miR-205在宮頸鱗癌中的表達(dá)及其對癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

劉建兵，林曉雨，李文龍，王偉，王文豪，崔小華，郝建卿，李莉，郝敏*

1山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，山西太原 030001；2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物與遺傳學(xué)教研室，山西太原 030001

宮頸癌是一種發(fā)病率和致死率均較高的婦科腫瘤[1-2]。高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是公認(rèn)的誘發(fā)宮頸癌變的主要因素[3-4]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，Epstein-Bar病毒、陰道微生物菌群、葉酸缺乏及化學(xué)致癌物等因素均與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3,5-6]。微小RNA(miRNA，miR)是一段由20～24個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，一般通過與靶基因結(jié)合后的相互作用而發(fā)揮調(diào)控功能，涉及30%以上的人類基因[7-8]。目前發(fā)現(xiàn)宮頸癌中有近百種miRNA存在異常表達(dá)，如miR-27b、miR-196a、miR-21、miR-590等呈高表達(dá)[9-12]，miR-506、miR-200b、miR-183、miR-125b等呈低表達(dá)[13-16]。差異表達(dá)的miRNA通過廣泛參與宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、化療耐藥、放療抵抗等過程，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要的作用[17]，但目前能應(yīng)用于臨床診斷及作為治療靶標(biāo)的關(guān)鍵miRNA還很少。本研究擬篩選宮頸癌中異常表達(dá)的miRNA，并通過細(xì)胞及分子生物學(xué)方法鑒定關(guān)鍵miRNA的功能機(jī)制，以探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并尋找可用于宮頸癌診斷及治療的新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 樣本信息及差異表達(dá)分析 從腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中下載宮頸鱗癌患者的臨床信息及miRNA不同亞型表達(dá)量數(shù)據(jù)，包括254個腫瘤樣本組織和3個鄰近的非腫瘤樣本組織，并在R軟件中進(jìn)行歸一化處理。采用R軟件中的“l(fā)imma”包分析并篩選差異表達(dá)的miRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)>2.5及P<0.01。P值經(jīng)錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正。

1.2 宮頸鱗癌樣本及癌細(xì)胞株 選取2021年6－9月在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的21例宮頸鱗癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次確診為宮頸鱗癌；治療前未進(jìn)行化療、放療及免疫治療等；接受宮頸癌切除術(shù)。收集手術(shù)切除的21例宮頸鱗癌組織及13例癌旁組織，將標(biāo)本保存于4%多聚甲醛溶液及液氮中。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查通過(2021SLL044)。人宮頸癌細(xì)胞系HeLa及SiHa細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS、1%雙抗)中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中生長，備用。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對照(NC)組、miR-205組，miR-205抑制劑對照組，miR-205抑制劑組以及si-IL-32組細(xì)胞，分別利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染NC序列(UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG)、miR-205 mimics序列(GACUCCGGUGGAAUGAAGGAUU)、miR-205 inhibitor NC序列(CAGUACUUUUGUGUAG UACAA)、miR-205 inhibitor序列(CAGACUCCGGUG GAAUGAAGGA)及IL-32 siRNA序列(GGCUUGAUU ACUCUCUAUATT)。

1.4 原位雜交法檢測癌組織中miR-205的表達(dá) 采用原位雜交法檢測癌組織中miR-205的表達(dá)，以癌旁組織作為對照。將人宮頸鱗癌組織用4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，蛋白酶K處理，室溫下用醋酸酐、三乙醇胺溶液孵育10 min，加入地高辛標(biāo)記的RNA探針[5'-CAG(+A)C(+T)CCGG(+T)GGAA(+T)GA(+A)GGA-Dig-3']，4 ℃孵育過夜。次日用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液沖洗，并用堿性磷酸酶顯色液處理至顯色，水洗殘液，乙醇脫水，封片，拍照。

1.5 qRT-PCR法檢測miR-205及IL-32的表達(dá) 提取總RNA，并要求其光密度(OD)260/OD280為1.8～2.0；將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到模板cDNA；以cDNA為模板，構(gòu)建PCR體系，采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下。miR-205：反轉(zhuǎn)引物RT-205 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACCAGACT-3'；擴(kuò)增引物正向5'-AATTGTCCTTCATTCCACCGG-3'，反向5'-GTGC AGGGTCCGAGGT-3'；IL-32正向5'-TCTCAGTGGA GCTGGGTCAT-3'，反向5'-CCAACCCCTGAGCAGAA GTA-3'；U6正向5'-CGCヰCGGCAGCACATATAC-3'，反向5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；GAPDH正向5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3'，反向5'-TTCACACCCATGACGAACAT-3'。以人U6基因或GAPDH作為內(nèi)參照，目的基因mRNA相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。ΔΔCt=(目的基因Ct－內(nèi)參照基因Ct)處理組－(目的基因Ct－內(nèi)參照基因Ct)對照組。

