兒童狼瘡性腎炎尿液生物標(biāo)志物研究進展

王建敏 毛建華

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）是一種具有多種臨床癥狀的慢性自身免疫性疾病，涉及反復(fù)的慢性炎癥和急性加重。狼瘡性腎炎（lupus nephritis,LN）是SLE主要的也是最嚴重的臨床表現(xiàn)之一。20%左右的SLE在18歲之前確診，相較于成人SLE 40%～50%的LN發(fā)生率，兒童發(fā)生LN的概率高達80%，且常見于初次確診的早期[1]，同時腎衰竭和死亡的風(fēng)險也高于成人。腎活檢的組織學(xué)證據(jù)不僅是診斷LN和確定腎小球、腎小管和間質(zhì)病變程度的金標(biāo)準，而且對治療方案有指導(dǎo)作用。但腎活檢是一項有創(chuàng)操作，有較大的并發(fā)癥風(fēng)險，尤其在兒童中，因此不適合反復(fù)多次進行。因此，臨床上更加依賴侵入性較小的血液或尿液的相關(guān)指標(biāo)來監(jiān)測LN的活動情況及治療效果。目前用于監(jiān)測和評估LN的常規(guī)實驗室指標(biāo)，如24 h尿蛋白定量、尿蛋白/肌酐、ESR、肌酐清除率、抗雙鏈DNA抗體和補體水平，對早期發(fā)現(xiàn)腎損害的靈敏度和特異度均較低。而LN的致病過程可能在腎功能受損和實驗室指標(biāo)檢測到之前就開始了。對于LN的管理，越來越傾向于采用非侵入性生物標(biāo)志物來實現(xiàn)。近年來，有前景的LN尿液生物標(biāo)志物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可有效反映LN的活動性、復(fù)發(fā)傾向及對治療的反應(yīng)。

生物標(biāo)志物是一種生物、生化或分子物質(zhì)，可以通過實驗室技術(shù)定性和定量地檢測到，它與疾病的發(fā)病機制或在不同時間點的活動相關(guān)。因此，生物標(biāo)志物可能具有診斷或監(jiān)測價值，也可能預(yù)測患者對治療或病程的反應(yīng)[2]。對于LN來說，理想的標(biāo)志物應(yīng)當(dāng)具有以下特點：（1）對SLE患者的腎臟受累有高度特異度；（2）能夠建立與腎臟活動或損害的相關(guān)性；（3）可以縱向連續(xù)監(jiān)測LN的疾病狀態(tài)；（4）比常規(guī)臨床或?qū)嶒炇覅?shù)更早地預(yù)測腎損傷，以便及時給予干預(yù)措施；（5）能夠評估預(yù)后和治療反應(yīng)，以便臨床醫(yī)生能夠識別哪些患者可能受益于更積極的治療；（6）對于組織學(xué)分類和腎活檢結(jié)果有提示意義[3-4]。在LN中，尿液越來越被認為是比血液更理想的發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的媒介，因為尿液直接來源于腎臟組織，成分相對穩(wěn)定。相比血液復(fù)雜的蛋白質(zhì)數(shù)量及種類，尿液中僅含有2 000多種蛋白質(zhì)，其中30%來自血液循環(huán)，70%來自泌尿系統(tǒng)本身。這些尿蛋白的改變反映了腎臟的生理和病理變化，所以更有可能產(chǎn)生LN腎臟特異性的生物標(biāo)志物。LN的尿液生物標(biāo)志物在兒童中若能提高早期診斷率、改善疾病監(jiān)測和治療反應(yīng)評估的方法，對于兒童LN的管理及避免難治性兒童LN重復(fù)腎活檢是非常有意義的。許多候選的尿液生物標(biāo)志物，如趨化因子、細胞因子、生長因子和黏附分子等，已經(jīng)被評估為LN潛在的生物標(biāo)志物，在兒童中有所研究。本文就兒童LN尿液生物標(biāo)志物的研究進展作一綜述。

