陰陽雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌作用機(jī)制探討*

楊夢霞 蘆殿榮 朱世杰 周 磊

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

骨骼是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移最主要的目標(biāo)器官之一，轉(zhuǎn)移率僅次于肺和肝[1]。約2/3晚期惡性腫瘤患者會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[2]，在臨床上主要表現(xiàn)為局部持續(xù)性進(jìn)行性刺痛和明顯的壓痛、病理性骨折、椎體轉(zhuǎn)移的脊髓壓迫、高血鈣等，嚴(yán)重影響了患者一般機(jī)體狀況和生活質(zhì)量，縮短生存期[3]。目前西醫(yī)多采用放療、手術(shù)及藥物治療等姑息療法，但臨床應(yīng)用局限且存在許多不良事件，如：骨折、低血鈣癥和頜骨壞死等[4]。近年來，中醫(yī)藥在改善腫瘤患者生活質(zhì)量、緩解臨床癥狀、延長生存期等方面具有顯著優(yōu)勢，且療效明確，不良反應(yīng)少[5]。歷代中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為腫瘤骨轉(zhuǎn)移多是腎精虧虛、骨失濡養(yǎng)所致。本研究團(tuán)隊(duì)通過總結(jié)全國名老中醫(yī)李佩文教授臨床用藥經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，歸腎經(jīng)方——陰陽雙補(bǔ)方對(duì)骨轉(zhuǎn)移防治具有較好的臨床療效，但其作用機(jī)制尚未清楚。故本研究擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討陰陽雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌的理論內(nèi)涵，以便為今后臨床用藥提供更多參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陰陽雙補(bǔ)方主要有效成分篩選 在中藥數(shù)據(jù)庫TCMSP（http：//lsp.Nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中檢索陰陽雙補(bǔ)方（由補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉、淫羊藿、透骨草、山茱萸、山藥、熟地黃組成）有效成分，保留OB≥30%且DL≥0.18的成分；同時(shí)，借助TCMID（http：//www.mega-bionet.org/tcmid/）及TCM Database@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/）中藥數(shù)據(jù)庫對(duì)檢索不到有效成分的藥物進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 陰陽雙補(bǔ)方潛在靶點(diǎn)預(yù)測 在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索陰陽雙補(bǔ)方主要有效成分所對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并在Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中，以“Homo sapiens”為檢索條件，保留“Probability＞0.1”的潛在靶點(diǎn)；最后使用Cytoscape3.8.2中的MCODE（Version1.4.2，Bader Lab，University of Toronto）插件，篩選出重要模塊基因并進(jìn)行可視化分析。

1.3 骨轉(zhuǎn)移癌疾病基因篩選 在Drugbank（http：//www.drugbank.ca/）和DisGeNet（http：//www.disgenet.org/）疾病基因數(shù)據(jù)庫中，查詢骨轉(zhuǎn)移癌疾病基因，并在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中將基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 陰陽雙補(bǔ)方針對(duì)骨轉(zhuǎn)移癌的潛在治療靶點(diǎn)預(yù)測 通過韋恩映射篩選出潛在治療靶點(diǎn)，同時(shí)使用STRING11.5（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建基因功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape3.8.2中可視化，同時(shí)利用MCODE插件篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 潛在治療靶點(diǎn)功能分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）分別對(duì)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析，并將結(jié)果可視化（FDR＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 陰陽雙補(bǔ)方主要有效成分 在中藥數(shù)據(jù)庫中檢索到陰陽雙補(bǔ)方主要有效成分共88個(gè)（補(bǔ)骨脂4個(gè)、骨碎補(bǔ)17個(gè)、肉蓯蓉6個(gè)、淫羊藿23個(gè)、透骨草7個(gè)、山茱萸肉14個(gè)、山藥15個(gè)、熟地黃2個(gè)），見表1（僅列出每位藥OB值排名前5的有效成分）。

表1 陰陽雙補(bǔ)方主要有效成分

2.2 陰陽雙補(bǔ)方潛在靶點(diǎn) 在Swiss Target Prediction中檢索到陰陽雙補(bǔ)方共包含673個(gè)靶點(diǎn)。將這些靶點(diǎn)在Cytoscape3.8.2中使用MCODE插件篩選重要模塊靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)主要位于模塊A（得分為29.568，含36個(gè)節(jié)點(diǎn)，547條邊）和B（得分為17.017，含58個(gè)節(jié)點(diǎn)，502條邊），見圖1。

