紅棗多糖口服液澄清工藝及抗氧化活性研究

賈曉昱，鄭艷麗，張 鵬*，李江闊，趙志永，楊克箐

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所，天津 300384；2.天津科技大學(xué)，天津 300457；3.新疆遠翔農(nóng)業(yè)科技有限公司，新疆和田 848000）

我國紅棗年產(chǎn)量達700 萬t，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。紅棗中含有多糖、抗壞血酸、三萜酸、酚酸、氨基酸、皂苷和黃酮類化合物等多種生物活性成分[1-2]，具有抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗心血管疾病、保肝、抗糖尿病、抗微生物、抗癌和保護腸胃等作用[3-4]。紅棗多糖是紅棗的主要營養(yǎng)成分，具有多種生理功效，紅棗多糖的提取已成為近年來的研究熱點，主要技術(shù)是熱水浸提[5]，另外，微波輔助提取[6]、超聲輔助提取和亞臨界水提取等也被用于提取紅棗多糖[7]。

目前紅棗多糖主要的加工產(chǎn)品是粗多糖粉劑，其他加工產(chǎn)品則鮮有報道?？诜菏窃谥兴幖逯笠旱幕A(chǔ)上開發(fā)出的制劑型產(chǎn)品，具有功效成分保留率高、服用劑量低、效果好和便于攜帶等優(yōu)點，近年來在中老年保健品市場具有廣闊的發(fā)展前景[8]。但是，植物型口服液普遍存在后期絮凝、沉淀和渾濁等問題。制劑中引起沉淀的主要成分包括色素、果膠、蛋白質(zhì)及鞣質(zhì)等，沉淀物積累會導(dǎo)致口服液有效成分損失，因此，澄清工藝在口服液制備過程中十分必要[9-10]。殼聚糖具有生物降解性好、無毒、無污染和成本低等特性，在水處理領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用，也被用于人參、天貝和鐵皮石斛口服液的制備[11-13]。但是，未見應(yīng)用于紅棗多糖口服液制備的相關(guān)報道。

本文以紅棗為原料，采用熱水提取紅棗多糖，探究醇沉和殼聚糖澄清兩種工藝對紅棗多糖抗氧化活性及生物有效性的影響，明確最佳澄清工藝，為進一步開發(fā)紅棗口服液新產(chǎn)品，提高紅棗產(chǎn)品附加值提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試紅棗為新疆駿棗干棗，購于天津濱海新區(qū)金元寶農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場。DPPH、ABTS、O2-·、·OH 自由基檢測試劑盒均采購自北京索萊寶科技有限公司，無水乙醇采購自天津市江天化工技術(shù)有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

真空泵，SHZ-D，天津天拓儀器有限公司；水浴鍋，HH-M8，天津市慶達試驗儀器制造有限公司；粉碎機，ZN-08，天津市泰斯特儀器有限公司；紫外分光光度計，T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅棗口服液制備工藝

紅棗原料篩選→清洗→烘箱烘干（55～60 ℃）→粉碎過篩（40 目）→熱水浸提（60 ℃、70 min）→真空濃縮（60 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮）→澄清→離心（3 500 r/min、10 min）→透析（截留分子量，600 Da）→紅棗多糖溶液→冷凍干燥→紅棗粗多糖→調(diào)配（1%～3%檸檬酸、5%～10%糖酸比調(diào)配）→包裝→滅菌（90 ℃、30 min）→檢驗→成品。

經(jīng)過前期試驗，得出紅棗最佳熱水浸提工藝參數(shù)為提取溫度60 ℃、浸提時間70 min、提取次數(shù)3 次、料液比1∶17（g/mL），此條件下紅棗多糖提取率為15.89%。

1.3.2 澄清工藝單因素試驗

醇沉工藝單因素實驗參數(shù)為乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、醇沉溫度（10、15、20、25、30、35℃）、醇沉?xí)r間（4、8、12、16、20、24 h），殼聚糖澄清工藝單因素實驗參數(shù)為殼聚糖濃度（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%）、溫度（10、20、30、40、50、60 ℃）、時間（1、2、3、4、5、6 h）。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

