結(jié)直腸癌患者血漿cfDNA檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用評(píng)估

朱赟潔， 馬崢堯， 沈敏娜， 周 琰， 黃 斐， 陳馨寧， 張春燕， 王蓓麗， 郭 瑋

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032）

結(jié)直腸癌是一種好發(fā)于老年男性人群的惡性腫瘤，發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第3位，病死率居第2位，其發(fā)病率與年齡有關(guān)，但近年來(lái)有年輕化的趨勢(shì)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，有35%～45%的結(jié)直腸癌患者存在KRAS基因突變，約有15%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者存在BRAF基因突變，約有5%的結(jié)直腸癌是由微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）高或錯(cuò)配修復(fù)缺陷（different mismatch repair，dMMR）導(dǎo)致的，還有一些結(jié)直腸癌與PIK3CA基因突變、HER2擴(kuò)增和NTRK基因融合等有關(guān)[2]。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（the National Comprehensive Cancer Network，NCCN）發(fā)布的結(jié)直腸癌診療專家共識(shí)明確指出，對(duì)實(shí)施抗表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者需明確BRAF、KRAS和NRAS基因的突變狀態(tài)[3]。

傳統(tǒng)的組織活檢存在創(chuàng)傷性，且取材范圍受限，無(wú)法實(shí)時(shí)反映腫瘤的變化；而液體活檢作為一種便捷、非侵入性的檢測(cè)方法，可多次取材、實(shí)時(shí)反映腫瘤異質(zhì)性的變化，為腫瘤的個(gè)性化診療提供參考依據(jù)，在結(jié)直腸癌早期診斷、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、化療和靶向治療等方面均有較好的臨床價(jià)值[4]。腫瘤患者體內(nèi)循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）除正常細(xì)胞來(lái)源外，還有凋亡腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的DNA小片段，即循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。ctDNA的基因組譜與相應(yīng)腫瘤的基因組譜匹配率較高，對(duì)分子病理學(xué)和臨床腫瘤學(xué)均有重要意義[5]。由于體細(xì)胞突變只存在于腫瘤細(xì)胞DNA，而這些DNA是特異的可被檢測(cè)和追蹤的生物標(biāo)志物，其臨床價(jià)值優(yōu)于臨床常用的癌胚抗原、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等蛋白標(biāo)志物[6]。隨著下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)檢測(cè)cfDNA指導(dǎo)腫瘤的臨床診療變得更加切實(shí)可行。根據(jù)我國(guó)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理?xiàng)l例》[7]的規(guī)定：對(duì)于國(guó)內(nèi)尚無(wú)同品種產(chǎn)品上市的體外診斷試劑，符合條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)根據(jù)本單位的臨床需求，可以自行研制，在執(zhí)業(yè)醫(yī)師指導(dǎo)下在本單位內(nèi)使用。目前尚無(wú)用于cfDNA檢測(cè)的商品化試劑盒，因此本研究擬基于NGS平臺(tái)建立檢測(cè)結(jié)直腸癌患者cfDNA的方法，并根據(jù)《我國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部門自建檢測(cè)方法發(fā)展與管理建議》[8]和《實(shí)驗(yàn)室自建分子診斷項(xiàng)目基本要求專家共識(shí)》[9]中的試劑盒性能評(píng)價(jià)要求進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年8月—2019年12月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)檢查確診的晚期結(jié)直腸癌患者39例，其中男22例、女17例，年齡31～78歲；39例患者中有22例為初診未治患者，收集這22例患者采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）檢測(cè)腫瘤組織中靶向藥物相關(guān)基因突變的結(jié)果。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Ion Chef instrument系統(tǒng)、Ion S5 XL高通量測(cè)序儀、Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度PCR儀、ABI 7500 PCR儀均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司。2100生物分析儀購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。Qubit熒光定量?jī)x購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Agencourt核酸純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。0.2 mL PCR管式磁分離架購(gòu)自美國(guó)Permagen Labware公司。

1.2.2 商品化參考品 野生型和預(yù)期突變位點(diǎn)為PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、KRASG12D、BRAFV600E、MAP2K1 Q56P、NRASQ61K、CTNNB1 S33Y，突變頻率為0.1%、0.2%、0.5%的商品化參考品（貨號(hào)為HD817）購(gòu)自英國(guó)Horizon Discovery公司。野生型和預(yù)期突變位點(diǎn)為PIK3CAH1047R、NRASQ61R、KRASQ61H、KRASG12D、BRAFV600E、ERBB2 A771_Y772insYVMA、AKT1 E17K，突變頻率為0.1%、0.2%、0.5%的商品化參考品（貨號(hào)分別為0710-0672、0710-0673、0710-0674）購(gòu)自美國(guó)SeraCare公司。

