原代大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)方法改進(jìn)及其生物學(xué)特性研究

李中軒，石宇杰，李俊峽，陳韻岱

血管內(nèi)皮是由單層鱗狀上皮細(xì)胞組成，最初認(rèn)為血管內(nèi)皮只維持血管內(nèi)外水和電解質(zhì)平衡。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮除了有機(jī)械屏障功能外，還參與凝血和抗凝，防止出血和血栓形成，在生理狀態(tài)下，通過(guò)各種抗血小板聚集及抗凝機(jī)制維持促凝和抗凝平衡。擁有感受器和效應(yīng)器功能，通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞表面受體接受各類分子信號(hào)激動(dòng)（蛋白質(zhì)，細(xì)胞因子和激素等），接受并傳遞信號(hào)啟動(dòng)下一步病理生理活動(dòng)[1]。血管內(nèi)皮還是一個(gè)有內(nèi)分泌功能的器官。通過(guò)釋放血管收縮因子，包括血管緊張素，前列腺素，內(nèi)皮素以及舒張因子，一氧化氮，環(huán)氧花生烯酸，調(diào)節(jié)血管緊張度[2,3]。然而，當(dāng)血管內(nèi)皮受損，功能障礙時(shí)，會(huì)導(dǎo)致各種類型的心血管疾病，如高血壓，糖尿病，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟?。ü谛牟。?，外周血管疾病及慢性腎臟疾病[4-8]。因此，恢復(fù)管壁完整性對(duì)于減少心血管疾病患病率和死亡率至關(guān)重要。

目前，內(nèi)皮細(xì)胞作為終末細(xì)胞，增殖分化能力低，很難及時(shí)修復(fù)受損管壁，因此，EPCs作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞可以直接參與到修復(fù)損傷血管內(nèi)皮或分化為內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)管壁[9]，是恢復(fù)管壁完整性的最好選擇之一。生理狀態(tài)下，EPCs含量很低，在心血管疾病患者循環(huán)中含量更低[10]。因此未來(lái)移植EPCs促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)成為可能方法之一。如何提高內(nèi)皮祖細(xì)胞純度是目前重點(diǎn)關(guān)注的焦點(diǎn)。自1997年Asahara首次從外周血中分離出CD34+和VEGFR2+的EPCs以來(lái)[11]，各種方法被用于分離，培養(yǎng)EPCs。盡管越來(lái)越多不同組織來(lái)源的EPCs被成功分離培養(yǎng)，但骨髓來(lái)源EPCs仍是最主要和最重要的來(lái)源[12]，與此同時(shí)EPCs不同于其他種類細(xì)胞，目前仍無(wú)法僅憑借表面標(biāo)志物確定所培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs，需要結(jié)合功能檢測(cè)，多方面確定所培養(yǎng)細(xì)胞就是EPCs。本研究通過(guò)分離大鼠骨髓來(lái)源EPCs，在培養(yǎng)中不斷通過(guò)EPCs集落挑選純化，改進(jìn)EPCs培養(yǎng)方式與步驟，提高EPCs純度，同時(shí)結(jié)合觀察EPCs的形態(tài)學(xué)特征，吞噬和攝取功能檢測(cè)，免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)鑒定EPCs表面標(biāo)志物，遷移實(shí)驗(yàn)和成管實(shí)驗(yàn)多方面，多角度鑒定EPCs，提出一種新的大鼠骨髓來(lái)源EPCs的分離培養(yǎng)純化鑒定方法，為今后移植EPCs治療心血管疾病提供細(xì)胞保障。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備EGM-2培養(yǎng)基（Lonza，美國(guó)）。histopaque-1083（Sigma-Aldrich，美國(guó)）。Fibronectin（R&D，美國(guó)）。胎牛血清（FBS，Gibco，美國(guó)）。DilacLDL（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）。FITC-UEA-I（Sigma-Aldrich，美國(guó)）。von Willebrand Factor（vWF，Abcam，美國(guó)）。vascular endothelial cadherin（VE-cadherin，Santa Cruz，美國(guó)）。Alexa Fluor 647-VEGFR2（Cell Signaling Technology，美國(guó)）。PE-CD34（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）。0.22 μm Filter Unit（Millipore，美國(guó)）。結(jié)晶紫（Beyotime，中國(guó)）?；|(zhì)膠（Corning，美國(guó)）。Cell counting kit-8（CCK-8，Dojindo Molecular Technologies，日本）。24-well Transwell chamber（Corning，美國(guó)）。酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）。熒光倒置顯微鏡（Nikon，日本）。激光掃面共聚焦顯微鏡（Leica Microsystems，德國(guó)）。流式細(xì)胞檢測(cè)儀（BD Biosciences，美國(guó)）。