1 尿趨化因子

1.1 單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1） MCP-1是最早被描述的趨化因子之一，也是目前研究最廣泛的尿液生物標(biāo)志物之一，由腎臟中的系膜細胞、內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞和平滑肌細胞產(chǎn)生[5]，它主要通過與CC趨化因子受體2（CC chemokine receptors 2,CCR2）結(jié)合，在炎癥和組織損傷中調(diào)節(jié)炎癥細胞的運輸和集聚[6]。MCP-1在腎臟疾病動物模型和腎臟患者中的作用已被研究和分析，在LN中主要促使炎癥細胞浸潤腎臟，進而導(dǎo)致腎臟炎癥和組織損傷。大量兒童和成人的橫斷面及縱向研究表明，與對照組（非活躍LN和/或健康對照）相比，活躍LN患者的尿MCP-1水平升高。

在兒童LN的一項多中心縱向研究中，Watson等[7]檢查尿MCP-1在64例兒童LN患兒中的水平，發(fā)現(xiàn)MCP-1是活動性腎病的獨立預(yù)測因子，尿MCP-1水平是腎臟疾病隨時間改善極好的預(yù)測因子。在一項觀察性研究中發(fā)現(xiàn)尿MCP-1與蛋白尿呈正相關(guān)，與腎小球濾過呈負相關(guān)，不管疾病活動度和腎臟受累情況如何，SLE患者尿MCP-1水平都明顯高于健康對照組[8]。MCP-1甚至?xí)谀I臟復(fù)發(fā)及活動前2～4個月時顯著升高。這對于早期確定兒童SLE的治療方案和采取進一步措施預(yù)防腎損害有重要意義。最近一些研究表明尿MCP-1聯(lián)合腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子（TWEAK）等與系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎臟疾病活動指數(shù)（renal systemic lupus erythematosus disease activity index,rSLEDAI）及活檢活性指數(shù)（biopsy activity index,BAI）相關(guān)性更好，并建議用于監(jiān)測疾病活動和治療反應(yīng)[9-11]。所以建議在兒童LN中可常規(guī)檢測尿MCP-1，用于監(jiān)測腎臟的疾病活動和治療反應(yīng)，并且可以進一步研究基于抑制尿MCP-1表達的藥物，從而為兒童LN的治療開辟新的思路。

1.2 IFN-γ誘導(dǎo)蛋白 10（C-X-C motif chemokine 10,CXCL10） CXCL10是CXC趨化因子家族的一部分，該家族的趨化因子具有促炎特性，它是一個10 kDa的蛋白，被歸類為Th1趨化因子，在IFN的刺激下，由浸潤的單核細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞分泌，然后與受體CXCR3（主要在T淋巴細胞上表達）結(jié)合來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，與非活動期SLE患者和健康對照組相比，活動期LN患者的尿液CXCL10顯著升高，并且與SLE疾病活動度指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI）和臨床醫(yī)師對疾病活動度的整體評估有良好的相關(guān)性[13]。一項橫斷面研究顯示，尿CXCL10水平在LN患者中明顯高于無LN的SLE患者，使用LN（有或無）和CXCL10（陰性或陽性，最佳截斷值為0.93 pg/ml）作為二分類變量，CXCL10被發(fā)現(xiàn)是LN的高靈敏度（100%）和高特異度（98%）的有效預(yù)測因子，可以證實在LN患者中CXCL10與24 h尿蛋白、SLEDAI、腎活檢分級等呈正相關(guān)[14]。然而在一項在兒童患兒中的研究發(fā)現(xiàn)，尿CXCL10在活動性LN、非LN患兒和對照組之間沒有差異，這體現(xiàn)了成人LN和兒童LN的異質(zhì)性[15]。