1.2.3 自制參考品EPS3 根據(jù)結(jié)直腸癌患者血漿cfDNA檢測(cè)系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱結(jié)直腸癌cfDNA panel）所覆蓋的位點(diǎn)，將結(jié)直腸癌及肺癌細(xì)胞系（商品化人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1650、人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT-15）DNA和人源基因組DNA打斷至平均片段長(zhǎng)度為170 bp，用表觀健康者來(lái)源的基因組DNA（野生型）稀釋至期望突變頻率為0.1%、0.2%和0.5%。自制參考品EPS3覆蓋的預(yù)期突變分別為PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、KRASG13D、BRAFV600E。

1.2.4 其他試劑 MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit、Oncomine Colon cfDNA Assay、Ion Library TaqMan Quantitation Kit、Ion 540 Kit-Chef芯片、Ion 540 Chip Kit均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司。Qubit dsDNA HS assay購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。High Sensitivity DNA Kit購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。比對(duì)方法中通用文庫(kù)構(gòu)建試劑盒和核酸純化試劑盒均購(gòu)自上海安可濟(jì)生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的采集、處理和檢測(cè) 采用Vacutainer采血管（美國(guó)BD公司）采集所有患者靜脈血20 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。1 581×g離心10 min，分離血漿，置于2 mL Eppendorf管中，然后再以16 873×g離心10 min，獲得乏細(xì)胞血漿，吸出血漿，置于新的2 mL Eppendorf管中，-80 ℃保存待檢?；贜GS平臺(tái)構(gòu)建結(jié)直腸癌cfDNA panel，由MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit、Ion Library TaqMan Quantitation Kit、Ion 540 Kit-Chef芯片、Ion S5 XL高通量測(cè)序儀和Oncomine Colon cfDNA Assay組成。采用MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit抽提血漿中的cfDNA，并采用Qubit dsDNA HS assay進(jìn)行cfDNA定量，總量≥10 ng，片段分布主峰約為170 bp，且無(wú)明顯的基因組污染（無(wú)或僅有少量>2 000 bp的片段）。使用Ion Library TaqMan Quantitation Kit構(gòu)建抽提后的cfDNA文庫(kù)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的濃度結(jié)果計(jì)算文庫(kù)稀釋比例，確保文庫(kù)混合后總體積>25 μL，終文庫(kù)總量>100 pmol/L。取稀釋后的子文庫(kù)等體積混合，加載于Ion 540 Kit-Chef芯片并測(cè)序。采用Torrent Suite Software 5.10.0軟件和Ion Reporter Software 5.10.1.0軟件（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作、樣本測(cè)序數(shù)據(jù)和變異位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)對(duì)結(jié)果作出解釋。

1.3.2 Miseq Dx二代測(cè)序平臺(tái) 比對(duì)方法為Miseq Dx二代測(cè)序平臺(tái)，由Fire fly建庫(kù)策略（上海安可濟(jì)生物科技有限公司）和Illumina二代測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）構(gòu)成。采用NGS檢測(cè)4個(gè)經(jīng)NCCN指南批準(zhǔn)的與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因（KRAS的2、3和4號(hào)外顯子，NRAS的2、3號(hào)外顯子，BRAF的15號(hào)外顯子，PIK3CA的9、20號(hào)外顯子）。

1.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.4.1 準(zhǔn)確性 采用結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)12份不同配比的商品化參考品和自制參考品，統(tǒng)計(jì)各參考品的突變位點(diǎn)及其檢出次數(shù)，并與預(yù)期結(jié)果比較，計(jì)算準(zhǔn)確度?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：最終用于計(jì)算的樣本須通過(guò)文庫(kù)和測(cè)序質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，與預(yù)期結(jié)果比較，準(zhǔn)確度應(yīng)≥90%。

