基于生物信息學(xué)分析E74樣轉(zhuǎn)錄因子3在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)及作用機(jī)制

崔涵 張春雷 劉文珍

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。卵巢癌患者手術(shù)治療后易復(fù)發(fā)且生存率較低[1]，臨床缺乏高靈敏度、高特異度的卵巢癌生物標(biāo)志物[2]。卵巢漿液性囊腺癌是卵巢癌最常見的病理類型，其病因尚未完全明確，治療方案也有待臨床進(jìn)一步探索[3]。E74樣轉(zhuǎn)錄因子3（E74-like transcription factor 3,ELF3）是上皮特異性轉(zhuǎn)錄因子之一，其遺傳改變和表達(dá)失調(diào)與多種上皮癌的進(jìn)展有關(guān)[4]。目前，ELF3在卵巢漿液性囊腺癌中的研究報(bào)道少見。基于此，本研究采用生物信息學(xué)分析癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中的卵巢漿液性囊腺癌樣本數(shù)據(jù)，并將結(jié)果在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus,GEO）中進(jìn)行驗(yàn)證，探討ELF3在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)情況，并分析其對(duì)卵巢漿液性囊腺癌診斷、預(yù)后評(píng)估的臨床價(jià)值及可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)和樣本來源 提取TCGA中2006至2021年內(nèi)收錄的且具有臨床信息數(shù)據(jù)的379例卵巢漿液性囊腺癌組織樣本和88例正常卵巢組織樣本的臨床信息和ELF3表達(dá)數(shù)據(jù)，選取TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后進(jìn)行樣本間的表達(dá)比較。獲取GEO的GSE38666數(shù)據(jù)集中12例患者正常卵巢上皮細(xì)胞及18例患者卵巢漿液性囊腺癌上皮細(xì)胞的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行ELF3 mRNA表達(dá)水平驗(yàn)證，利用RMA方法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。免疫組化結(jié)果來源于人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫（The Human Protein Atlas,HPA）。本研究所用數(shù)據(jù)均為公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，符合醫(yī)學(xué)倫理。

1.2 生物信息學(xué)分析 采用R 3.6.3軟件對(duì)TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫中組織樣本及細(xì)胞測(cè)序結(jié)果中基因表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與可視化，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA），探索可能的作用機(jī)制。GSEA分析中，顯著富集的閾值為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate,FDR）＜0.25且P＜0.05。

1.3 臨床信息分組 卵巢漿液性囊腺癌患者根據(jù)年齡分為≤60歲和＞60歲；根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)（International Federation of Obstetrics and Gynecology,FIGO）等級(jí)分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)；根據(jù)初始治療效果分為疾病進(jìn)展（progressive disease,PD）、疾病穩(wěn)定（stable disease,SD）、部分緩解（partial response,PR）、完全緩解（complete response,CR）；根據(jù)種族分為亞裔、非洲裔和白人；根據(jù)組織學(xué)分級(jí)分為G1～4，分別為高分化、中分化、低分化及未分化；根據(jù)腫瘤發(fā)生部位分為雙側(cè)、單側(cè)；根據(jù)血管侵犯情況分為否和是，根據(jù)淋巴結(jié)侵犯情況分為否和是，根據(jù)腫瘤殘留情況分為否和是；根據(jù)ELF3 mRNA中位表達(dá)水平，分為ELF3 mRNA高表達(dá)、低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R 3.6.3統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；采用ROC曲線評(píng)估ELF3 mRNA表達(dá)水平對(duì)卵巢漿液性囊腺癌的診斷價(jià)值；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢漿液性囊腺癌患者臨床資料 納入本研究的卵巢漿液性囊腺癌患者樣本共379例，年齡51～68歲，中位年齡59歲，其中≤60歲208例（54.9%），＞60歲171例（45.1%）；FIGO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)分別1例（0.3%）、23例（6.1%）、295例（77.8%）、57例（15.0%），3例（0.8%）不詳；初始治療效果PD、SD、PR、CR分別27例（7.1%）、22例（5.8%）、43例（11.3%）、216例（60.1%）例，71例（18.7%）不詳；亞裔、非洲裔和白人分別12例（3.2%）、25例（6.6%）、328例（86.5%），14例（3.7%）不詳；組織學(xué)分級(jí)G1、G2、G3、G4分別 1例（0.3%）、45例（11.9%）、322例（85.0%）、1例（0.3%），10例（2.5%）不詳；腫瘤發(fā)生部位單側(cè)、雙側(cè)分別102例（26.9%）、255例（67.3%），22例（5.8%）不詳；血管侵犯否和是分別41例（10.8%）、64例（16.9%），274例（72.3%）不詳；淋巴結(jié)侵犯否和是分別48例（12.7%）、101例（26.6%），230例（60.7%）不詳；腫瘤殘留否和是分別67例（17.7%）、268例（70.7%），44例（11.6%）不詳；總生存（overall survival,OS）例數(shù)和死亡例數(shù)分別147例（38.8%）、232例（61.2%）；疾病特異性生存（disease free survival,DSS）例數(shù)和非卵巢癌因素死亡例數(shù)分別154例（40.6%）、200例（52.8%），25例（6.6%）例不詳。