2 尿細胞因子

2.1 腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子（tumour necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）TWEAK是TNF超家族配體中的一員，是一種多功能細胞因子，可與其受體成纖維細胞生長因子誘導(dǎo)14蛋白（fibroblast growth factor-inducible 14,Fn14）結(jié)合，介導(dǎo)多種生物活性，包括激活細胞生長、遷移或死亡，誘導(dǎo)血管炎和血管生成，以及促進成纖維反應(yīng)。TWEAK在許多組織中普遍表達，在腎臟中，F(xiàn)n14由腎固有細胞（包括足細胞、系膜細胞、腎小球內(nèi)皮細胞和腎小管細胞）表達。正常情況下，F(xiàn)n14在健康腎臟組織中普遍低表達或缺失，但在組織損傷、自身免疫及炎癥時被迅速誘導(dǎo)，不受調(diào)控而過度激活，同時TWEAK水平相應(yīng)升高[16]。在這種情況下，就可能會導(dǎo)致腎臟的進行性損傷和惡化。

因此，該細胞因子的尿液測定作為LN的生物標(biāo)志物是非常有意義的。研究顯示活動期LN患者的尿TWEAK水平明顯高于沒有或非活動期腎病和正常健康受試者[17]。當(dāng)聯(lián)合尿MCP-1時，在評價預(yù)后不良的腎損害時比其他參數(shù)（a1-微球蛋白、β2-微球蛋白、肌酐等）具有更好的鑒別能力，因此很適合作為一種篩查工具。在沒有病理結(jié)果的情況下，以腎活檢為中心，聯(lián)合尿MCP-1和TWEAK，可快速鑒別嚴重LN患者，對腎損害進行更全面的評估[9]。鑒于TWEAK/Fn14的激活在LN發(fā)病機制中的重要作用，阻斷TWEAK/Fn14軸對于LN的預(yù)后或許有很大改善。研究指出，F(xiàn)n14敲除的雌性MRL/lpr小鼠的蛋白尿水平顯著低于野生型雌性MRL/lpr小鼠，并且Fn14基因敲除小鼠的蛋白尿及腎組織病理學(xué)有顯著改善，且伴有腎小球和小管間質(zhì)炎癥的減弱[18]。筆者認為隨著更多大樣本、多中心的研究深入，臨床對于TWEAK在LN的作用會越來越清晰，抑制TWEAK/Fn14途徑也會成為LN治療的一個有吸引力的靶點。

2.2 骨保護素（osteoprotegerin,OPG） OPG是一種來自TNF受體超家族的可溶性蛋白，因其最具特征的作用是通過減少破骨細胞的生成來調(diào)節(jié)骨吸收，故而得名。人OPG基因位于染色體8q上，由5個外顯子組成，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)OPG在腎臟中有表達，包括腎臟樣本、培養(yǎng)的腎小管細胞和尿外泌體樣囊泡[19]。

研究表明，尿OPG水平升高與rSLEDAI之間存在關(guān)聯(lián)，當(dāng)OPG同時與TWEAK、MCP-1和IL-8評估LN活動時，有更合理的靈敏度、特異度和預(yù)測價值[20]。另外在縱向研究中還發(fā)現(xiàn)，盡管尿OPG和血OPG在治療隨訪中顯著下降，但血OPG的下降趨勢穩(wěn)定性低于尿OPG，與抗雙鏈DNA抗體、補體3、補體4和血OPG相比，尿液OPG在區(qū)分活動性LN患者方面有表現(xiàn)更好的AUC[21]。綜上，尿OPG檢測可能對預(yù)測LN治療的不良反應(yīng)和復(fù)發(fā)有價值，期待在兒童LN中有更多的研究，以進一步驗證其價值。

2.3 轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β） TGF-β是一種具有廣泛生理活性的二聚肽，在形態(tài)發(fā)生功能、免疫系統(tǒng)及組織重塑的調(diào)節(jié)和傷口的修復(fù)中發(fā)揮重要作用[22]。在炎癥發(fā)生時，TGF-β主要在腎小球和腎間質(zhì)中表達，刺激常駐間質(zhì)細胞和募集血管周細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)變，以進一步刺激細胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致組織瘢痕化，最終導(dǎo)致慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）[23]。