1.4.2 精確性 取突變頻率為1.0%的自制參考品EPS3，檢測(cè)PIK3CAE545K、KRASG13D、TP53 S241F、BRAFV600E、TP53 R273H和PIK3CAH1047R。（1）批內(nèi)精密度：在同一次試驗(yàn)中重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算均值（x）、中位數(shù)（M）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。（2）批間精密度：連續(xù)檢測(cè)3 d，每次重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算x、M、s和CV。（3）重復(fù)性：分別由2位檢測(cè)人員進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)18次。（4）可接受標(biāo)準(zhǔn)：將cfDNA用Qubit dsDNA HS assay進(jìn)行定量檢測(cè)，同一操作者批內(nèi)定量結(jié)果的CV<20%，批間定量結(jié)果的CV<40%，cfDNA的提取回收率>30%。最終用于計(jì)算的樣本須通過(guò)文庫(kù)和測(cè)序質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，變異陽(yáng)性符合率和陰性符合率應(yīng)均為100%。

1.4.3 參考區(qū)間 結(jié)直腸癌相關(guān)體細(xì)胞基因突變參考區(qū)間為“未檢測(cè)到突變”。

1.4.4 可報(bào)告范圍 對(duì)于NGS可測(cè)定的基因區(qū)域，結(jié)直腸癌cfDNA panel共覆蓋14個(gè)基因（AKT1、ERBB2、NRAS、APC、FBXW7、PIK3CA、BRAF、GNAS、SMAD4、CTNNB1、KRAS、TP53、EGFR、MAP2K1）的242個(gè)熱點(diǎn)變異位點(diǎn)，主要為單堿基突變和插入缺失標(biāo)記。

1.4.5 用于抽提的最少樣本量 對(duì)1和2 mL起始量的血漿進(jìn)行提取，每份起始血漿樣本批內(nèi)重復(fù)提取3次，并與4 mL起始量的血漿比較?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：采用Qubit定量檢測(cè)提取后得到的cfDNA，從1、2、4 mL血漿樣本中提取的cfDNA量應(yīng)大致成比例增加，且cfDNA的回收率>30%。

1.4.6 cfDNA的最低檢測(cè)量 取正常人血漿樣本，分別加入10、20和50 ng的自制參考品EPS3（突變頻率為0.5%），檢測(cè)PIK3CAE545K、KRASG13D、TP53 S241F、BRAFV600E、TP53 R273H和PIK3CAH1047R突變，每份樣本重復(fù)檢測(cè)3次。可接受標(biāo)準(zhǔn)：最終用于計(jì)算的樣本須通過(guò)文庫(kù)和測(cè)序質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，變異陽(yáng)性符合率應(yīng)為100%，cfDNA最低檢測(cè)量應(yīng)在通過(guò)驗(yàn)證的最低值和最高值之間。

1.4.7 分析靈敏度 在分子檢測(cè)領(lǐng)域，分析靈敏度是指用該分子檢測(cè)技術(shù)能夠測(cè)到生物樣本中待測(cè)靶核酸分子的最低含量。對(duì)突變頻率為0.2%的自制參考品EPS3重復(fù)檢測(cè)20次。根據(jù)本平臺(tái)建議的最低檢測(cè)量為20 ng cfDNA，中位測(cè)序深度≥7 500×?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：最終用于計(jì)算的樣本須通過(guò)文庫(kù)和測(cè)序質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性檢出率應(yīng)≥95%。

1.4.8 分析特異性 在2份野生型和2份突變型（預(yù)期突變?yōu)锽RAFV600E，經(jīng)過(guò)微滴式數(shù)字PCR驗(yàn)證）血漿（4 mL）中分別加入10 000 mg/L血紅蛋白（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)SLBR9638V）、500 mg/L膽紅素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)SLBX1739）或2%脂肪乳（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)F17060801）。采用MagMAX Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit進(jìn)行抽提，檢測(cè)BRAFV600E突變。比較干擾物加入前后的檢測(cè)結(jié)果。

1.5 臨床應(yīng)用評(píng)估

分別采用結(jié)直腸癌cfDNA panel和Miseq Dx二代測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)17例晚期結(jié)直腸癌患者血漿中靶向藥物相關(guān)基因（AKT1、ERBB2、NRAS、APC、FBXW7、PIK3CA、BRAF、GNAS、SMAD4、CTNNB1、KRAS、TP53、EGFR、MAP2K1）的突變豐度，比較2種檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果的一致性。采用結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)22例初診未治結(jié)直腸癌患者血漿中靶向藥物相關(guān)基因的突變豐度，并與ARMS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。ARMS與本平臺(tái)共同覆蓋的位點(diǎn)為：KRAS的2、3、4號(hào)外顯子，NRAS的2、3號(hào)外顯子，PIK3CA的20號(hào)外顯子、BRAF的15號(hào)外顯子。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評(píng)估結(jié)果

