響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取薺菜維生素C工藝

吳海燕，施曉玲，袁秋梅，陳建軍，袁春新

（1. 南通科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 南通 226007；2. 南通市農(nóng)村專業(yè)技術(shù)協(xié)會，江蘇 南通 226007；3. 南通市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇 南通 226006）

薺菜（Capsella bursa-pastoris.）是十字花科薺屬草本植物，薺菜可全草入藥，莖葉可食用[1-2]。野生薺菜在我國分布廣泛，作為一種藥食同源植物，近年來人工栽培發(fā)展迅速。薺菜含有黃酮、多糖、有機酸、生物堿、維生素、多酚等多種活性成分[3-10]，具有消炎、抗氧化、降低膽固醇和調(diào)節(jié)糖代謝等多種生物活性[4,8,11-15]。薺菜營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，質(zhì)地柔嫩，藥食兼?zhèn)?，深受消費者的喜愛。

薺菜中維生素C含量豐富[4]，維生素C是維持人體正常生理功能必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)之一，具有抗氧化等多種生理活性，有助于降低心血管疾病、糖尿病、某些癌癥等慢性疾病的患病風(fēng)險[16-17]。超聲波輔助提取薺菜維生素C是利用聲空化效應(yīng)，提高提取溶劑中薺菜的滲透速度，并且能減少提取溶劑的使用量。與傳統(tǒng)的提取法相比，超聲波輔助提取時間短，提取溶劑使用量少，可以多個實驗同時提取，效率高，提取物的損失降低[16,18]。目前超聲波提取技術(shù)已逐漸應(yīng)用于天然植物有效成分、生物活性成分的提取研究中[19-25]。

本實驗采用超聲波輔助草酸溶液提取薺菜中維生素C，考查草酸濃度、超聲時間、超聲溫度、超聲功率、料液比對薺菜維生素C提取的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，旨在為薺菜中天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薺菜（Capsella bursa-pastoris.）：江蘇中寶食品有限公司；Vc標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）：Sigma公司；草酸（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Waters雙通道紫外檢測器高效液相色譜儀：Waters公司；HR2084 食品制樣器：飛利浦公司；隔膜真空泵：天津市騰達過濾器件廠；超聲儀器（KQ2200）：昆山市超聲儀器有限公司；電子天平（精確度0.1 mg）：Sartorius公司；高速冷凍離心機（SL8R）：Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 維生素C含量的測定

高效液相色譜法測定維生素C含量[26]，以0.1%的草酸溶液為流動相，流速：1 mL/min，進樣量：25 μL，柱溫：25 ℃，樣品經(jīng)C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）分離，采用紫外檢測器進行檢測。

維生素C標(biāo)準(zhǔn)品用0.1%的草酸定容，制成濃度為2～20 μg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)待測溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，以維生素C的濃度為橫坐標(biāo)，得到回歸方程：y=75 480.2x-930.2。

1.2.2 維生素C的提取

準(zhǔn)確稱取100 g薺菜，加入100 mL的2%草酸溶液勻漿。稱取5.00 g左右的勻漿樣品放入100 mL的離心管中，加入一定量的草酸溶液，置于超聲波儀器中一定溫度超聲一定時間后，在4 ℃下9 000 r/min離心2 min，上清液轉(zhuǎn)移至100 mL的棕色容量瓶中，用0.1%草酸溶液定容，溶液用0.45 μm濾膜過濾后按1.2.1測定維生素C的峰面積，代入回歸方程求出薺菜的濃度，按下式計算維生素C的提取量。

式中：c為稀釋后提取液維生素C的濃度，μg/mL；V為樣品溶液的定容體積，mL；m為稱取的薺菜勻漿液中相當(dāng)于薺菜的質(zhì)量，g。

1.2.3 實驗設(shè)計

根據(jù)文獻討論，選擇提取溶劑草酸的濃度、超聲時間、超聲溫度、超聲功率、料液比等五個影響提取量的因素，對提取工藝過程進行優(yōu)化[7,9,19]。

1.2.3.1 單因素實驗 將薺菜勻漿樣品放入100 mL的離心管中，考察提取液草酸濃度（0.5%、1%、2%和3%），超聲時間（5、10、15、20和25 min），超聲溫度（20、25、30、35和40 ℃），超聲功率（20、25、30、35和40 W），料液比（1∶5、1∶10、1∶15和1∶20）對維生素C的提取量影響，每次超聲處理勻漿薺菜5 g。