1.6 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力檢測 (1)細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8法，取適量細(xì)胞，置于96孔板，每組重復(fù)5孔，分別于培養(yǎng)0 h和48 h每孔添加10 μl CCK-8溶液，孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值，計(jì)算細(xì)胞活力。(2)細(xì)胞遷移及侵襲能力檢測：采用Transwell模型，將Transwell小室放入預(yù)先每孔加有600 μl培養(yǎng)基(含10%血清)的24孔板內(nèi)，在Transwell的內(nèi)室(侵襲實(shí)驗(yàn)中的Transwell小室需提前鋪Matrigel基質(zhì)膠)加入適量細(xì)胞，培養(yǎng)一定時間后，取出小室，擦掉內(nèi)室細(xì)胞，利用4%多聚甲醛溶液固定小室外細(xì)胞，伊紅或結(jié)晶紫染色后，于顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)、拍照。

1.7 miR-205對IL-32mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 在宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞中，檢測過表達(dá)或降低miR-205表達(dá)后IL-32的表達(dá)情況。比較IL-32啟動子與miR-205序列，構(gòu)建IL-32啟動子報(bào)告載體，將IL-32啟動子報(bào)告載體與NC或miR-205mimics序列分別共轉(zhuǎn)染于HeLa細(xì)胞中，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(海腎螢光素酶基因?yàn)閳?bào)告基因，螢火蟲螢光素酶基因?yàn)閮?nèi)參照基因，美國Promega公司)檢測相對熒光素酶活性。

1.8 Western blotting法檢測侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)將HeLa和SiHa細(xì)胞各分為對照組及si-IL-32組，提取細(xì)胞總蛋白，測定OD562nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測得蛋白濃度。取30～50 μg蛋白樣品，變性，SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，孵育一抗過夜；磷酸鹽緩沖溶液沖洗3～5次，孵育二抗1 h；磷酸緩沖溶液沖洗3～5次，按化學(xué)發(fā)光試劑盒要求進(jìn)行曝光顯影(取溶液A、B各1 ml，避光條件下配制發(fā)光液，滴加適量發(fā)光液，使其與蛋白膜充分接觸，反應(yīng)1 min后，進(jìn)入暗室顯影、定影)。所用抗體如下：兔源MMP-2、MMP-9(1:1000，美國Proteintech公司)及兔源GAPDH(1:5000，美國Bioworld公司)。以GAPDH為內(nèi)參，通過條帶灰度分析計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，宮頸癌組和癌旁組的比較采用配對t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對照組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 篩選宮頸鱗癌差異表達(dá)miRNA 生物信息學(xué)分析顯示，宮頸鱗癌中具有表達(dá)差異的miRNA共106個，其中70個上調(diào)，36個下調(diào)。在差異表達(dá)的miRNA中，miR-205表達(dá)量變化最大，差異倍數(shù)為8.414(圖1，表1)。

表1 宮頸鱗癌中表達(dá)上調(diào)及下調(diào)前5位的miRNATab.1 The top five up-regulated and down-regulated miRNAs in cervical squamous cell carcinoma

圖1 宮頸鱗癌中差異表達(dá)的miRNA火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed miRNAs in cervical squamous cell carcinoma

2.2 宮頸癌組織中m i R-2 0 5 的表達(dá)水平 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，與宮頸正常組織miR-205表達(dá)量(55.60±3.6)比較，宮頸鱗癌組織的miR-205表達(dá)量(12 122.59±9000.7)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A)。原位雜交檢測結(jié)果顯示，miR-205在人宮頸鱗癌組織中呈陽性表達(dá)(藍(lán)色)，而在癌旁組織中表達(dá)很弱，甚至不表達(dá)(圖2B)。宮頸鱗癌臨床標(biāo)本癌組織的miR-205表達(dá)量明顯高于癌旁組織[(1.86±0.19)vs. 1.00，P<0.05，圖2C]。2.3 過表達(dá)miR-205對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-205組miR-205的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，圖3A)；CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-205組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05，圖3B)；Transwell法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-205組能夠遷移或侵襲過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.01，圖3C)。

圖2 宮頸鱗癌與正常組織中miR-205的表達(dá)情況Fig.2 The expression of miR-205 in normal tissue and cervical squamous cell carcinoma

圖3 miR-205過表達(dá)對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響Fig.3 The effect of over-expressed miR-205 on proliferation, migration and invasion of cervical cancer HeLa cells

2.4 miR-205對IL-32mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 與對照組比較，miR-205組miR-205表達(dá)量明顯升高(P<0.05，圖4A)；與miR-205抑制劑對照組比較，miR-205抑制劑組miR-205表達(dá)量明顯降低(P<0.05，圖4B)。與對照組比較，miR-205組IL-32mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05，圖4C)； 與miR-205抑制劑對照組比較，miR-205抑制劑組IL-32mRNA相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05，圖4D)。在臨床標(biāo)本中，與癌旁組織比較，宮頸鱗癌組織中IL-32mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05，圖4E)。與IL-32啟動子報(bào)告載體+NC組比較，IL-32啟動子報(bào)告載體+miR-205組的相對熒光活性明顯升高(P<0.05，圖4F)。