醇沉工藝采用L17(34)響應(yīng)面實驗進行優(yōu)化，因素水平如表1 所示。綜合得分=多糖保留率×60+透光率×40。

表1 醇沉工藝響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factor and level table of response surface method in alcohol precipitation process

殼聚糖工藝設(shè)計L17(34)響應(yīng)面實驗，因素水平如表2所示。綜合得分=多糖保留率×60+透光率×40。

表2 殼聚糖工藝響應(yīng)面因素水平表Table 2 Factor and level table of response surface method in chitosan process

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 多糖保留率

采用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量[14]。依照公式（1）計算多糖保留率。

式中，m0為澄清前多糖含量，mg/mL；m1為澄清后多糖含量，mg/mL。

1.4.2 透光率

參照張海悅等[15]的方法，采用紫外-分光光度法測定，以蒸餾水為參比，測定其在660 nm 波長下的透光率。

1.4.3 ABTS 自由基清除能力

稱取0.038 4 g ABTS 和0.013 4 g 過硫酸鉀，用蒸餾水定容至20 mL，室溫避光過夜得ABTS 母液。室溫下以1∶40（g/g）加入蒸餾水，混勻后于734 nm 波長下，將吸光度值調(diào)節(jié)至0.7 備用。測定過程準(zhǔn)備多糖溶液0.2 mL、ABTS 稀釋液3.0 mL，避光反應(yīng)10 min，以蒸餾水為對照，測定其在734 nm 處的吸光度值[16]。按照式（2）計算ABTS自由基清除率。

式中，A樣品為多糖溶液的吸光度值；A空白為對照組吸光度值；A對照為蒸餾水代替ABTS 的吸光度值。

1.4.4 DPPH 自由基清除率

取多糖粗樣品和精制樣品液1 mL，隨后再分別放入3 mL 甲醇溶液（由0.004%DPPH 配制的），搖勻，避光擱置20 min，選用甲醇溶液為空白比對液，在517 nm 處檢測吸光度值，選擇蒸餾水為陰性比對液，選擇維生素C溶液為陽性比對液[17]。按公式（3）計算相應(yīng)清除率。

稱取多糖粗樣品和精制樣品液1 mL于試管中，分別按次序滴入0.078 mol/L NBT 溶液1 mL、0.468 mol/L NADH 試劑1 mL、0.06 mol/L PMS 溶液0.4 mL，混勻室溫放置5 min，測定560nm 處的吸光度值。對照組用不相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品液1 mL，PMS 溶液則被0.4 mL 蒸餾水代替作為空白，選VC 溶液為陽性比對液[18]。按公式（3）計算相應(yīng)清除率。

1.4.6 羥自由基（·OH）清除率

取多糖粗樣品和精制樣品液1 mL，加入1.5 mL 反應(yīng)液（含0.1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L FeCl3和2.8 mmol/L DR 的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）和20 mmol/L H2O20.35 mL），在37 ℃水浴下反應(yīng)40 min 后停止，在532 nm 處檢測吸光度值，以蒸餾水為陰性對比，VC 為陽性對比[19]。按公式（3）計算相應(yīng)清除率。

式中，A1為樣品吸光度值；A2為蒸餾水吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面設(shè)計軟件采用Design Expert 10，采用Origin 2019 作圖，用SPSS 21.0 進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇沉工藝單因素試驗