1.3 大鼠骨髓來(lái)源EPCs的分離與培養(yǎng)將大鼠麻醉處死后，放入75%酒精中浸泡30 min，取大鼠股骨和脛骨，用注射器吸取EGM-2培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，直至將骨髓全部吹出。將細(xì)胞懸液用0.22 μm Filter Unit過(guò)濾，把碎骨塊及大細(xì)胞團(tuán)濾掉，用EGM-2培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞，按1:1比例將histopaque-1083與細(xì)胞懸液先后加入離心管中，此過(guò)程注意保持液面交界清晰。離心管放入離心機(jī)經(jīng)1400 rpm離心30 min后，小心取出離心管，整個(gè)過(guò)程輕柔保持離心管無(wú)晃動(dòng)。觀察離心管，發(fā)現(xiàn)此時(shí)離心管內(nèi)液體分為4層，小心并盡量收集云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層。將通過(guò)密度梯度離心法得到的骨髓單個(gè)核細(xì)胞再次用EGM-2培養(yǎng)基，1000 rpm離心10 min，清洗兩遍。最后把細(xì)胞懸液接種到Fibronectin包被的培養(yǎng)皿上，放入含5%CO2，95%濕度，37℃溫箱中孵育。12 h進(jìn)行第一次換液，將培養(yǎng)基緩慢吸除，整個(gè)過(guò)程動(dòng)作緩慢輕柔，盡量避免使貼壁不牢固EPCs脫壁，造成細(xì)胞數(shù)量損失。從第二次換液開始，每24 h換液一次，換液過(guò)程中用EGM-2培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，使未貼壁細(xì)胞被完全去除，在倒置顯微鏡下將非EPCs集落細(xì)胞刮去除，提高EPCs細(xì)胞純度。

1.4 EPCs吞噬功能檢測(cè)將通過(guò)集落挑選純化的原代EPCs用含5%FBS的EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整密度至1×105個(gè)/ml。每孔1 ml接種于24孔板，制作爬片。每24 h進(jìn)行一次換液，觀察細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將Dil-acLDL用EGM-2培養(yǎng)基稀釋至10 μg/ml，將FITC-UEA-I稀釋至20 μg/ml。去除24孔板內(nèi)原培養(yǎng)基，將Dil-acLDL與FITC-UEA-I加入孔板中，放入含5%CO2，95%濕度，37℃溫箱中避光孵育4 h。用預(yù)冷PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛4℃固定1 h。再用PBS浸洗爬片共3遍，每次10 min。用封片劑進(jìn)行封片。在激光掃面共聚焦顯微鏡下觀察Dil-acLDL與FITC-UEA-I熒光雙染細(xì)胞數(shù)量，任選3個(gè)視野，計(jì)算平均數(shù)。

1.5 免疫熒光鑒定由于EPCs表面會(huì)表達(dá)一些內(nèi)皮細(xì)胞特性的標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)vWF及VE-cadherin的表達(dá)情況[13]。將通過(guò)集落挑選純化的原代EPCs用EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整密度至1×105個(gè)/ml，接種于24孔板中制作爬片，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用PBS浸洗3遍，每次10 min，用4%多聚甲醛4℃固定1 h。分別用加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS浸洗3遍后，加入含二抗的抗體稀釋液室溫孵育1 h。PBS浸洗后用封片劑封片，在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞，每張爬片計(jì)數(shù)3個(gè)視野，計(jì)算其平均數(shù)。

