(xì)胞呈長梭形狀且排列整齊，細(xì)胞核大小均勻，細(xì)胞膜及核膜清晰完整，漿內(nèi)染色均勻，胞內(nèi)未見泡沫狀改變，管壁無脂質(zhì)沉積，管腔未見明顯狹窄。模型組：主動脈內(nèi)膜明顯增厚，鏡下見平滑肌細(xì)胞排列欠整齊，胞內(nèi)大量泡沫細(xì)胞聚集，泡沫細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)內(nèi)含有大量空泡，從而導(dǎo)致管腔明顯狹窄。中藥低劑量組：大鼠腹主動脈內(nèi)膜鏡下表現(xiàn)與模型組大致相近。中藥高、中劑量組及阿托伐他汀組：主動脈內(nèi)膜局部可見輕度增厚，并能夠看見少許泡沫樣改變，部分管腔有少許狹窄，但其病變程度均輕于模型組。見圖1。

圖1 各組腹主動脈標(biāo)本動脈內(nèi)膜損傷病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血脂相關(guān)指標(biāo)比較 見表2。各組間TC、TAG、HDL-C、LDL-C水平及AIP差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組TC、TAG、LDL-C水平及AIP均顯著升高（P＜0.05），HDL-C顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，中藥高劑量組TC、TAG、LDL-C水平、AIP均顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平均顯著升高（P＜0.05）；阿托伐他汀組TC水平顯著降低（P＜0.05），TAG、LDL-C、HDL-C水平、AIP差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)比較（±s）

組別正常組模型組阿托伐他汀組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組n 9 8 9 8 8 9 TC（mmol/L）0.53±0.14*1.07±0.22 0.83±0.18*0.81±0.11*0.79±0.16*0.94±0.12 TAG（mmol/L）0.41（0.30，0.44）*0.80（0.72，0.92）0.68（0.51，0.74）0.49（0.44，0.53）*0.56（0.41，0.61）0.82（0.60，1.02）HDL-C（mmol/L）0.39±0.01*0.25±0.64 0.31±0.05 0.37±0.53 0.34±0.05 0.29±0.04 LDL-C（mmol/L）0.13±0.02*0.50±0.10 0.32±0.11 0.22±0.12*0.30±0.12*0.44±0.15 AIP 0.00（-0.45，0.05）*0.54（0.38，0.64）0.35（0.22，0.38）0.10（0.08，0.18）*0.24（0.04，0.28）*0.47（0.26，0.56）

2.4 各組大鼠肝組織miR-613、LXRα mRNA表達(dá)量比較 見表3。各組間miR-613、LXRα mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組大鼠miR-613 RNA表達(dá)明顯升高，LXRα mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，中藥高、低劑量組、阿托伐他汀組miR-613 RNA表達(dá)均顯著降低，LXRα mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；阿托伐他汀組與中藥高劑量組miR-613及LXRα mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠肝組織miR-613、LXRα mRNA表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠肝組織miR-613、LXRα mRNA表達(dá)量比較（±s）

組別正常組模型組阿托伐他汀組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組n9 8 9 8 8 9 miR-613 1.10±0.31*4.52±0.74 1.59±0.27*1.72±0.74*2.23±0.81*4.61±0.61 LXRα 0.87±0.28*0.46±0.31 0.78±0.19*0.80±0.10*0.71±0.17*0.52±0.22

3 討論

AS作為心腦血管缺血性疾病的中心環(huán)節(jié)，目前發(fā)病機(jī)制尚未明確，脂質(zhì)浸潤學(xué)說、內(nèi)皮損傷-反應(yīng)學(xué)說、血小板聚集和血栓形成學(xué)說、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說都是廣為接受的經(jīng)典學(xué)說[1]。有文獻(xiàn)指出，血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致血脂異常冠心病的血管內(nèi)皮組織損傷[9]，伴有胰島素抵抗可能與阿司匹林抵抗進(jìn)而誘發(fā)動脈粥樣硬化性缺血事件[10]。故可能上述幾種學(xué)說對于AS的發(fā)生發(fā)展存在復(fù)合作用，目前亦未存在藥物能同時針對多種機(jī)制。