2.1.1 準(zhǔn)確性 采用結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)商品化參考品和自制參考品EPS3，并與預(yù)期結(jié)果進(jìn)行比較，準(zhǔn)確性為99.97%，Kappa值為0.99。見(jiàn)表1。

表1 準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果 次

2.1.2 精確性 抽提精確性符合要求，且抽提所得樣本通過(guò)文庫(kù)和測(cè)序質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)檢測(cè)18次，對(duì)預(yù)期突變的檢出率均為100%。精確性符合要求。見(jiàn)表2。

表2 精確性結(jié)果

2.1.3 用于抽提的最少樣本量 對(duì)1、2和4 mL血漿進(jìn)行提取的總回收率分別為46.00%、45.90%和52.28%，且cfDNA的回收率均>30%，結(jié)果均能滿足要求。因此，最小樣本量為1 mL血漿。

2.1.4 cfDNA投入量 重復(fù)檢測(cè)3次突變頻率為0.5%的10 ng自制參考品EPS3，已知突變均可正確檢出。故最低檢測(cè)量為10 ng cfDNA。

2.1.5 分析靈敏度 采用結(jié)直腸癌cfDNA panel對(duì)突變頻率為0.2%的自制參考品EPS3重復(fù)檢測(cè)20次，6個(gè)基因突變位點(diǎn)（BRAFV600E、KRASG13D、PIK3CAE545K、PIK3CAH1047R、TP53 R273H、TP53 S241F）的陽(yáng)性檢出率為100%，故分析靈敏度為0.2%。由于本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)性能確認(rèn)的NGS檢測(cè)平臺(tái)的分析靈敏度均為0.2%，因此考慮到NGS的檢測(cè)性能，同時(shí)也為保持報(bào)告的一致性，本研究?jī)H驗(yàn)證突變頻率為0.2%的自制參考品EPS3。

2.1.6 分析特異性 2份野生型血漿樣本和2份突變型血漿樣本在干擾物加入前、后的突變檢出結(jié)果一致，定性結(jié)果一致率為100%。提示10 000 mg/L血紅蛋白、500 mg/L膽紅素或2%脂肪乳對(duì)結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)cfDNA無(wú)影響。見(jiàn)表3。

表3 分析特異性結(jié)果

2.2 臨床應(yīng)用評(píng)估

結(jié)直腸癌cfDNA panel與Miseq Dx 二代測(cè)序平臺(tái)共同覆蓋的基因?yàn)镵RAS、NRAS、BRAF、PIK3CA。采用2種檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定17例晚期結(jié)直腸癌患者血漿中靶向藥物相關(guān)基因的突變豐度，其中有16例患者2種檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果在共同覆蓋基因位點(diǎn)上一致，有1例患者的檢出結(jié)果雖一致，但結(jié)直腸癌cfDNA panel的檢測(cè)結(jié)果低于既定的檢測(cè)下限，故2種方法的一致性為94.12%（16/17），滿足臨床檢測(cè)的需求。其中檢出最多的突變位點(diǎn)為KRAS的2號(hào)外顯子，17例患者中出現(xiàn)了6例。見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)直腸癌cfDNA panel與Miseq Dx二代測(cè)序平臺(tái)的一致性

結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)22例結(jié)直腸癌患者血漿中靶向藥物相關(guān)基因突變豐度與ARMS檢測(cè)腫瘤組織的一致性為90.91%（20/22）。突變位點(diǎn)出現(xiàn)最多的基因?yàn)門P53、APC和KRAS，占總突變的62.22%。見(jiàn)圖2。