1.6 EPCs流式細(xì)胞鑒定將通過(guò)集落挑選純化后，不同純化階段的原代EPCs，用0.25%胰蛋白酶消化收集，流式緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液加入流式管中。再將PECD34、Alexa Fluor 647-VEGFR2加入流式管中，4℃避光孵育1 h。用預(yù)冷PBS洗滌3遍，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+和VEGFR2+細(xì)胞比例。

1.7 EPCs生長(zhǎng)曲線、增殖及活力檢測(cè)將通過(guò)集落挑選純化的原代EPCs，用含5%FBS的EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整密度至2×104、4×104、6×104、8×104、1×105個(gè)/ml，每12 h檢測(cè)一次，連續(xù)檢測(cè)72 h。將100 μl細(xì)胞懸液按相應(yīng)分組加入96孔板中，每組設(shè)3復(fù)孔，在5%CO2，95%濕度，37℃溫箱中避光孵育0～72 h。通過(guò)CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定及增殖能力檢測(cè)。EPCs培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs活力，與CCK-8檢測(cè)相同，細(xì)胞培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間后，每孔加入10 μl MTT溶液，溫箱中繼續(xù)孵育4 h，去除上清后，加入150 μl DMSO，于570 nm處檢測(cè)OD值。

1.8 純化的EPCs遷移能力檢測(cè)通過(guò)24-well Transwell chamber檢測(cè)集落挑選純化后的原代EPCs遷移能力。首先分別在上室和下室中加入100 μl和600 μl EGM-2培養(yǎng)基于溫箱中平衡1 h，將EPCs用無(wú)FBS的EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整密度至1×105個(gè)/ml。將平衡后的小室取出后去除培養(yǎng)基，在上室中加入100 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含10%FBS的EGM-2培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，將上室未遷移的細(xì)胞用棉簽輕輕擦去，將遷移至下室的細(xì)胞用4%多聚甲醛4℃固定30 min。用預(yù)冷PBS浸洗3遍，每次10 min。結(jié)晶紫染色后于倒置顯微鏡下任選5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.9 純化的EPCs體外成管能力檢測(cè)體外成管實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)集落挑選純化后的原代EPCs血管新生能力。將基質(zhì)膠于4℃避光過(guò)夜，保證基質(zhì)膠完全融化。將100 μl基質(zhì)膠加入96孔板中，于37 ℃溫箱中固化30 min。將EPCs用含5%FBS的EGM-2培養(yǎng)基調(diào)整密度至1×105個(gè)/ml。100 μl細(xì)胞懸液加入96孔板中，在5%CO2，95%濕度，37℃溫箱中進(jìn)行孵育。觀察EPCs的體外成管能力，并用Image-Pro Plus計(jì)算新生管壁的長(zhǎng)度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓來(lái)源原代EPCs形態(tài)學(xué)特征骨髓單個(gè)核細(xì)胞呈圓形緊密排列于纖維包被的培養(yǎng)上（圖1A）。第一次換液后，大部分貼壁不緊密以及壞死細(xì)胞被去除（圖1B），在后續(xù)集落挑選過(guò)程中非EPCs集落被刮除（圖1C）。大鼠骨髓來(lái)源EPCs經(jīng)過(guò)集落挑選純化后，培養(yǎng)至第4 d，于倒置顯微鏡下觀察EPCs形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)出紡錘形，細(xì)胞數(shù)量較少，分散在培養(yǎng)瓶底部，此為早期內(nèi)皮祖細(xì)胞（圖1D）。繼續(xù)培養(yǎng)14 d左右，集落出現(xiàn)，EPCs呈現(xiàn)典型的鋪路石樣改變（圖1E），細(xì)胞呈現(xiàn)出類圓形，三角形或多邊形（圖1F）。細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，且經(jīng)過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中不斷清除非EPCs集落，此時(shí)培養(yǎng)瓶中幾乎全部為典型的EPCs集落。