醇沉是多糖提取和澄清的常規(guī)方法，醇沉工藝參數(shù)研究結(jié)果如圖1 所示。由圖可知，固定溫度25℃，醇沉?xí)r間8 h，發(fā)現(xiàn)提取液的透光率隨乙醇濃度的增加而增大，但是多糖保留率則隨乙醇濃度的增大而減少。當(dāng)乙醇濃度為50%時，紅棗口服液的多糖保留率為59.86%。固定乙醇濃度60%，醇沉?xí)r間8 h，多糖保留率隨濃度增加呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，低溫范圍導(dǎo)致大分子雜質(zhì)難以聚沉，當(dāng)溫度過高時，雜質(zhì)間分子作用力增大，沉淀生成速率快，導(dǎo)致口服液不澄清[20]。醇沉溫度為20 ℃時，多糖保留率為65.89%，透光率為75.86%，當(dāng)醇沉溫度為25 ℃時，多糖保留率為69.89%，透光率為74.85%，基于口服液多糖保留率，選擇25 ℃作為適宜的醇沉溫度參數(shù)。固定乙醇濃度60%，醇沉溫度25 ℃，醇沉?xí)r間8 h 時，均具有較高的多糖保留率和透光率值，說明大分子雜質(zhì)物質(zhì)已基本被沉淀。當(dāng)醇沉?xí)r間超過12 h 時，口服液的多糖保留率和透光率變化幅度均不大，

圖1 醇沉工藝參數(shù)研究Fig.1 Study on alcohol settling concentration parameters

2.2 醇沉工藝響應(yīng)面優(yōu)化

由表3、4（見上頁）可知，應(yīng)用響應(yīng)面軟件對數(shù)據(jù)進行擬合分析（采用編碼數(shù)據(jù)），可獲得多元二次回歸方程模型（A 為乙醇濃度，B 為醇沉溫度，C 為醇沉?xí)r間，Y為綜合得分）。Y=74.41-0.583 6A+0.701 1B+0.157 3C-0.061 3AB-0.938 4AC+0.474 8BC-1.49A2-1.87B2-0.855 2C2。

表3 醇沉工藝響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental design table of alcohol precipitation process optimization

由表4 可以看出，響應(yīng)面回歸模型極顯著；回歸模型相關(guān)系數(shù)R2為0.970 8，反映該線性回歸模型能在97.08%程度上解釋變量Y的變異性。由顯著性水平檢驗可知，A、B、AC、A2、B2、C2項對響應(yīng)值影響極顯著，BC 項對響應(yīng)值影響顯著，C、AB 項對響應(yīng)值影響不顯著，表明試驗因素對綜合得分的影響不是簡單的線性關(guān)系。試驗因素交互作用對綜合得分影響的3D 曲面圖和等高線圖如圖2 所示。

表4 響應(yīng)曲面優(yōu)化方差分析表Table 4 Optimal variance analysis table of response surface

圖2 試驗因素交互作用影響的3D 響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2 3D response surface diagram and contour diagram of the interaction of factors

結(jié)合圖2 和表4 可知，乙醇濃度和醇沉溫度交互作用對綜合得分的影響不顯著，乙醇濃度和醇沉?xí)r間對綜合得分影響極顯著，醇沉溫度和醇沉?xí)r間對綜合得分影響顯著。通過響應(yīng)面軟件對數(shù)據(jù)做進一步的擬合分析，得出最佳醇沉條件為乙醇濃度47.802 2%，醇沉溫度25.297 4 ℃，醇沉?xí)r間10.424 9 h，綜合得分達最大值（74.504 2）。經(jīng)驗證試驗，設(shè)定乙醇濃度48%，醇沉溫度25℃，醇沉?xí)r間10 h 時，得分為74.68，此時，紅棗口服液的多糖保留率為74.95%，透光率為72.45%。