圖1 陰陽雙補(bǔ)方潛在靶點(diǎn)重要模塊基因

2.3 陰陽雙補(bǔ)方針對(duì)骨轉(zhuǎn)移癌的潛在治療靶點(diǎn) 在疾病基因數(shù)據(jù)庫中檢索到骨轉(zhuǎn)移癌疾病基因有773個(gè)，與673個(gè)藥物潛在靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩映射，得到150個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，見圖2。在STRING11.5數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape3.8.2中可視化，包含145個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 531條邊，見圖3A；并使用MCODE插件篩選核心靶點(diǎn)，取節(jié)點(diǎn)連接度排名前20的靶點(diǎn)做條形圖，見圖3B。

圖2 陰陽雙補(bǔ)方潛在靶點(diǎn)和骨轉(zhuǎn)移癌疾病基因的韋恩圖

圖3 陰陽雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌的潛在靶點(diǎn)（A）及核心靶點(diǎn)（B）

2.4 潛在治療靶點(diǎn)的GO功能分析 對(duì)150個(gè)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，根據(jù)“FDR＜0.05”篩選得到BP48個(gè)、CC9個(gè)和MF30個(gè)。分別取BP、MF排名前10的條目及9項(xiàng)CC進(jìn)行可視化，見圖4。在BP方面，包括蛋白質(zhì)自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化及磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等；在CC中，涉及樹突、磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物及溶酶體等；在MF方面，涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性及磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶活性等。

圖4 陰陽雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌潛在靶點(diǎn)的GO功能富集分析

2.5 潛在治療靶點(diǎn)的KEGG功能分析 對(duì)150個(gè)潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到97條通路，根據(jù)“FDR＜0.05”篩選得到82條通路，將前30條通路進(jìn)行可視化，見圖5。相關(guān)通路主要有HIF-1、Rap1、VEGF、PI3K-Akt及mTOR等信號(hào)通路。

圖5 陰陽雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞在趨化作用下可改造骨微環(huán)境，而骨微環(huán)境也在不斷招募腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞向骨組織定植[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主骨生髓，故骨轉(zhuǎn)移患者多從腎論治。本研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)李老治療骨轉(zhuǎn)移臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，選取常用補(bǔ)腎類中藥加減化裁組成“陰陽雙補(bǔ)方”，方中補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)補(bǔ)腎助陽，肉蓯蓉補(bǔ)腎溫陽，益精血，3藥相輔相成，培補(bǔ)腎中元陽，共為君藥；熟地黃滋補(bǔ)腎精，山茱萸肉、山藥養(yǎng)肝補(bǔ)脾，俱為臣藥；淫羊藿、透骨草益腎強(qiáng)骨，兩藥合用，助君藥溫壯腎陽之功；諸藥合用，補(bǔ)腎之中兼顧養(yǎng)肝益脾，使腎精得充而虛損易復(fù)；溫陽之中參以滋陰填精，則陽得陰助而生化無窮，諸藥合用，共奏補(bǔ)腎助陽、益精填髓之效，但作用機(jī)制尚未清楚。

本研究通過篩選“陰陽雙補(bǔ)方”主要有效成分，并構(gòu)建其與相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及淫羊藿苷等為其核心化合物。其中β-谷甾醇一方面可通過清除活性氧誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，另一方面可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白和PCNA抗原的表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞生長[7]。山柰酚可抑制中性粒細(xì)胞釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，此外也可激活MAPK信號(hào)和MMP信號(hào)[8]。槲皮素可抑制甲狀旁腺激素受體1活性，阻礙其與甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關(guān)肽的結(jié)合，進(jìn)而降低人轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、黏附、增殖和遷移率[9]。淫羊藿苷具有抑制血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，其作用機(jī)制主要是通過降低肝癌細(xì)胞中VEGF和APRIL的表達(dá)水平以抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移[10]。