圖1 原代骨髓來(lái)源大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2 EPCs吞噬功能鑒定對(duì)經(jīng)過(guò)集落挑選純化后的原代EPCs進(jìn)行吞噬功能檢測(cè)，結(jié)果顯示EPCs具有吞噬Dil-acLDL的能力，使細(xì)胞在共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)紅色（圖2A）。同時(shí)，EPCs還具有結(jié)合FITC-UEA-I的功能使細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色（圖2B）。最終，約（95.7±3.8）%細(xì)胞同時(shí)具有吞噬Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-I能力（圖2C），呈現(xiàn)黃色（圖2D）。

圖2 內(nèi)皮祖細(xì)胞吞噬檢測(cè)

2.3 免疫熒光鑒定對(duì)EPCs表面表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞特性的標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示細(xì)胞中vWF陽(yáng)性表達(dá)率（96.8±2.8）%（圖3A，C，E），VE-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率（97.1±1.4）%（圖3B，D，F(xiàn)）。

圖3 內(nèi)皮祖細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

2.4 EPCs流式細(xì)胞術(shù)鑒定通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)經(jīng)過(guò)集落挑選純化后的原代EPCs表面標(biāo)志物CD34和VEGFR2表達(dá)情況進(jìn)行分析，大量研究證明，EPCs共表達(dá)CD34和VEGFR2。我們從結(jié)果得出，只經(jīng)過(guò)密度梯度法離心后CD34+和VEGFR2+細(xì)胞比例為（13.7±1.9）%（圖4A），經(jīng)過(guò)首次差速貼壁與集落挑選純化后細(xì)胞比例為（73.4±2.8）%（圖4B），第二次純化后細(xì)胞比例為（76.8±3.1）%（圖4C），第三次純化后細(xì)胞比例為（80.1±3.4）%（圖4D）。且經(jīng)過(guò)差速貼壁與集落挑選純化后的雙陽(yáng)細(xì)胞比例高[（73.4±2.8）% vs.（13.7±1.9）%，P＜0.01]，[（76.8±3.1）% vs.（13.7±1.9）%，P＜0.01]，[（80.1±3.4）% vs.（13.7±1.9）%，P＜0.01]，（圖4E）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)志物

2.5 EPCs增殖及活力檢測(cè)為了尋找用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳細(xì)胞濃度以及繪制EPCs生長(zhǎng)曲線。我們通過(guò)CCK-8進(jìn)行檢測(cè)，分別培養(yǎng)2×104、4×104、6×104、8×104、1×105個(gè)/ml的EPCs，每24 h用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值。結(jié)果顯示，在相同時(shí)間點(diǎn)，OD值隨細(xì)胞濃度的升高而增加，1×105個(gè)/ml組達(dá)到最佳生長(zhǎng)濃度（P＜0.01）。在不同時(shí)間點(diǎn)，OD值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在12 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，48 h進(jìn)入平臺(tái)期。故選擇1×105個(gè)/ml為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞濃度（圖5A）。用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，每12 h檢測(cè)一次，連續(xù)檢測(cè)72 h。與增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)相同，相同時(shí)間，細(xì)胞濃度增加，OD值增加。不同時(shí)間，時(shí)間延長(zhǎng)，OD值增加（圖5B）。

圖5 CCK-8及MTT法繪制內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.6 純化的EPCs遷移能力檢測(cè)連續(xù)觀察經(jīng)過(guò)集落挑選純化后的原代EPCs增殖情況，結(jié)果顯示EPCs狀態(tài)良好，12 h少量細(xì)胞已由上室遷移至下室（圖6A），24 h較多細(xì)胞遷移至下室（圖6B），36 h大量細(xì)胞進(jìn)行遷移，且遷移至下室細(xì)胞狀態(tài)形態(tài)良好（圖6C）。