本團(tuán)隊負(fù)責(zé)人陳伯鈞教授認(rèn)為，AS作為一種慢性疾病，病位在心、肝、脾胃、腦，病因主要為飲食不慎、勞逸失衡，痰瘀為重要病理因素及病理產(chǎn)物，主要核心病機(jī)為氣滯痰瘀，治法為疏肝行氣，健脾化痰，活血化瘀。疏肝溫膽湯取柴胡疏肝散合溫膽湯，方中柴胡、芍藥、枳實、甘草為傷寒四逆散組成，合白芍酸甘養(yǎng)陰，斂陰和血活血，疏肝和血行氣，旨在以肝為切入點，恢復(fù)機(jī)體正常氣機(jī)；半夏、陳皮、竹茹、茯苓為二陳湯主要組成，可燥濕健脾化痰，旨在以脾胃為切入點，祛除痰濕病邪；再合丹參，養(yǎng)血、活血、祛瘀、清心，旨在祛除瘀血病邪。全方共奏疏肝行氣、健脾化痰、活血化瘀之功，標(biāo)本兼顧，扶正祛邪。

本項研究，通過免疫損傷合并高脂飼料誘導(dǎo)、束縛情志應(yīng)激法構(gòu)建AS大鼠模型，造模后發(fā)現(xiàn)AS大鼠腹主動脈內(nèi)膜病理鏡下見內(nèi)膜明顯增厚，管腔明顯狹窄，這與多項AS相關(guān)動物實驗結(jié)果一致[11-13]。本實驗證實：疏肝溫膽湯能明顯改善AS大鼠的腹主動脈內(nèi)膜病理改變，同時證實疏肝溫膽湯能明顯降低TC、TAG、LDL-C水平及AIP，提高HDL-C水平。其中高劑量疏肝溫膽湯對TAG、LDL-C、HDL-C及AIP的作用優(yōu)于阿托伐他汀，與既往研究結(jié)論一致[14-15]。

mirco-RNA（miR）作為上游因子靶向針對多個mRNA，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體多種生理活動及介導(dǎo)多種病理生理進(jìn)程。文獻(xiàn)指出，miR-126、miR-210、miR613等miR的表達(dá)異常通過影響內(nèi)皮功能、脂類代謝等促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[16-18]，可能成為治療AS的上游靶點。而多項中藥、中成藥針對脂類代謝的臨床試驗證實，上調(diào)LXRα可改善血脂[19-20]。本次實驗結(jié)果證實疏肝溫膽湯能顯著下調(diào)miR-613的mRNA表達(dá)、上調(diào)LXRα的mRNA表達(dá)。本次實驗上調(diào)LXRα的mRNA表達(dá)的結(jié)論與其他學(xué)者溫膽湯變方對于LXRα作用的研究結(jié)論一致[21]。而miR-613的mRNA表達(dá)降低、LXRα的mRNA表達(dá)升高，也符合Ou Z對于miR-613與LXRα之間負(fù)反饋調(diào)控的結(jié)論[7]。目前暫無藥物調(diào)控miR-613的文獻(xiàn)報道。

結(jié)合本次研究結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，疏肝溫膽湯可以延緩大鼠動脈粥樣硬化進(jìn)程，可能通過下調(diào)miR-613的表達(dá)、上調(diào)LXRα的表達(dá)進(jìn)而影響血脂代謝實現(xiàn)。本團(tuán)隊后續(xù)也將展開基于miR-613/LXRα通路探討疏肝溫膽湯對于AS的作用機(jī)制研究，以明確疏肝溫膽湯延緩AS進(jìn)展的作用機(jī)制，為疏肝溫膽湯治療AS提供了更扎實的理論基礎(chǔ)。