通過Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建“陰陽雙補(bǔ)方”治療骨轉(zhuǎn)移癌的功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)EGFR、CASP3、STAT3、AKT1、ERBB2及MMP2/9。其中EGFR在促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中有重要作用，研究認(rèn)為可溶性因子可通過旁分泌機(jī)制激活鄰近成骨細(xì)胞中的EGFR通路，并下調(diào)OPG表達(dá)，RANKL和OPG比例增加有利于破骨細(xì)胞的生成，并導(dǎo)致溶骨性骨轉(zhuǎn)移的惡性循環(huán)[11]。CASP3通常被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，其活性增加可促進(jìn)應(yīng)激誘導(dǎo)的癌細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移、侵襲性和腫瘤血管生成[12]。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，通過JAK-STAT3信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖、存活、侵襲和免疫抑制中有重要作用，還可通過炎癥、干細(xì)胞和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位促進(jìn)癌癥發(fā)生[13]。ERBB2可在癌癥干細(xì)胞中選擇性表達(dá)，并且在脛骨中的表達(dá)水平更高，這可能是通過RANKL激活RANK受體介導(dǎo)的[14]。AKT1基因是原癌基因，其相應(yīng)的蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的事件，并在抑制細(xì)胞活力、增殖、分化和凋亡中起重要作用[15]。MMP2/9均為癌相關(guān)性內(nèi)肽酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、侵襲、遷移、血管生成和炎癥的一些關(guān)鍵信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。

通過DAVID數(shù)據(jù)庫富集分析發(fā)現(xiàn)，陰陽雙補(bǔ)方治療骨轉(zhuǎn)移癌的作用機(jī)制主要涉及抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)骨微環(huán)境等多個(gè)環(huán)節(jié)。其中HIF信號(hào)通路是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，當(dāng)局部缺氧和成骨細(xì)胞中缺氧時(shí)HIF-1α可被激活，這對(duì)維持骨骼內(nèi)環(huán)境平衡至關(guān)重要[17]。研究發(fā)現(xiàn)骨祖細(xì)胞位于骨髓中的低氧環(huán)境中，當(dāng)骨祖細(xì)胞中HIF信號(hào)激活可增加趨化因子CXCL12的血液水平，進(jìn)而直接激活CXCR4受體導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖和擴(kuò)散的系統(tǒng)性增加[18]。Rap1信號(hào)傳導(dǎo)涉及不同癌癥細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)，研究顯示Rap1GAP的逆轉(zhuǎn)錄病毒沉默可極大程度增強(qiáng)ERK/MAPK的磷酸化和活化，誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞骨架重組和EMT特征的表達(dá)，并增強(qiáng)乳腺導(dǎo)管原位癌細(xì)胞的侵襲[19]。VEGF可通過結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR1/2影響腫瘤微環(huán)境，其旁分泌機(jī)制大大增加了腫瘤血管的數(shù)量和大小，以提供充足的血液供應(yīng)[20]。研究發(fā)現(xiàn)在各種腫瘤組織中，VEGF通過自分泌作用與分泌VEGF的腫瘤細(xì)胞上的VEGF受體結(jié)合，這種分泌反應(yīng)導(dǎo)致不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，并最終支持腫瘤的生長和增殖[21]。PI3K/Akt通路中相關(guān)蛋白表達(dá)可影響胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力，可能用于預(yù)測患者術(shù)后骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[22]。mTOR是PI3K/Akt通路下游的一個(gè)蛋白，在該通路活化后可增加磷酸化產(chǎn)物水平，進(jìn)而介導(dǎo)下游重要信號(hào)分子，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程，抑制凋亡[23]。

綜上所述，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度分析可發(fā)現(xiàn)，陰陽雙補(bǔ)方主要有效成分如：β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及淫羊藿苷等可通過EGFR、CASP3、STAT3、AKT1、ERBB2及MMP2/9等靶點(diǎn)調(diào)控HIF-1、Rap1、VEGF、PI3K-Akt及mTOR等信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促凋亡及調(diào)節(jié)骨微環(huán)境等作用，這對(duì)未來臨床用藥及本團(tuán)隊(duì)后期基礎(chǔ)研究方向都有一定參考價(jià)值。