圖6 純化后內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力

2.7 純化的EPCs體外成管能力檢測(cè)連續(xù)觀察經(jīng)過(guò)集落挑選純化后的原代EPCs體外成管情況，結(jié)果顯示4 h EPCs在基質(zhì)膠中逐漸開始貼壁伸展，伸出偽足（圖7A）。8 h細(xì)胞相互連接，部分管腔樣結(jié)構(gòu)形成（圖7B）。12 h細(xì)胞已完全伸展開，重新排列并形成明顯管腔樣結(jié)構(gòu)（圖7C）。

圖7 純化后內(nèi)皮祖細(xì)胞體外成管能力檢測(cè)

3 討論

自Asahara首次從外周血中分離出EPCs以來(lái)[11]，對(duì)EPCs的研究便不斷發(fā)展和深入。Schmidt-Lucke等[10]發(fā)現(xiàn)EPCs可以被當(dāng)做一種非特異性炎癥標(biāo)志物，與內(nèi)源性血管損傷修復(fù)能力密切相關(guān)。EPCs功能障礙會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮修復(fù)受損。此外，EPCs還可以診斷和監(jiān)測(cè)疾病，動(dòng)脈粥樣硬化。當(dāng)CD34+/VEGFR2+細(xì)胞比例下降至外周血單個(gè)核細(xì)胞的0.0038%以下時(shí)，心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加6倍以上。由于，EPCs與缺血性疾病關(guān)系密切。因此針對(duì)其做為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，當(dāng)血管壁受損時(shí)不僅可直接進(jìn)行修復(fù)，還可分化為內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)受損管壁，恢復(fù)管腔完整性的特性以及EPCs具有血管新生能力。越來(lái)越多的研究集中于移植EPCs修復(fù)損傷管腔以及治療缺血性疾病。

目前，已有大量動(dòng)物和臨床研究證明可以通過(guò)移植EPCs治療缺血相關(guān)性疾病。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Geng等[14]為糖尿病小鼠移植EPCs減輕了局灶性腦缺血導(dǎo)致的血腦屏障功能損傷。Fan等[15]將EPCs移植入缺血性腦損傷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)神經(jīng)血管修復(fù)，并改善長(zhǎng)期神經(jīng)行為預(yù)后。在臨床實(shí)驗(yàn)中，Chade[16]自體移植EPCs增加腎臟外周皮質(zhì)中血管生成。Liangden等[17]將EPCs注射入腎包膜下區(qū)域，增加腎臟微循環(huán)同時(shí)減少了細(xì)胞凋亡以及炎癥因子釋放。Lee和Quyyumi等[18,19]分別發(fā)現(xiàn)EPCs治療組可改善左室射血分?jǐn)?shù)，增加新生血管數(shù)量，并減輕心絞痛及心衰癥狀。以及改善心肌梗死面積，延長(zhǎng)院外生存時(shí)間。因此，如何獲得純度較高的EPCs用于移植對(duì)修復(fù)損傷管腔及治療缺血性疾病至關(guān)重要。高純度意味著當(dāng)EPCs用于移植時(shí)，單位體積細(xì)胞移植物中EPCs含量更高，有效性更高，移植物中其他種類細(xì)胞含量少，對(duì)患者的有害性及副作用就小。因此，探索一種用于獲得較高純度的EPCs方法十分必要。

EPCs來(lái)源較廣泛，最早Asahara從外周血中分離出EPCs，此后發(fā)現(xiàn)其也存在于其它組織中，包括脂肪，肝臟，腎臟[9,20,21]等。與其它獲取EPCs的來(lái)源相比，EPCs來(lái)源于血液血管母細(xì)胞，產(chǎn)生后一直存在骨髓中[12]，當(dāng)受到應(yīng)激后才釋放入血液循環(huán)，因此骨髓比外周血可獲得較早期有更高增殖分化潛能的EPCs[22]。且骨髓中EPCs遠(yuǎn)較肝臟，腎臟，脂肪中含量多分布廣，選擇骨髓來(lái)源EPCs作為實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)純化鑒定的細(xì)胞來(lái)源。

