一株高出酒率的粟酒裂殖酵母菌株的篩選及其在白酒釀造中的應(yīng)用研究

張明春，梁麗文，張夢陽，趙永威，劉蒲臨，繆禮鴻，王 霜

（1.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北松滋 434200；2.武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430023)

中國傳統(tǒng)白酒發(fā)酵是一種自然發(fā)酵的過程。前期通過制曲，曲塊自然老熟網(wǎng)羅周圍環(huán)境中的微生物，進(jìn)行第一次富集；酒醅進(jìn)行堆積和入池，進(jìn)行第二次富集。所形成的微生物群落比較復(fù)雜，包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌等。在醬香型白酒堆積和入池發(fā)酵過程中，酵母是重要的微生物類群，對揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生做出了重大貢獻(xiàn)，這些化合物決定著最終產(chǎn)品的整體質(zhì)量和風(fēng)味。

隨著對釀造過程中酵母菌的深層研究，較多的科研院所和酒廠將功能酵母添加到白酒發(fā)酵中，以期提高出酒率和豐富酒質(zhì)。余偉民等將酒用干酵母應(yīng)用于特香型白酒發(fā)酵，在不改變特香型白酒風(fēng)味的基礎(chǔ)上，白酒產(chǎn)量得到顯著提高，出酒率最高可達(dá)65%，總酸、總酯含量略微下降；董永勝等在白酒酒醅中篩選得到1 株可以在38 ℃和pH3.0 的基質(zhì)中表現(xiàn)出優(yōu)良發(fā)酵性能的酒精酵母，將之添加到固態(tài)白酒的生產(chǎn)中，酒精產(chǎn)量提高了30%；紀(jì)志軍等將耐高溫活性干酵母用于濃香型大曲酒生產(chǎn)，可提高淀粉出酒率1%～3%。在白酒釀造中，非釀酒酵母也有較多應(yīng)用，包括畢赤酵母、東方伊薩酵母、假絲酵母等。這類酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵能顯著改變酒體品質(zhì)，抑制發(fā)酵過程中一些腐敗微生物的繁殖。胡建華等從牛欄山酒酒醅中篩選出了l株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌株并將其應(yīng)用于生產(chǎn)，結(jié)果顯示，實驗組乙酸乙酯的含量比對照組提高109%，且香氣正、帶酯香、味柔、尾味凈。將釀酒酵母和非釀酒酵母混合應(yīng)用到白酒發(fā)酵中，不僅可以提高產(chǎn)物風(fēng)味復(fù)雜性，還可以加強(qiáng)獨特性。唐潔等研究了釀酒酵母和異常畢赤酵母混菌發(fā)酵對白酒液態(tài)風(fēng)味物質(zhì)的影響，結(jié)果顯示，這2 種菌混和發(fā)酵可以形成更多的酯類物質(zhì)，同時顯著提高其風(fēng)味特性；許玲從芝麻香酒醅中分離篩選得到8 株生香酵母菌株，選取4 株優(yōu)良菌株添加到白酒發(fā)酵中，乙酸乙酯含量提高了1.99 倍，己酸乙酯提高了1.09倍，戊酸乙酯提高了1.24倍；任道群等從濃香型大曲中篩選出4 株優(yōu)良微生物：糖化菌A2-3 和LZ-24、酯化菌R-3、發(fā)酵菌S2，將4 株菌株組合強(qiáng)化到大曲中運用到釀造過程中，可使出酒率提高10.9%，己酸乙酯增加15.7%。