2.2 卵巢漿液性囊腺癌組織與正常卵巢組織、卵巢漿液性囊腺癌上皮細(xì)胞與正常卵巢上皮細(xì)胞ELF3表達(dá)情況比較 卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達(dá)水平高于正常卵巢組織（P＜0.05），見圖1a（插頁）。卵巢漿液性囊腺癌上皮細(xì)胞ELF3 mRNA表達(dá)水平高于正常卵巢上皮細(xì)胞（P＜0.05），見圖1b（插頁）。卵巢漿液性囊腺癌組織中ELF3蛋白表達(dá)陽性，正常卵巢組織中表達(dá)陰性，見圖1c、d（插頁）。

圖1 卵巢漿液性囊腺癌組織與正常卵巢組織、卵巢漿液性囊腺癌上皮細(xì)胞與正常卵巢上皮細(xì)胞ELF3表達(dá)情況比較（a：卵巢漿液性囊腺癌組織與正常卵巢組織ELF3 mRNA表達(dá)水平比較；b：卵巢漿液性囊腺癌上皮細(xì)胞與正常卵巢上皮細(xì)胞ELF3 mRNA表達(dá)水平比較；c：卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3蛋白表達(dá)陽性，免疫組化染色，×40；d：正常卵巢組織ELF3蛋白表達(dá)陰性，HE染色，×40）

2.3 不同臨床病理特征患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達(dá)水平比較 不同F(xiàn)IGO等級(jí)、初始治療效果、種族、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤發(fā)生部位、血管侵犯、腫瘤殘留的患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），年齡＞60歲的患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達(dá)水平低于年齡≤60歲的患者（P＜0.05），見圖2。

圖2 不同臨床病理特征患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達(dá)水平比較（a：不同F(xiàn)IGO級(jí)別；b：不同病理分級(jí)；c：不同人種；d：不同年齡；e：是否侵犯淋巴結(jié)；f：是否侵犯血管；g：是否腫瘤殘留；h：不同腫瘤發(fā)生部位；i：不同初始治療效果）

2.4 ELF3 mRNA表達(dá)水平對(duì)卵巢漿液性囊腺癌的診斷價(jià)值分析 ELF3 mRNA表達(dá)水平診斷卵巢漿液性囊腺癌的ROC曲線顯示AUC為0.988，最佳截?cái)嘀禐?.450，靈敏度為0.988，特異度為0.977，見圖3。

圖3 ELF3 mRNA表達(dá)水平診斷卵巢漿液性囊腺癌的ROC曲線

2.5 ELF3 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者預(yù)后比較ELF3 mRNA低表達(dá)患者OS和DSS均優(yōu)于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 ELF3 mRNA高表達(dá)與低表達(dá)患者總生存曲線和疾病特異性生存曲線比較（a：總生存曲線；b：疾病特異性生存曲線）

2.6 ELF3在卵巢漿液性囊腺癌中可能參與的信號(hào)通路 GSEA富集分析結(jié)果顯示，ELF3 mRNA表達(dá)相關(guān)的基因可能參與G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors,GPCR）與配體結(jié)合（標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)=-1.420，F(xiàn)DR=0.023，P＜0.05）和神經(jīng)元系統(tǒng)（標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)=-1.463，F(xiàn)DR=0.023，P＜0.05）兩條信號(hào)通路。