2.3 殼聚糖澄清工藝單因素實驗

殼聚糖分子中含有游離氨基，在溶液中易生成鹽，表現(xiàn)出陽離子特性，具有較好的絮凝和澄清作用，是常用的澄清劑[20-21]。

由圖3A 可知，口服液的透光率隨殼聚糖添加濃度的增大而增大，當(dāng)殼聚糖添加量超過0.03%時，其增幅明顯降低。隨著殼聚糖添加量的增加，多糖保留率逐漸降低，當(dāng)濃度超過0.03%時，多糖保留率下降速度明顯加快，因此，殼聚糖添加量選擇0.03%。如圖3B，澄清時間超過4 h 后，口服液透光率值基本趨于穩(wěn)定，而多糖保留率隨澄清時間的增加而降低，表明4 h 澄清時間條件下，口服液中的大部分雜質(zhì)已被沉淀，且澄清時間4 h 時，多糖保留率為89.6%，因此，澄清時間選擇4 h。如圖3C，多糖保留率隨著澄清溫度的增大而降低，透光率隨著澄清溫度的增大而升高，當(dāng)溫度大于40 ℃時，多糖保留率明顯下降，溫度為等于40 ℃時，口服液多糖保留率為90.2%，透光率為89.6%，可能是因為當(dāng)溫度低于40 ℃時，殼聚糖主要發(fā)揮澄清作用，當(dāng)溫度高于40 ℃時，殼聚糖主要發(fā)生熱凝結(jié)反應(yīng)[22]，因此，選擇澄清溫度為40 ℃。

圖3 殼聚糖工藝單因素實驗結(jié)果Fig.3 Results of single factor experiment using chitosan process

2.4 殼聚糖澄清工藝響應(yīng)面優(yōu)化

應(yīng)用響應(yīng)面軟件對數(shù)據(jù)進行擬合分析（采用編碼數(shù)據(jù)），可以獲得多元二次回歸方程模型（式中A 為殼聚糖添加量，B 為澄清溫度，C 為澄清時間，Y為綜合得分），Y=85.27+1.54A+2.21 B+0.191 3 C+1.55 AB-1.14AC+0.452 0BC-4.41A2-3.82B2-6.66C2。

由表5、6（見第15 頁）可知，響應(yīng)面回歸模型極顯著；模型相關(guān)系數(shù)R2為0.993 1，反映該線性回歸模型能在99.31%程度上解釋反應(yīng)變量Y的變異性。由顯著性水平檢驗可知，A、B、A2、B2、C2項對響應(yīng)值影響極顯著，AB、AC 項對響應(yīng)值影響顯著，C、BC 項對響應(yīng)值影響不顯著，表明試驗因素對綜合得分的影響不是簡單的線性關(guān)系。試驗因素交互作用對綜合得分影響的3D 曲面圖和等高線圖如圖4。

表5 殼聚糖澄清工藝優(yōu)化實驗結(jié)果Table 5 Design table of orthogonal experiment results of chitosan process optimization

圖4 試驗因素交互作用影響的3D 響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4 3D response surface diagram and contour diagram of the interaction of experimental factors

通過響應(yīng)面軟件擬合分析，得出最佳條件為殼聚糖濃度0.03%，溫度40 ℃，時間4 h，綜合得分達到最大值（85.27）。經(jīng)驗證實驗，紅棗口服液得分85.29，說明模型與實際提取率吻合效果較好，且該條件下，口服液多糖保留率為83.89%，透光率為81.25%。與醇沉工藝相比，殼聚糖澄清的多糖保留率和透光率均較高，表明其對多糖溶液中的雜質(zhì)去除能力和澄清能力優(yōu)于醇沉工藝。

2.5 不同澄清工藝對多糖抗氧化活性的影響

2.5.1 不同澄清工藝對多糖清除·OH 能力的影響

·OH 是生物體內(nèi)最具活性的自由基，幾乎所有類型的大分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和核酸，都可能被羥自由基破壞，從而導(dǎo)致生物體老化[23]。本實驗對比分析了醇沉和殼聚糖兩種澄清工藝清除·OH 能力的差異，如圖5 所示。由圖知，醇沉和殼聚糖澄清工藝的·OH 清除能力差異不顯著，以·OH 清除率達到50%計算，所需的多糖濃度分別為2.25 mg/mL 和2.0 mg/mL。殼聚糖澄清工藝制備的粗多糖對·OH 的清除能力高于醇沉工藝，可能的原因是殼聚糖澄清后，多糖的活性提高，而紅棗多糖可以通過結(jié)合氧化過程中必需的自由基離子來終止自由基鏈反應(yīng)，從而具有較高的清除·OH 能力[23]。