目前較常用的EPCs分離方法為，密度梯度離心法及磁珠分選法。密度梯度離心法優(yōu)點(diǎn)是離心后的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境不會(huì)被破壞有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，缺點(diǎn)是所獲得細(xì)胞中含有較多雜細(xì)胞，最終得到細(xì)胞純度較低。磁珠分選法優(yōu)點(diǎn)是可以獲得純度極高的帶有特定表面標(biāo)志物的細(xì)胞，缺點(diǎn)是細(xì)胞生長(zhǎng)所需的微環(huán)境被完全破壞不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，且在分選過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被破壞，增加污染幾率，成本較高。本研究中選擇密度梯度離心法，結(jié)合差速貼壁法及集落挑選方法，分離培養(yǎng)并純化EPCs。在操作過(guò)程中要注意無(wú)菌操作，防止細(xì)胞污染，密度梯度離心過(guò)程中，操作要溫柔，在將細(xì)胞懸液加入分離液過(guò)程中要保證分離液面清晰，離心時(shí)要保證低轉(zhuǎn)速，長(zhǎng)時(shí)間，在減速過(guò)程中要將離心機(jī)剎車設(shè)置為0，自然減速，減少分離后各層之間融合，確保所分離細(xì)胞純度和數(shù)量。在應(yīng)用差速貼壁法時(shí)，保證首次換液時(shí)操作緩慢，避免還未貼壁的EPCs被去除。以后每次換液時(shí)將貼壁不牢，衰老細(xì)胞充分用培養(yǎng)基沖掉。同時(shí)，換液時(shí)要在倒置顯微鏡下仔細(xì)觀察，若發(fā)現(xiàn)非或不典型EPCs集落，果斷將其用細(xì)胞鏟刮除，提高所培養(yǎng)細(xì)胞純度。同時(shí)配合EBM-2培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)EPCs生長(zhǎng)，增加EPCs數(shù)量和提升純度。

迄今為止還沒(méi)有一種準(zhǔn)確的方法鑒定EPCs，多種方法鑒定EPCs是現(xiàn)在常用的策略。最主要的方法就是鑒定EPCs的CD34和VEGFR2表面標(biāo)志物。CD34用于識(shí)別造血祖細(xì)胞。表達(dá)VEGFR2說(shuō)明EPCs具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞的能力[13]。EPCs表面還表達(dá)一些具有內(nèi)皮特征的標(biāo)志物，包括vWF及VE-cadherin[13]。EPCs還具有吞噬Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-I的能力[11]。同時(shí)EPCs還具有遷移能力和血管新生能力。本研究通過(guò)改良方法分離培養(yǎng)純化的EPCs共表達(dá)CD34和VEGFR2，并具有吞噬Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-I的能力。同時(shí)其具有遷移能力與體外成管能力。遷移能力與血管新生能力對(duì)于，管壁受損后EPCs遷移至損傷部位以及改善缺血部位血運(yùn)，促進(jìn)微循環(huán)極為重要。綜合多項(xiàng)鑒定實(shí)驗(yàn)，最終確定本研究分離培養(yǎng)純化的細(xì)胞為EPCs。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)提供了一種改良的，有效的分離培養(yǎng)純化及鑒定骨髓來(lái)源的EPCs方法。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表現(xiàn)標(biāo)志物，結(jié)合增殖和活力檢測(cè)，吞噬試驗(yàn)，評(píng)價(jià)遷移能力和體外成管能力多方面鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs，為修復(fù)受損管壁以及治療缺血相關(guān)性疾病提供足夠數(shù)量及純度的細(xì)胞保障。