1.2.3.2 二水平實驗 超聲輔助提取實驗影響因子多，采用全因子實驗設(shè)計會影響實驗效率[27]，采用部分因子實驗可以確定影響提取量的主效應(yīng)因子。在單因素實驗的基礎(chǔ)上確定各因素兩個合適水平值，以維生素C的提取量為考察指標(biāo)，采用SAS軟件中的Confounded Fractional Factorial designs來確定影響提取工藝過程的主要因素以及因素間交互作用的一級作用。

1.2.3.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)Box-Bohnken的中心組合設(shè)計原理，由二水平設(shè)計確定的主要因素各取3水平，設(shè)計了3因素3水平共15個實驗點的響應(yīng)面分析[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理使用軟件Excel 2010和SAS 9.0進行數(shù)據(jù)分析，繪圖采用Origin-2022，所有實驗都重復(fù)3次，結(jié)果用平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

單因素實驗，各因素對維生素C的提取量的影響結(jié)果見表1～5。

表1 草酸濃度對維生素C提取量的影響Table 1 Effects of oxalic acid concentration on extraction of Vitamin C

表2 超聲時間對維生素C提取量的影響Table 2 Effects of ultrasonic time on extraction of Vitamin C

表4 超聲功率對維生素C提取量的影響Table 4 Effects of ultrasonic power on extraction of Vitamin C

草酸濃度在0.5%～1%之間，維生素C的提取量快速增加，隨后隨著酸濃度增大，維生素C的量有所下降?？赡茉蚴且欢舛人崮軌虮Ｗo維生素C不受外界環(huán)境影響而降解；酸濃度過大，反而使維生素C溶出有所減少。

表5 料液比對維生素C提取量的影響Table 5 Effects of material to solvent ratio on extraction of Vitamin C

隨著超聲時間延長，維生素C的提取量是先增大后減少，在超聲15 min提取量最大；隨著超聲溫度升高，維生素C的提取量是先增大后減少，在超聲溫度為30 ℃提取量最大?？赡茉蚴浅晻r間增加，溫度升高都能增加了維生素C的溶出率；但是超聲時間繼續(xù)增加，溫度繼續(xù)升高，可能導(dǎo)致維生素C的降解，反而使維生素C的提取量減少。

隨著超聲功率增加，維生素C的提取量增加，在100 W時達到最高值。因為超聲效應(yīng)會隨著功率增加而增大，從而促進提取量增加。

隨著提取溶液量增加，維生素C的提取量是先增大后減少，在料液比1∶10提取量最大。因為溶液增加，促進維生素C的溶出，但是溶液繼續(xù)增加，減弱了超聲效應(yīng)，超聲提取效率減低，從而使維生素C的提取量減少。

2.2 二水平實驗

采用SAS軟件中5因素、實驗次數(shù)為8的Confounded Fractional Factorial designs來確定影響提取工藝過程的主要因素以及因素間交互作用的一級作用。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，同時考慮減少試劑使用量，每一個因素取一個相對高和一個相對低的水平，假定響應(yīng)值在所選的水平區(qū)間內(nèi)是近似線性的[13]，實驗因素和水平見表6。

表6 二水平實驗的水平安排Table 6 Factors and levels for Fractional Factorial designs

SAS軟件的Confounded Fractional Factorial designs實驗結(jié)果見表7。

表7 部分因子實驗結(jié)果Table 7 Experimental design and results of Fractional Factorial designs

SAS軟件提供各因素的主效應(yīng)（其他因素不變時，某單個因素的變化對響應(yīng)值的影響）見圖1。

圖1 各因素的主效應(yīng)圖Fig.1 Main effect of all the factors

由圖1可以看出，在選定的實驗范圍內(nèi)，提取酸的濃度對提取量影響較小；超聲時間、超聲溫度提取維生素C的影響是負相關(guān)的，而超聲功率、料液比對提取維生素C的影響是正相關(guān)的。對各因素的方差分析，如表8。

表8 各因素的方差分析Table 8 Analysis of variance for all the factors

由表3可知：在所有因素中，X2（超聲時間）、X3（超聲溫度）、X5（料液比）對維生素C的影響顯著，因此取上述三個因素作為主要因素做下一步優(yōu)化實驗。利用SAS軟件考察主要因素之間的交互作用如圖2所示。

表3 超聲溫度對維生素C提取量的影響Table 3 Effects of ultrasonic temperature on extraction of Vitamin C

圖2 主因素間的交互作用圖Fig.2 3-way interaction of main factors

由圖2可以看出兩個因素的值變化對提取量的影響，交互作用圖中兩直線交叉表示兩者有交互作用，平行表示二者沒有交互作用。在影響維生素C提取的主要因素中，超聲時間與超聲溫度之間；超聲時間與料液比之間有交互作用。超聲溫度與料液比之間不存在交互作用。可能存在的原因是：料液比會影響超聲空化效果；超聲時間越長，可能產(chǎn)生放熱，影響維生素C的提取量。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