在兒童患兒中，已觀察到活動性LN患兒尿TGF-β水平顯著升高，并與抗雙鏈DNA滴度呈正相關(guān)。近期在一項對87例兒童和青壯年的LN患者（平均年齡15.6歲）連續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，對于治療有反應(yīng)的LN患者尿TGF-β顯著低于無反應(yīng)者[24]。另有研究發(fā)現(xiàn)無論是輕度LN還是嚴重LN，患者的尿TGF-β水平均高于正常對照組，提示尿TGF-β水平對LN有診斷意義，當(dāng)聯(lián)合尿中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）則有更高的靈敏度和特異度[25]。最近一項研究使用一種新穎的、定量平面蛋白微陣列技術(shù)對SLE患者的尿液進行了1 000個蛋白質(zhì)的檢測，發(fā)現(xiàn)尿TGF-β與疾病活動度高度相關(guān)，建議尿TGF-β可作為追蹤LN疾病活動的潛在生物標(biāo)志物[26]。無論如何，尿TGF-β在診斷LN和監(jiān)測LN活動上都體現(xiàn)了其價值，期待更多大型的獨立隊列研究來證實其在兒童LN中的價值。

3 NGAL

NGAL是一種25 kDa的分子，最早在中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)，在腎臟中呈結(jié)構(gòu)性低表達，在炎癥、缺血和感染等腎損傷時表達上調(diào)，NGAL已經(jīng)在LN中被廣泛研究。在一個獨立的兒科隊列研究[27]中，納入了33例兒童SLE患兒（22例LN，11例非LN）與15例健康對照者，發(fā)現(xiàn)LN患兒尿NGAL水平高于非LN患兒及健康組，尿NGAL水平與rSLEDAI評分相關(guān)，并可預(yù)測Ⅲ型和Ⅳ型LN（靈敏度0.91，特異度0.70），提示尿NGAL是兒童增殖性（即Ⅲ型和Ⅳ型）LN的敏感標(biāo)志物。當(dāng)NGAL聯(lián)合尿TGF-β時，其LN的診斷有較高的靈敏度和特異度[25]。另外一項多中心研究顯示，尿NGAL在區(qū)分LN完全緩解、部分緩解和無緩解方面均優(yōu)于血肌酐、尿蛋白、GFR等常規(guī)生物標(biāo)志物[28]。更值得關(guān)注的是，研究顯示尿NGAL水平在腎臟活動早期（3～6個月）就開始升高，這大大增加了NGAL作為LN早期生物標(biāo)志物的可能性[29]。

4 血管細胞黏附分子

4.1 血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1） VCAM-1是一種90 kDa的糖蛋白細胞黏附分子，有助于調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的血管黏附以及巨噬細胞、T細胞等白細胞的跨內(nèi)皮轉(zhuǎn)移。VCAM-1在正常兒童的腎小管上皮和腎小球內(nèi)皮細胞中表達較差，但在增生性LN存在時表達增加，與疾病活動相關(guān)[30]。一項納入了227例SLE患者的研究顯示，80例活動性LN患者尿VCAM-1顯著高于非LN患者和對照組，并且與SLEDAI評分、rSLEDAI評分以及尿蛋白/肌酐比值顯著相關(guān)[31]。另一項研究顯示尿VCAM-1/肌酐比值在活動性或低活動性LN患者中高于非活動性LN患者，當(dāng)尿VCAM-1/肌酐比值基線為75百分位及以上的患者，在10年隨訪期間，腎小球濾過率惡化≥25%的風(fēng)險增加了23倍，而包括抗雙鏈DNA抗體在內(nèi)的傳統(tǒng)標(biāo)志物無法預(yù)測這一結(jié)果[32]。因此，尿VCAM-1水平高可能表明患者長期腎功能喪失的風(fēng)險增加。因此，該黏附分子的尿液測定對于LN的長期預(yù)后監(jiān)測有很大意義。期待VCAM-1在兒童LN中有更深入的研究。