圖2 結(jié)直腸癌cfDNA panel與ARMS的一致性

3 討論

NCCN 2009年發(fā)布的結(jié)直腸癌診治指南推薦檢測(cè)晚期結(jié)直腸癌患者KRAS基因[10]；2010年發(fā)布的結(jié)直腸癌診治指南建議對(duì)KRAS基因野生型患者進(jìn)一步檢測(cè)BRAF基因V600E突變來(lái)預(yù)測(cè)患者是否可以從抗EGFR單克隆抗體治療中獲益[10]；2018年發(fā)布的結(jié)直腸癌診治指南建議，對(duì)所有伴有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行KRAS、NRAS、BRAF基因檢測(cè)，以指導(dǎo)用藥[11]。2019.V1版的NCCN結(jié)直腸癌診治指南新增BRAF基因作為指導(dǎo)治療的指標(biāo)和基于檢測(cè)EGFR的治療方法[12]。在結(jié)直腸癌患者中，NRAS基因總突變率約為3.9%[13]，因此NRAS基因的突變狀態(tài)對(duì)于結(jié)直腸癌患者靶向藥物治療的選擇同樣具有重要意義[14]。與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的經(jīng)典的原癌基因有BRAF、C-myc、PIK3CA、KRAS、NRAS、c-fos、c-jun、c-raf、src、abl、fps等[15]。與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的經(jīng)典的抑癌基因有APC、DCC、p53、PTEN、Rb、RUNX3、NDRG2、p16、DPC4、KLF6等[16]。

NCCN發(fā)布的結(jié)直腸癌診治指南強(qiáng)調(diào)了NGS對(duì)于結(jié)直腸癌相關(guān)突變基因聯(lián)合檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值，還有研究指出NGS在圍手術(shù)期ctDNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中的價(jià)值[17]。由此可見(jiàn)，NGS在結(jié)直腸癌臨床診療中可以為患者提供更加完善的個(gè)體化診療方案。

對(duì)比兩組患兒治療的臨床療效，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[2] ：顯效，患兒經(jīng)過(guò)相關(guān)治療后，臨床癥狀呼吸困難、咳嗽、喉鳴等顯著改善；有效，患兒經(jīng)過(guò)相關(guān)治療后，臨床癥狀呼吸困難、咳嗽、喉鳴等有一定改善，但未完全改善；無(wú)效，患兒經(jīng)過(guò)相關(guān)治療后，臨床癥狀呼吸困難、咳嗽、喉鳴等沒(méi)有任何好轉(zhuǎn)跡象，甚至加重；總有效率=顯效率+有效率。

與有商品化試劑的檢測(cè)項(xiàng)目不同，實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目在應(yīng)用于臨床前需要進(jìn)行更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)男阅艽_認(rèn)，包括開(kāi)展項(xiàng)目的應(yīng)用目的、樣本類型、采集和運(yùn)送樣本的程序、樣本拒收標(biāo)準(zhǔn)、臨床應(yīng)用指征以及方法的準(zhǔn)確性、精確性、分析靈敏度和抗干擾能力等。本研究主要對(duì)結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)結(jié)直腸癌相關(guān)基因突變的定性試驗(yàn)的各項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)估。

對(duì)于定性分析來(lái)說(shuō)，準(zhǔn)確性是指與比對(duì)試驗(yàn)或標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，采用自建的結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)商品化參考品和自制參考品EPS3的Kappa值為0.99，表明自建平臺(tái)準(zhǔn)確性極高；檢出3個(gè)假陰性結(jié)果，分別出現(xiàn)在貨號(hào)為HD817（突變頻率為0.2%）和貨號(hào)為0710-0672（突變頻率為0.2%）的商品化參考品中，其中有2個(gè)假陰性結(jié)果（未測(cè)得KRAS和PIK3CA突變）出現(xiàn)于同一個(gè)商品化參考品（貨號(hào)0710-0672）中，其余1個(gè)假陰性結(jié)果是在商品化參考品（貨號(hào)HD817）中檢出KRAS突變。由于這2個(gè)商品化參考品的突變頻率較低時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定的情況，因此結(jié)直腸癌cfDNA panel的檢測(cè)結(jié)果接近分析靈敏度時(shí)，應(yīng)考慮使用更加靈敏的數(shù)字PCR進(jìn)行復(fù)核。

與臨床常用的BEAMing等結(jié)直腸癌相關(guān)基因檢測(cè)技術(shù)相比，本研究使用的結(jié)直腸癌cfDNA panel可在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)上百億堿基的測(cè)序[18]，同時(shí)保持了高準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌cfDNA panel的分析靈敏度為0.2%，而具有相同分析靈敏度的高分辨率熔解曲線只能測(cè)定已知突變，且成本較高[19]。

本研究結(jié)果顯示，500 mg/L膽紅素和2%脂肪乳對(duì)結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)cfDNA均無(wú)干擾，雖然加入10 000 mg/L血紅蛋白后血漿樣本的抽提不受干擾，但樣本溶血后會(huì)導(dǎo)致基因組DNA被釋放入血，對(duì)于腫瘤細(xì)胞等體細(xì)胞突變陽(yáng)性結(jié)果的檢出有一定影響[20]，因此樣本出現(xiàn)溶血時(shí)建議重新采血進(jìn)行檢測(cè)。