圖5 澄清工藝對多糖清除·OH 能力的影響Fig.5 Effects of clarification process on hydroxyl radical scavenging ability of polysaccharides

表6 殼聚糖工藝響應(yīng)面優(yōu)化方差分析表Table 6 Response surfaceo for chitosan process

2.5.2 不同澄清工藝清除ABTS 自由基能力對比

由圖6 可知，醇沉和殼聚糖澄清工藝在清除ABTS 自由基能力方面，表現(xiàn)出相同的趨勢，當(dāng)多糖濃度相同時，殼聚糖澄清工藝對ABTS 自由基的清除能力高于醇沉工藝，當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL 時，醇沉工藝對ABTS 清除能力為25%，而殼聚糖澄清工藝對ABTS 的清除能力達41.2%，其可能的原因是乙醇沉淀過程在去除大分子雜質(zhì)的同時會將具備清除ABTS 自由基功能的部分小分子多糖也除去，導(dǎo)致醇沉工藝ABTS 自由基的清除能力低于殼聚糖處理工藝的。

圖6 不同澄清工藝清除ABTS 自由基能力的對比Fig.6 Comparison of ABTS free radical scavenging ability of different clarification processes

圖7 澄清工藝對多糖清除能力的對比Fig.7 Comparison of the scavenging ability of the clarification process on

2.5.4 不同澄清工藝對清除DPPH 自由基能力的影響

DPPH 是一個穩(wěn)定的基團，廣泛用于評價抗氧化劑對自由基的清除活性，能夠較好地反映溶液的抗氧化性[26]。在DPPH 測定中，抗氧化劑清除DPPH 自由基的作用歸因于它們的供氫能力，圖8 為不同澄清工藝對DPPH 自由基的清除活性，由圖知，隨著多糖濃度的增加，DPPH 自由基清除率逐漸增加，當(dāng)多糖濃度超過1.5 mg/mL 時，殼聚糖澄清工藝對DPPH 自由基的清除能力更加顯著，且殼聚糖工藝明顯優(yōu)于醇沉工藝。殼聚糖是陽離子堿性多糖，其主要通過電中和與粘結(jié)架橋發(fā)揮雙重絮凝作用，與醇沉工藝相比，其不僅能夠去除蛋白質(zhì)和糖類，還可以有效去除鞣質(zhì)[27]。鞣質(zhì)聚合是導(dǎo)致口服液沉淀的主要原因，口服液的渾濁和沉淀，阻擋了溶液與DPPH 基團的接觸，降低了供氫能力，這可能是醇沉工藝去除DPPH 自由基能力較差的原因。

圖8 不同澄清工藝對多糖清除DPPH 自由基能力的影響Fig.8 Effects of different clarification processes on DPPH free radical scavenging ability of polysaccharides

3 結(jié)論

以紅棗為試材，研究了紅棗口服液制備過程中的關(guān)鍵澄清工藝，優(yōu)化了醇沉和殼聚糖兩種澄清工藝的濃度、溫度和時間參數(shù)，并分析了不同澄清工藝對口服液抗氧化活性的影響。在優(yōu)化澄清工藝方面，殼聚糖澄清工藝可以維持較高的多糖保留率和透光率，對雜質(zhì)的澄清較完全，而且殼聚糖澄清工藝過程中殼聚糖用量少、時間短、澄清效率高于醇沉工藝。在抗氧化活性方面，殼聚糖在清除ABTS 自由基、羥自由基、陰離子自由基（）、DPPH 自由基方面，均顯著的優(yōu)于醇沉工藝。因此，殼聚糖澄清工藝更適合于紅棗多糖口服液的加工，應(yīng)用前景廣闊，后續(xù)可從殼聚糖復(fù)合絮凝劑用于制備紅棗口服液，提高澄清效果等方面開展研究。