川芎嗪對(duì)脂肪干細(xì)胞體外增殖及小鼠顆粒脂肪移植存活的影響

周景和 徐慧芳 祝飛 賈明 李金晟

脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells,ADSC）有較強(qiáng)的增殖能力，且可以分化為多種不同的細(xì)胞系，如脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等。利用ADSC分化的不確定性，臨床可在美容、整形及不同的軟組織缺損疾病中應(yīng)用顆粒脂肪移植方法[1]。然而單純顆粒脂肪移植成活率并不理想。已有研究通過嘗試不同移植物注射方式，或應(yīng)用不同添加成分來提高脂肪移植成活率[2-3]。川芎是一種藥用植物，其主要活性物質(zhì)為生物堿類化合物川芎嗪，具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、溶栓抗凝、抗氧化、改善微循環(huán)等多種藥理作用。臨床上川芎嗪主要被用于治療心腦血管、腎臟、消化系統(tǒng)等的有關(guān)疾病[4]?；诖耍狙芯刻接懘ㄜ亨簩?duì)ADSC體外增殖的影響，及川芎嗪不同添加方式對(duì)顆粒脂肪移植成活的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料 6～8周齡，體重約20 g的BALB/c裸鼠12只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），ADSC（中科院上海細(xì)胞庫(kù)）。主要試劑：過氧化物酶體增殖物激活受 體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）和CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein-α,C/EBP-α）引物由上海生工生物工程有限公司合成；MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、川芎嗪（無(wú)錫市第七制藥有限公司，批號(hào)：310701）、CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、HE染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、油紅O染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）、OCT包埋劑（美國(guó)Tissue-Tek公司）、水性封片劑（美國(guó)Vector Laboratories公司）、5x primeScript RT Master MIX（日本TAKARA公司）、Power SYBR Green PCR Master（美國(guó)Thermo公司）。主要儀器：酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司，Infinite M100 PRO型）、熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司，ViiA7型）、透射電子顯微鏡（日本Joel公司，JEM-1230型）、普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，CKX 31型）、倒置熒光顯微鏡（意大利Optika公司，XDS-3FL4型）。脂肪組織為行腹部或大腿脂肪抽脂術(shù)的患者術(shù)后組織標(biāo)本（經(jīng)患者知情同意）。

1.2 方法

1.2.1 ADSC培養(yǎng) ADSC培養(yǎng)于含有10%FBS、1%雙抗體的MEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.2 ADSC分組及增殖能力檢測(cè) 因透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）具有良好的生物相容性和幾乎無(wú)免疫原性，故使用HA作為移植ADSC的支架材料。將ADSC分組干預(yù)，分別為ADSC組、ADSC-HA組（0.2 ml ADSC+0.2 ml HA）、ADSC-HA+川芎嗪組（0.2 ml ADSC+0.2 ml HA+0.1 mg/ml川芎嗪）。將100 μl細(xì)胞懸液以5×103細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，37℃、5% CO2條件下預(yù)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育，分別于第1、3、5、7天，添加CCK-8溶液（10 μl/孔，加入時(shí)防止產(chǎn)生氣泡），孵育1.5 h后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的光密度（OD值），繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.3 裸鼠皮下顆粒脂肪移植 用0.9%氯化鈉溶液清洗脂肪組織，清除細(xì)胞碎片及血細(xì)胞后，將其轉(zhuǎn)置到5 ml空注射器，加入0.9%氯化鈉注射液后靜置，使其分層，分層后上、中、下層分別為油脂、顆粒脂肪及沖洗液。隨后排出下層的沖洗液，沖洗（3～4次）后使用紗布過濾排除沖洗液和油脂，得到純化后的顆粒脂肪。將裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，顆粒脂肪-HA+PBS組（200 μl PBS+顆粒脂肪+200 μl HA）、顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組（200 μl PBS+顆粒脂肪+200 μl HA+術(shù)后川芎嗪注射）、顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組（200 μl 100 mg/L的川芎嗪+顆粒脂肪+200 μl HA）、顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組（200 μl 100 mg/L的川芎嗪+顆粒脂肪+200 μl HA+術(shù)后川芎嗪注射），各3只。使用1 ml注射器將各組混合物注射到裸鼠左右背部皮下，每點(diǎn)注射0.4 ml。術(shù)后川芎嗪注射是在皮下注射顆粒脂肪后，以2 mg/d的劑量注射川芎嗪，持續(xù)注射7 d。術(shù)后8周處死裸鼠解剖刮取出移植組織。

1.2.4 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織冷凍切片制備 使用4%多聚甲醛固定組織，固定24 h后轉(zhuǎn)置15%的蔗糖溶液中，1 h后將組織樣本轉(zhuǎn)移到30%的蔗糖溶液中過夜。濾紙吸除多余的蔗糖溶液后，用OCT包埋，于4℃冰箱平衡30 min，使氣泡逸出，然后置于-80℃冰箱冷凍1h以上。冷凍組織于-18℃連續(xù)切片，厚度8μm。