在白酒釀造中，將酵母菌、霉菌和細(xì)菌等進(jìn)行混合發(fā)酵，同只添加酵母菌劑相比，多菌混合能顯著豐富酒體，或可以代謝提高某類有益風(fēng)味物質(zhì)的含量，或可以分解一些異味物質(zhì)，或可以促進(jìn)酵母的生產(chǎn)代謝，最終改變發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特征。趙素芬等初步探索了混合菌劑在醬香型白酒的應(yīng)用，結(jié)果表明，以嗜熱芽孢桿菌和酵母菌制成的麩曲，具有降低糧耗、縮短發(fā)酵時間等優(yōu)點；胡建華等從清香大曲及酒醅中篩選出13株釀酒微生物，包括根霉、釀酒酵母、芽孢桿菌，將其單獨制作成麩曲，以一定比例代替大曲添加到酒醅中，所得基酒的總酸、總酯含量顯著增高，出酒率也得到一定提高；艾金忠等在二鍋頭原酒生產(chǎn)中同時使用高酯化酶活性紅曲霉和生香酵母，延長發(fā)酵周期，結(jié)果表明，總酯的含量平均提高了0.409 g/L，乙酸乙酯的含量平均提高了0.309 g/L，同時原酒的風(fēng)格典型性得到了提高；張東平等從清香大曲和酒醅中分離篩選到高糖化酶活力根霉2 株，高發(fā)酵力酵母1株，將其制成麩曲，添加到牛欄山酒釀造中，出酒率從17 %提高到25.3 %，同時還起到了“增乙降乳”的效果。

本研究對分離自白云邊不同輪次酒醅中的7株酵母菌進(jìn)行發(fā)酵性能比較，篩選出1 株具良好發(fā)酵能力的酵母菌Scc7，并對純種及混合發(fā)酵效果進(jìn)行分析，優(yōu)化得到發(fā)酵效果好的方案。將Scc7 制成固態(tài)復(fù)合功能菌劑替代一定比例的大曲，一方面能減少大曲用量降低企業(yè)生產(chǎn)成本，另一方面可提高發(fā)酵產(chǎn)酒率和酒質(zhì)，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究所使用菌株及來源如表1所示。

表1 本研究所使用酵母菌株

1.2 培養(yǎng)基

YPD 液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，水1000 mL，115 ℃滅菌20 min。

同化碳源基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基：碳源2 %，七水硫酸鎂0.05%，酵母粉0.02%，硫酸二胺0.5%，瓊脂1.5%～2%，水1000 mL，115 ℃滅菌20 min。

高粱糖化液培養(yǎng)基：粉碎50 g高粱，加入180 mL蒸餾水使淀粉含量在18 %左右，65 ℃水浴糊化30 min，92 ℃水浴，按15 U/g 淀粉加入液化酶液化90 min，冷卻后調(diào)pH 4.0～4.5,然后65 ℃水浴，按150 U/g 淀粉加入糖化酶糖化30 min，冷卻后待接種。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母菌耐高溫能力的測定

將酵母菌在YPD 瓊脂平板上劃線接種，分別置于37 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃和47 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，取出平板觀察生長狀況并記錄。

1.3.2 酵母菌碳源利用實驗

本研究選取單糖：葡萄糖；雙糖：蔗糖；三糖：D-棉子糖；五碳糖：D-木糖；六碳糖：D-半乳糖；醇類：甘油。在同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以這6 種不同的糖為唯一的碳源，接種各酵母菌，于35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察生長情況并記錄。

1.3.3 高粱糖化液制備與發(fā)酵

YPD 平板活化酵母菌，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，單菌落長出后，接種于YPD 液體培養(yǎng)基，170 r/min 搖床18 h，按2 %接種量接種于高粱糖化液培養(yǎng)基中，28 ℃靜置發(fā)酵3 d后，蒸餾發(fā)酵液。蒸餾方法：將發(fā)酵液（約220 mL）蒸出30 mL，過濾后進(jìn)氣相色譜分析。Scc7 與標(biāo)準(zhǔn)菌株1056 高粱糖化液酒精發(fā)酵比較時，則是將發(fā)酵液（約220 mL）蒸出100 mL，過濾進(jìn)氣相色譜分析。