由于不同NGS平臺(tái)的檢測(cè)原理不同，常會(huì)導(dǎo)致結(jié)果差異較大，因此本研究將結(jié)直腸癌cfDNA panel與Miseq Dx二代測(cè)序平臺(tái)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，17例晚期結(jié)直腸癌患者中有16例2種檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果一致，有1例雖檢出相同的突變，但由于結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)結(jié)果低于分析靈敏度而被排除，可能與該例樣本突變頻率較低，經(jīng)過(guò)凍存后突變頻率進(jìn)一步降低有關(guān)。因此，當(dāng)結(jié)直腸癌cfDNA panel的檢測(cè)結(jié)果低于檢出下限時(shí)，可以采用數(shù)字PCR進(jìn)行復(fù)核。

高潔等[21]等采用靶向NGS平臺(tái)Ion Torrent PGM檢測(cè)甲醛固定石蠟包埋結(jié)直腸癌組織標(biāo)本KRAS2號(hào)外顯子及擴(kuò)展RAS突變，并與Sanger測(cè)序和ARMS比對(duì)，結(jié)果顯示Ion Torrent PGM平臺(tái)與Sanger測(cè)序、ARMS的一致性為100%。提示NGS平臺(tái)在檢測(cè)靶向藥物相關(guān)基因突變時(shí)具有較好的檢測(cè)性能。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌cfDNA panel與ARMS的一致性為90.91%，其中有2例不符合，該2例樣本均為化療后采樣，腫瘤負(fù)荷和突變位點(diǎn)可能因化療而發(fā)生了變化。與ARMS相比，結(jié)直腸癌cfDNA panel投入量更小，可同時(shí)檢測(cè)多種突變，并可依據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)治療方案作出實(shí)時(shí)調(diào)整。

Miseq Dx二代測(cè)序平臺(tái)有橋式累計(jì)錯(cuò)誤、熒光信號(hào)干擾等不足[22]，而本研究使用的NGS平臺(tái)具有測(cè)序速度快、通量大、后續(xù)數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)潔等優(yōu)勢(shì)，且靈敏度和特異性均較好，因此適用于臨床常規(guī)檢測(cè)。此外，運(yùn)用NGS檢測(cè)基因突變可節(jié)省樣本與時(shí)間，性價(jià)比高，在結(jié)直腸癌相關(guān)基因突變檢測(cè)方面具有重要的臨床應(yīng)用前景。

有研究結(jié)果顯示，組織樣本與胸腔積液、腹腔積液樣本的基因突變檢出率相當(dāng)，且均高于血漿cfDNA的突變檢測(cè)率[23]。但本研究結(jié)果顯示，在22例初診結(jié)直腸癌患者的血漿樣本與組織樣本檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)中，除組織ARMS檢測(cè)未能覆蓋到的基因位點(diǎn)變異外，其他基因突變檢測(cè)結(jié)果均一致。提示檢測(cè)血漿cfDNA可以滿足臨床需求。

本研究采用結(jié)直腸癌cfDNA panel檢測(cè)結(jié)直腸患者血漿cfDNA，不僅可以作為組織樣本檢測(cè)的補(bǔ)充驗(yàn)證或?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)患者的療效及耐藥性變化，同時(shí)還可作為結(jié)直腸癌患者的初步篩查指標(biāo)。對(duì)于結(jié)直腸癌患者來(lái)說(shuō)，結(jié)直腸癌cfDNA panel可以進(jìn)行KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因聯(lián)合檢測(cè)，為臨床個(gè)體化靶向藥物治療提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。由于受到患者匹配度和檢測(cè)成本的限制，本研究用于驗(yàn)證的患者樣本數(shù)有限，后續(xù)將收集更多患者樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，結(jié)直腸癌cfDNA panel作為實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目，具有高準(zhǔn)確性、高特異性等優(yōu)勢(shì)，有助于結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化診療，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但由于我國(guó)目前尚無(wú)針對(duì)NGS咨詢的原則和操作規(guī)范，因此檢出基因突變后，如何向臨床醫(yī)生或患者進(jìn)行基因變異的解釋是臨床實(shí)驗(yàn)室面臨的難題，這需要在未來(lái)的實(shí)踐和研究中不斷總結(jié)。