1.2.5 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織HE染色觀察 冷凍切片在37℃復(fù)溫30 min，蘇木精液染色30 s，使用流水反復(fù)沖洗之后加入1%的鹽酸溶液用于分色，沖洗后于伊紅液染色中染色60 s。將切片分別依次置于95%乙醇（30 s），95%乙醇（1 min），1∶1的二甲苯：無(wú)水乙醇混合液（3 min），二甲苯Ⅰ（5 min），二甲苯Ⅱ（5 min）對(duì)樣本脫水、透化處理。最后使用中性膠封閉切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織油紅O染色觀察冷凍切片在37℃復(fù)溫30 min，加入75%乙醇孵育10 s后避光情況下于油紅O染液中染色12 min。之后，將樣本置于75%乙醇分化，待背景至無(wú)色之后使用蒸餾水清洗漂洗2 min，然后于蘇木精中復(fù)染30 s。洗滌后，將其置于1%鹽酸溶液中分化3 s，反復(fù)沖洗后使用水性封片劑進(jìn)行封片處理，在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.7 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織脂肪形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。用Trizol試劑提取組織總RNA后，于酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。使用5x prime-Script RT Master MIX先合成第一鏈cDNA，之后以Power SYBR Green PCR Master進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，熱循環(huán)條件為50℃ 3 min，95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析（60～95℃，每10 s增加0.5℃），引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.8 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織HA殘留情況檢測(cè) 各組移植組織PBS洗滌后，于4℃下加入1%鋨酸溶液固定樣本，固定2 h后使用PBS清洗，之后依次在50%、70%、80%、90%乙醇梯度中對(duì)樣本進(jìn)行脫水處理（各梯度靜置15 min），之后置于70%的乙醇中過夜。使用100%乙醇對(duì)樣本再次進(jìn)行脫水處理（20 min/次）。使用丙酮進(jìn)行2次置換（15 min/次），然后依次于2∶1、1∶1和1∶2體積比的丙酮∶包埋劑混合物中分別浸漬1、4及4 h。之后使用純包埋劑再次進(jìn)行2次浸漬處理（每次18 h以上）。然后對(duì)包埋的樣本65℃條件下聚合，持續(xù)48 h。包埋樣本修成表面積＜0.2 mm×0.2 mm的梯形，以70 nm的厚度制備超薄切片。依次于醋酸鈾酰和醋酸鉛中分別染色10 min，沖洗后，于透射電子顯微鏡下觀察組織HA殘留情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組ADSC增殖能力檢測(cè) 培養(yǎng)至第1、3、5天時(shí)，ADSC組、ADSC-HA組、ADSC-HA+川芎嗪組增殖能力比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），第7天時(shí)，ADSC-HA+川芎嗪組增殖能力較ADSC組、ADSCHA組增強(qiáng)（均P＜0.05），而ADSC組、ADSC-HA組增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明川芎嗪可促進(jìn)ADSC體外增殖。各組ADSC增殖曲線見圖1。

圖1 各組ADSC增殖曲線

2.2 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物大體情況比較裸鼠皮下顆粒脂肪移植8周后，各組小鼠的皮膚下都有突起，推測(cè)為脂肪塊；解剖后，可觀察到皮下黃色脂肪組織，見圖2（插頁(yè)）。刮取黃色脂肪組織稱重，與顆粒脂肪-HA+PBS組相比，顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組和顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物重量較重（均P＜0.05）。且顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物重量較顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組、顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組更重（均P＜0.05），而顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組與顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物大體外觀（a：移植8周后各組裸鼠的外觀；b：顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組裸鼠解剖后皮下顆粒脂肪移植物組織）

表2 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物重量比較

2.3 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物組織學(xué)比較 HE和油紅O染色結(jié)果顯示，顆粒脂肪-HA+PBS組移植物結(jié)締組織較多，脂肪組織較少；顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組脂肪細(xì)胞增多，大小不一；顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組結(jié)締組織較多，脂肪細(xì)胞零散分布；顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組脂肪細(xì)胞明顯增多，排列緊密。結(jié)果表明，皮下的黃色組織確實(shí)是脂肪組織。即注射顆粒脂肪可以在裸鼠皮下形成脂肪組織，注射或浸泡川芎嗪對(duì)顆粒脂肪的生長(zhǎng)影響不大，同時(shí)進(jìn)行兩種方式給藥能促進(jìn)脂肪細(xì)胞形成。見圖3（插頁(yè)）。

圖3 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物組織學(xué)染色結(jié)果比較（a：HE染色，×200；b：油紅O染色，×400）

2.4 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表達(dá)水平比較 與顆粒脂肪-HA+PBS組相比，顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組、顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組、顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組裸鼠顆粒脂肪移植組織PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表達(dá)水平均升高（均P＜0.05），且顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組高于顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組、顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表達(dá)水平比較