利用響應(yīng)面分析法對Confounded Fractional Factorial designs中所確定的主要影響因素：超聲時間、超聲溫度、料液比作進一步的優(yōu)化。草酸的濃度為1%，超聲功率為100 W，其他三個重要因素根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行編碼，各因素編碼見表9。

表9 Box-Behnken實驗設(shè)計的因素水平及結(jié)果Table 9 Experimental design of Box-Behnken designs

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平共l5個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，在中心值重復(fù)3次實驗，用以估計實驗誤差[19]，結(jié)果見表10。

表10 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Table 10 Experimental design and results of Box-Behnken designs

SAS對數(shù)據(jù)進行回歸分析，結(jié)果如表11。

表11 Box-Behnken實驗設(shè)計的回歸分析Table 11 Regression analysis of Box-Behnken designs

由表11可見，三因素對維生素C提取的過程的影響并非簡單的一次線性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系。一次超聲溫度（X1）、超聲時間（X2）對提取效果的影響顯著；而在交叉乘積項上超聲溫度的平方（X1X1）、超聲溫度的平方（X2X2）、料液比的平方（X3X3）對提取效果的影響顯著；交互項上X1X2對提取效果有影響。各因素經(jīng)回歸擬合后，得回歸方程：

Y=54.67+1.116 25X1+1.098 75X2-0.507 5X3-2.938 75X1X1+1.237 5X1X2-0.035X1X3-2.673 75X2X2-0.22X2X3-2.286 25X3X3

對回歸方程進行可信度分析，模型可信度分析的統(tǒng)計檢驗結(jié)果見表12。

表12 模型可信度分析表Table 12 Fit statistics for Model

由表7可知，模型擬合系數(shù)的為96.01%，說明由這三個因素及其二次項構(gòu)成的回歸方程能解釋提取量Y變化的96.01%，模型誤差的平方根0.890 1，模型擬合度很好。

利用SAS軟件對各因素的主效應(yīng)分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 主要因素的主效應(yīng)圖Fig.3 Main effect of major factors

由圖3可知，X1、X2、X3在低含量時，隨著其值的增大響應(yīng)值Y增大，在高含量時，隨著其值的增大響應(yīng)值Y反而降低，并且在選定的實驗水平內(nèi)存在頂點，由此可知，在選定的區(qū)域，響應(yīng)值Y存在最大值。

提取量對響應(yīng)因子的立體圖見圖4。

由圖4可知，提取量對各因素的立體圖均是開口向下的曲面圖，說明在選定的實驗區(qū)域，維生素C的提取量存在最大值。利用SAS分析可知，回歸模型存在穩(wěn)定點（X1，X2，X3）為（0.5，0.5，0），提取維生素C的目標(biāo)值為54.68 mg/100 g。

圖4 各因素的響應(yīng)因子的立體圖Fig.4 Surface plots of all the factors

為了驗證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，根據(jù)各因素的實驗編碼水平，將超聲溫度取32 ℃，超聲時間12 min，料液比1∶10條件下進行提取維生素C，重復(fù)三次實驗，得到維生素C為（54.88±0.22）mg/100 g，與預(yù)測值相比，相對誤差為0.366%，說明該方程與實際情況擬合較好，證實了響應(yīng)面優(yōu)化的模型可靠性，響應(yīng)面法適用于對超聲波輔助提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié)論

1）實驗證明，二水平實驗和響應(yīng)面分析法對提取工藝的優(yōu)化是有效。二水平實驗用較少的實驗對影響提取工藝的多個因素進行考察，找出了影響超聲波提取維生素C的影響主要因素，分別為超聲溫度、超聲時間、料液比。

通過響應(yīng)面實驗對二水平實驗選出的3個主要因素進一步優(yōu)化，找出超聲溫度、超聲時間、料液比與提取維生素C之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型：

該模型的回歸效果顯著，模型擬合程度很好，能很好地預(yù)測三個主要因素對超聲波輔助提取工藝的影響。

2）SAS軟件分析主要因素與提取維生素C之間的數(shù)學(xué)模型在穩(wěn)定的條件下，提取維生素C存在最大值。優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件為：超聲溫度取32 ℃，超聲時間12 min，料液比1∶10，提取液草酸濃度為1%，超聲波功率100 W，在此條件下進行提取薺菜中維生素C的提取量為（54.88±0.22）mg/100 g，與預(yù)測值相比，相對誤差為0.366%，說明該響應(yīng)面法優(yōu)化的方程與實際情況擬合較好，證實了響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性。