3 討論

ELF3的表達(dá)情況在多種腫瘤疾病中可作為預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。例如，ELF3高表達(dá)與結(jié)腸癌的不良預(yù)后有關(guān)[5]，其mRNA是人表皮生長(zhǎng)因子受體2陽性乳腺癌的不良預(yù)后的指標(biāo)，并且作為癌基因發(fā)揮作用[6]，上皮細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子1（epithelial cell-specific transcription factor 1,ESE1）/ELF3和NF-κB的一致上調(diào)也預(yù)示著前列腺癌患者的不良預(yù)后[7]。同時(shí)，ELF3也參與調(diào)控多種腫瘤疾病的進(jìn)程。在非小細(xì)胞肺癌中，過表達(dá)的ELF3通過PI3K/Akt和ERK信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]；在結(jié)腸癌中，ELF3激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)疾病進(jìn)展[3]；在膽道癌中，ELF3直接抑制E盒結(jié)合鋅指蛋白2并上調(diào)扣帶蛋白的表達(dá)，ELF3的丟失導(dǎo)致細(xì)胞間連接減少和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，花生四烯酸5-脂氧合酶和CXC趨化因子配體16也是ELF3的直接靶標(biāo)，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[9]；Yachida等[10]對(duì)60例壺腹癌組織進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序和DNA拷貝數(shù)分析，并進(jìn)行了靶向測(cè)序，結(jié)果表明ELF3是壺腹癌的驅(qū)動(dòng)因素；ESE1/ELF3與NF-κB亞基p65和p50相互作用，通過增強(qiáng)其核易位和轉(zhuǎn)錄活性以及誘導(dǎo)p50轉(zhuǎn)錄而驅(qū)動(dòng)前列腺癌的進(jìn)展[7]。說明ELF3是腫瘤疾病進(jìn)程調(diào)節(jié)的重要因素，同時(shí)也是診斷和預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。但ELF3在卵巢癌中的研究較為缺乏，基于以上原因，本研究對(duì)其在卵巢漿液性囊腺癌中的診斷、預(yù)后評(píng)估價(jià)值及可能參與的作用機(jī)制進(jìn)行了探索。

本研究結(jié)果顯示，ELF3 mRNA在卵巢漿液性囊腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織，說明ELF3 mRNA具有作為診斷卵巢漿液性囊腺癌的分子標(biāo)志物的潛能，ROC曲線顯示AUC為0.988，說明ELF3可以很好的區(qū)分腫瘤組織與正常組織，有望成為卵巢癌的生物標(biāo)志物。分析患者臨床病理特征與ELF3 mRNA表達(dá)水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)年齡＞60歲的患者卵巢漿液性囊腺癌組織ELF3 mRNA表達(dá)水平低于年齡≤60歲的患者，這說明ELF3 mRNA高表達(dá)在年輕患者患病因素中可能更加重要。另外，ELF3 mRNA高表達(dá)患者較低表達(dá)患者預(yù)后差。

ELF3蛋白在卵巢漿液性囊腺癌組織中高表達(dá)，說明其可能參與該疾病的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)此，本研究GSEA富集分析卵巢漿液性囊腺癌組織中ELF3表達(dá)相關(guān)的基因，結(jié)果顯示ELF3可能參與GPCR配體結(jié)合和神經(jīng)元系統(tǒng)兩條信號(hào)通路，其中GPCR可以感應(yīng)細(xì)胞外的分子并激活內(nèi)部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終激活細(xì)胞反應(yīng)。已有多項(xiàng)研究表明GPCR參與的信號(hào)通路參與癌癥的疾病進(jìn)程[11-13]，尤其是在卵巢癌中，GPCR通過鈣離子信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。那么ELF3是如何參與GPCR信號(hào)通路，在這個(gè)過程中GPCR又是通過何種途徑促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展，值得臨床進(jìn)一步探討。結(jié)合并激活GPCR配體包括光敏化合物、氣味、信息素、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等[15]，而ELF3相關(guān)基因也參與神經(jīng)元系統(tǒng)信號(hào)通路。在卵巢漿液性囊腺癌中是否通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元系統(tǒng)來調(diào)控GPCR信號(hào)通路也值得臨床進(jìn)一步探討。

綜上所述，ELF3 mRNA表達(dá)水平在卵巢漿液性囊腺癌中具有較高的診斷、預(yù)后評(píng)估價(jià)值，高表達(dá)患者預(yù)后較差，并可能通過GPCR配體結(jié)合和神經(jīng)元系統(tǒng)兩條信號(hào)通路發(fā)揮作用。