4.2 血管抑制素 血管抑制素為纖溶酶原N端片段，是一種抗腫瘤分子，通過減少內(nèi)皮細胞增殖和中性粒細胞的激活和遷移，抑制炎癥和血管生成[31-33]。尿血管抑制素水平在活動期SLE患者中升高，已被用于確定疾病活動度的一個指標(biāo)，另外，血管抑制素水平也有助于區(qū)分LN活動的SLE患者和非LN活動的SLE患者，與傳統(tǒng)的LN生物標(biāo)志物相比，其有更高的特異度和靈敏度[31-33]。在一項研究中報道，高尿血管抑制素水平與SLEDAI、rSLEDAI和SLE國際合作臨床損傷指數(shù)腎臟活動評分呈正相關(guān)，其特異度、靈敏度顯著高于蛋白尿/肌酐比值[33]。在腎活檢時分析發(fā)現(xiàn)，血管抑制素在正常組織中無表達，在Ⅱ級LN患者中低表達，在IV級LN患者水平最高。另一個發(fā)現(xiàn)是血清血管抑制素與任何疾病評分或尿血管抑制素水平無關(guān)，表明該分子具有腎臟局部生成的特性。一項近期的研究評估了尿血管抑制素、VCAM-1和CXCL4在SLE患者中的水平，發(fā)現(xiàn)與血清抗雙鏈DNA及補體3相比，尿血管抑制素在鑒別活動性腎性SLE和活動性非腎性SLE時有更高的靈敏度、特異度[31]。綜上，血管抑制素有可能作為SLE腎損傷的特異性標(biāo)志物，需要進一步在兒童LN中研究以確定其效用。

5 其他尿液生物標(biāo)志物

目前，全世界范圍內(nèi)都在積極尋找LN潛在的生物標(biāo)志物[26,34-36]，如細胞因子IL-2、IL-23、IL-38[37]，蛋白質(zhì)N-乙酰-b-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-b-D-glucosaminidase,NAG）、a1-抗胰凝乳蛋白酶[38]、腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）[29]、高遷移率族框1 蛋白（high-mobility group box 1 proteins,HMGB1）[39]、轉(zhuǎn)鐵蛋白及銅藍蛋白[40]、觸珠蛋白（haptoglobin,HAP）及α-1抗胰凝乳蛋白酶[41]、尿促血栓、抗血栓和纖溶分子[42]、尿mRNA[43]等均有研究。但是目前尚缺乏在大型隊列研究數(shù)據(jù)。

6 小結(jié)和展望

幾十年來，在LN中已經(jīng)研究了大量的尿液生物標(biāo)志物，并進行了大量的驗證，而且有新的生物標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)，但由于各項研究的異質(zhì)性，包括評估方法、檢測方法、使用工具的差異等，目前仍然沒有一種生物標(biāo)志物能很好地適應(yīng)臨床的需要。越來越明顯的是，沒有哪一種單獨的生物標(biāo)志物在評估LN的活動性及慢性程度或者預(yù)測LN的發(fā)生上能體現(xiàn)最佳的特異度和靈敏度，所以需要開發(fā)多種生物標(biāo)志物來聯(lián)合監(jiān)測LN患者。已有一些這方面的努力，如狼瘡腎臟活性指數(shù)（renal activity index for lupus,RAIL）項目[44]。目前的LN尿液生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)多是來自于成人隊列，由于兒童LN更差的預(yù)后，更高的CKD發(fā)生率，所以比成人更迫切需要合適的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，能夠準確及時監(jiān)測兒童LN的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。目前LN生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及研究已經(jīng)進入“組學(xué)時代”[36]，展望未來，重要的是在兒童和成人LN縱向合作研究中進一步驗證已經(jīng)確定的有希望的尿液生物標(biāo)志物。對于LN的臨床試驗設(shè)計也應(yīng)進一步改進和均質(zhì)化，以便能夠比較不同研究之間的結(jié)果，從而能夠盡快將這些發(fā)現(xiàn)向臨床轉(zhuǎn)化。相信會有越來越多有前景的LN尿液生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，并能夠與常用的血清和組織生物標(biāo)志物結(jié)合，來指導(dǎo)兒童LN的治療及管理。