圖4 miR-205對IL-32 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Fig.4 Regulating effect of miR-205 and on the expression of IL-32 mRNA

2.5 miR-205和IL-32對宮頸癌細(xì)胞侵襲及侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響 與對照組比較，si-IL-32組細(xì)胞IL-32mRNA相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05，圖5A、B)。Transwell法檢測結(jié)果顯示，降低miR-205表達(dá)后遷移過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量明顯變少(P<0.05，圖5C)；si-IL-32組能夠侵襲過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量也明顯少于對照組(P<0.05，圖5D)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，si-IL-32組MMP-2、MMP-9蛋白的相對表達(dá)量明顯低于對照組(P<0.05，圖6)。

圖5 miR-205和IL-32對宮頸癌細(xì)胞侵襲的影響Fig.5 The effect of miR-205 and IL-32 on the invasion of cervical cancer cells

3 討 論

宮頸癌中有近百種miRNA存在異常表達(dá)，但目前能應(yīng)用于臨床診斷及作為治療靶標(biāo)的關(guān)鍵miRNA還很少。本研究經(jīng)篩選獲得了宮頸癌中共106個差異表達(dá)的miRNA，其中miR-205表達(dá)明顯上調(diào)，且變化量最大。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-205在宮頸癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，提示miR-205可能對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用。miR-205是一個非常保守的非編碼RNA分子，在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中異常表達(dá)，在不同類型的癌癥中，既可以充當(dāng)致癌因子，又可以充當(dāng)抑癌因子的角色[18]。在宮頸癌的研究中，關(guān)于miR-205的功能也有不同報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-205促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[19-21]，也有研究顯示miR-205能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲[22-23]。本研究證實(shí)，miR-205能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，為闡明miR-205在宮頸癌中的作用提供了新證據(jù)。

人IL-32起初發(fā)現(xiàn)于活化的NK細(xì)胞及T細(xì)胞，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞，是一種促炎細(xì)胞因子[24]。IL-32在多種類型的癌癥中異常表達(dá)，能夠通過促炎效應(yīng)、抗病毒感染、促血管生成等方式及途徑參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其在宮頸癌中的作用研究較少。既往發(fā)現(xiàn)IL-32對宮頸癌的發(fā)展具有抑制作用[25-26]，但Lee等[25]發(fā)現(xiàn)IL-32高表達(dá)與宮頸癌的進(jìn)展顯著相關(guān)，隨著人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染，使炎癥持續(xù)，可能會促進(jìn)宮頸發(fā)生癌變。IL-32可誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[27]。Lee等[25]證實(shí)，IL-32可促進(jìn)IL-1β、TNF-α及IL-18等炎性因子的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-205可促進(jìn)炎性因子IL-32的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與炎性因子能夠相互作用：一方面，miRNA靶向炎癥執(zhí)行者，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；另一方面，炎癥信號可改變miRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)，破壞促腫瘤與抗腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的平衡，進(jìn)而在惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[28]。上述結(jié)果提示，miR-205可能通過調(diào)控炎性因子IL-32的表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。

經(jīng)典理論認(rèn)為，miRNA對靶基因具有負(fù)調(diào)控作用，但有研究發(fā)現(xiàn)miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中也有正向調(diào)控的情況發(fā)生。Vasudevan等[29]證實(shí)miRNA可從對基因表達(dá)的抑制作用轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨饔?；Majid等[30]發(fā)現(xiàn)，miR-205能夠結(jié)合于IL-24及IL-32的啟動子區(qū)，并誘導(dǎo)靶基因mRNA和蛋白的高表達(dá)；Kim等[31]發(fā)現(xiàn)，口腔癌中miR-205能夠直接上調(diào)IL-24的表達(dá)；Xiao等[32]發(fā)現(xiàn)，位于細(xì)胞核內(nèi)的miRNA可起到激活基因轉(zhuǎn)錄的作用；本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，miR-205能夠直接上調(diào)靶基因CHN1的表達(dá)[21]。由此看來，miRNA對靶基因的調(diào)控機(jī)制除了經(jīng)典的負(fù)調(diào)控以外，還可能有正調(diào)控作用。在miR-205的調(diào)控模式中已經(jīng)多次發(fā)現(xiàn)正調(diào)控的現(xiàn)象，表明miR-205對靶基因調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中miR-205與IL-32mRNA的表達(dá)變化一致，原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示miR-205可能在細(xì)胞核中高表達(dá)；本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)miR-205可通過與IL-32啟動子相互作用提高IL-32mRNA的表達(dá)量。這為后續(xù)研究miR-205的復(fù)雜作用機(jī)制指明了方向，也再次證實(shí)了miR-205與IL-32的調(diào)控關(guān)系，但miR-205通過調(diào)控IL-32的表達(dá)影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，在宮頸鱗癌中存在異常表達(dá)的miRNA，其中miR-205明顯高表達(dá)，可能通過上調(diào)IL-32的表達(dá)調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。