2.5 顆粒脂肪-HA+PBS組和顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組裸鼠顆粒脂肪移植組織HA殘留情況比較 顆粒脂肪-HA+PBS組和顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組裸鼠顆粒脂肪移植組織切片進(jìn)行透射電子顯微鏡下掃描均未檢測(cè)到HA殘留，即HA已經(jīng)完全降解，見圖5。

圖5 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織HA殘留情況透射電子顯微鏡下觀察所見

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，單純顆粒脂肪移植后只有50%～60%的存活率，移植后高脂肪組織吸收率以及可能的囊腫和鈣化等并發(fā)癥限制了臨床上自體脂肪移植的廣泛應(yīng)用[5]。學(xué)者們?cè)噲D通過調(diào)整脂肪供區(qū)選擇，改進(jìn)脂肪獲取、純化方法以及脂肪注射方式，在移植物中添加不同成分（如血管生長(zhǎng)因子、富血小板血漿、藥物成分等）多種方法來提高移植脂肪的存活率[6-7]。黃偉光等[8]發(fā)現(xiàn)自體顆粒脂肪移植時(shí)添加富血小板血漿能夠極大地提高移植脂肪的存活率，增加隆乳患者胸圍及乳房皮下脂肪厚度，并且顯著減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。隨著對(duì)脂肪移植研究的不斷深入，研究人員就提升脂肪移植物成活率已達(dá)成共識(shí)，即移植早期建立移植物的血管系統(tǒng)是提升脂肪移植物存活的關(guān)鍵。

脂肪組織的血液供應(yīng)豐富，因?yàn)楦骷?xì)胞均具備其單獨(dú)的血供系統(tǒng)且與主干相連，保證了每個(gè)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。顆粒脂肪移植初期，移植物還沒有與受區(qū)建立良好的血液供應(yīng)關(guān)系，因缺乏有效血供而導(dǎo)致移植物處于缺氧缺血狀態(tài)，只能從移植體周圍組織液中獲取營(yíng)養(yǎng)及氧，直至后期形成內(nèi)部血管化并建立自己的血管系統(tǒng)[9]。這提示脂肪組織新生與血運(yùn)重建對(duì)脂肪移植體存活的重要性。

川芎嗪是川芎的主要活性成分，具有抗血小板聚集、擴(kuò)張小動(dòng)脈，活血通脈，改善微循環(huán)的功效[10]。研究證實(shí)，川芎嗪可降低兔心肌梗死再灌注后心肌無(wú)復(fù)流面積和心肌梗死面積[11]，且可通過促進(jìn)血運(yùn)重建減輕心肌缺血再灌注損傷[12]。何莉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠促進(jìn)骨髓移植小鼠骨髓造血細(xì)胞的恢復(fù)，改善骨髓微環(huán)境，促進(jìn)骨髓造血重建。陳方等[14]基于兔股骨頭壞死模型的研究證實(shí)，注射川芎嗪能夠促進(jìn)股骨頭血管的增生和重建。這些發(fā)現(xiàn)提示川芎嗪對(duì)血運(yùn)重建有積極的促進(jìn)作用。在本研究中，川芎嗪處理顯著促進(jìn)了ADSC的體外增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明添加川芎嗪可促進(jìn)注射的顆粒脂肪存活，并在裸鼠皮下形成脂肪組織。組織學(xué)染色結(jié)果中，顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組，脂肪細(xì)胞增多，大小不一；顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組結(jié)締組織較多，脂肪細(xì)胞零散分布；顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組，脂肪細(xì)胞明顯增多，排列緊密。這些結(jié)果提示單純注射或浸泡川芎嗪對(duì)移植脂肪的生長(zhǎng)影響差異不大，同時(shí)進(jìn)行兩種方式給藥更能促進(jìn)脂肪細(xì)胞形成。

作為脂肪形成關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，PPAR-γ和C/EBP-α參與了脂肪形成的級(jí)聯(lián)調(diào)控，并在成脂分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，PPAR-γ作為核受體被脂類激活，誘導(dǎo)脂類相關(guān)基因的表達(dá)[15]。PPAR的α、δ和γ 3種同型在控制脂質(zhì)儲(chǔ)存和動(dòng)員、糖代謝、形態(tài)發(fā)生和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的基因表達(dá)中起綜合作用。對(duì)PPAR-γ的研究發(fā)現(xiàn)，其作為脂肪細(xì)胞主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)脂肪酸在脂肪沉積中存儲(chǔ)，并調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分泌激素的表達(dá)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ在間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[17]。C/EBP-α作為關(guān)鍵的脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪源性干細(xì)胞的成脂分化中發(fā)揮重要作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪促進(jìn)脂肪形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和C/EBP-α的表達(dá)，提示川芎嗪促進(jìn)脂肪形成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞形成。

綜上所述，川芎嗪可促進(jìn)注射的顆粒脂肪存活，并通過促進(jìn)脂肪形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和C/EBP-α的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞形成。單純注射或浸泡川芎嗪兩種方式對(duì)移植脂肪的生長(zhǎng)影響差異不大，同時(shí)進(jìn)行兩種方式給藥干預(yù)更能促進(jìn)脂肪細(xì)胞形成。