1.3.4 酵母功能菌劑的制備

YPD 平板活化酵母菌，于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，單菌落長出后，接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，于搖床170 r/min、35 ℃培養(yǎng)18 h，按20 %的接種量接入已滅菌的麩皮基質(zhì)中，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵30 h，中間攪拌1 次。烘干至水分降低至13%左右。計活菌數(shù)，裝袋低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 霉菌菌劑制備

將分離自白云邊酒高溫大曲中的根霉菌用YPD 瓊脂平板活化，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，菌落長出后，接種于YPD 液體培養(yǎng)基中（種子瓶），于搖床170 r/min、30 ℃培養(yǎng)18 h，按4 mL 的接種量接入每1 L 三角瓶中裝有150 g 已滅菌的麩皮中，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h，每24 h 攪拌1 次。于無菌烘箱中烘至水分降低到13 %左右，裝袋低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 固態(tài)發(fā)酵條件

使用溫度大于90 ℃的水澆淋燜糧3 次，每次30 min。蒸糧90～120 min，使含水量保持在55 %左右。將曲粉或曲粉與菌劑混合物以10%的比例添加到冷卻至室溫的高粱中混合均勻。將混合均勻的原料置于大塑料袋中模擬堆積發(fā)酵過程?？刂贫逊e溫度，使其前24 h 維持在37 ℃，然后升溫至42 ℃保持12 h，最后升溫至50 ℃維持12 h。模擬堆積發(fā)酵結(jié)束后，將堆積原料分裝于玻璃瓶中，28 ℃恒溫進(jìn)行厭氧酒精發(fā)酵。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌株的溫度耐受性

本實驗所采用酵母菌株在37 ℃下均生長較好（表2）。在39 ℃下，除有孢圓酵母Toc7 和假絲酵母Cac6外，其他6 株酵母生長較好。固態(tài)白酒發(fā)酵的堆積過程中，堆積料中心的溫度往往可以達(dá)到50～60 ℃，這就需要制備菌劑的酵母具有一定的耐高溫能力。在42 ℃高溫下，Pic3、Pic5、Isc5、Sac5和Scc7 這5 株酵母均可以生長，適合物料堆積的高溫發(fā)酵階段。

表2 不同酵母菌的溫度耐受性

2.2 不同酵母菌碳源同化能力

從表3 可知，所有酵母菌均對葡萄糖展現(xiàn)出了較好的同化利用能力。Pic3 和Isc5 碳源譜較廣，生長旺盛，其次為Sac5、zyr5 和Toc7。Scc7 不能利用木糖、半乳糖和甘油；除葡萄糖外，Cac6 僅在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上有明顯生長。

表3 酵母菌對不同碳源的同化利用能力

2.3 不同酵母菌高粱糖化液發(fā)酵實驗

氣相色譜研究表明（表4），8 株酵母菌高梁糖化液產(chǎn)酒精能力差異較大，發(fā)酵液中酒精度大小為Scc7＞Sac5＞Pic3＞Isc5＞To7＞Cac6＞Zyr5。其中，Scc7 的酒精度為16.9%vol，僅比安琪釀酒酵母的低0.5%vol。產(chǎn)正丙醇方面，除Pic5 不產(chǎn)正丙醇外，剩余菌株產(chǎn)正丙醇能力依次為Zyr5＞Sac5＞Isc5＞Toc7＞Pic3＞Cac6＞Scc7。8 株酵母中，僅有Toc7、Isc5 產(chǎn)乳酸乙酯，其他6 株均不產(chǎn)生乳酸乙酯。結(jié)合8 株酵母的耐高溫能力，綜合比較，Scc7、Sac5、Pic3、Isc5 和Toc7 這5 株酵母各有優(yōu)點，因此制成純種菌劑后進(jìn)一步比較對白酒風(fēng)味的影響。

表4 不同酵母菌在高粱糖化液中的發(fā)酵研究

2.4 5種酵母菌株的固態(tài)發(fā)酵實驗

在最佳培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)Scc7、Sac5、Pic3、Isc5和Toc7，制備得到菌劑后添加到蒸煮后高粱中，實驗室模擬固態(tài)白酒發(fā)酵。氣相結(jié)果見表5。

表5 5種酵母菌劑的純種固態(tài)發(fā)酵氣相結(jié)果

5 種酵母菌株固態(tài)發(fā)酵后其酒精度大小為Scc7＞Toc7＞Sac5＞Pic3＞Isc5；正丙醇含量依次為Sac5＞Toc7＞Pic3＞Scc7＞Isc5；乙酸乙酯的含量大小為Sac5＞Scc7＞Pic3。這5 株酵母添加到發(fā)酵過程中均不產(chǎn)生乳酸乙酯。其中，Scc7菌劑添加后，酒精度最高，乙酸乙酯含量也較高，同時，正丙醇含量低；Pic3 菌劑添加后，酒精度比添加Scc7 菌劑低0.8%vol，乙酸乙酯含量相當(dāng)。Scc7 菌劑在提高出酒率和改善酒質(zhì)方面都有較好效果。

2.5 Scc7發(fā)酵性能與1056、TRADY的比較研究

粟酒裂殖酵母Scc7、粟酒裂殖酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株cicc1056 和安琪釀酒酵母TRADY 分別進(jìn)行液態(tài)純種發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行氣相色譜分析。從表6 可以看出，Scc7 發(fā)酵乙醇產(chǎn)量與TRADY 差別不大，與粟酒裂殖酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株cicc1056 相比提高了16.25 %±1.36 %；Scc7 發(fā)酵正丙醇產(chǎn)量較安琪釀酒酵母低43.64%±3.36%，異戊醇產(chǎn)量較安琪釀酒酵母明顯下降，醋酉翁（3-羥基丁酮）產(chǎn)量明顯較cicc1056 和安琪釀酒酵母高。上述結(jié)果表明，Scc7 菌株具有較高的產(chǎn)酒精能力，與安琪釀酒酵母相當(dāng)，發(fā)酵產(chǎn)高級醇總量（正丙醇、異丁醇、異戊醇等）較安琪釀酒酵母有所下降，且Scc7具有一定的產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)-醋酉翁（3-羥基丁酮）的能力，通過比較可以發(fā)現(xiàn)Scc7 是一株具有高產(chǎn)乙醇、低產(chǎn)高級醇和提高白酒中風(fēng)味成分含量能力的優(yōu)質(zhì)酵母菌株。

表6 Scc7、cicc1056和TRADY發(fā)酵性能對比 (mg/L)

2.6 大曲和Scc7功能菌劑混合固態(tài)白酒發(fā)酵

以大曲用量30%的比例加入Scc7 菌劑同1 個月大曲混合發(fā)酵與4 個月大曲發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，添加大曲及大曲、菌劑混合發(fā)酵，酒精度大小依次為1 個月＋Scc7＞4 個月＞1 個月（圖1a）。其中，1 個月＋Scc7 菌劑的酒精度較4 個月提高了20.8%，較1 個月提高了55.5%。正丙醇含量大小依次為4 個月＞1 個月＞1 個月＋Scc7（圖1b）。其中，1 個月＋Scc7 菌劑的正丙醇含量較4 個月降低了57.78%，較1 個月降低了48.49%。乙酸乙酯含量大小依次為4 個月＞1 個月＋Scc7＞1 個月（圖1c）。其中，添加Scc7 菌劑后乙酸乙酯的含量較1個月高，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于4個月樣本。

圖1 大曲和Scc7功能菌劑混合固態(tài)發(fā)酵后關(guān)鍵參數(shù)的比較

以大曲用量的20%加入Scc7 菌劑、5%的霉菌菌劑同一個月大曲混合發(fā)酵比較。添加大曲及大曲、菌劑混合堆積發(fā)酵，酒精度大小依次為1 個月＋根霉＋Scc7＞4 個月＞1 個月（圖2a）。其中，1個月＋根霉＋Scc7 菌劑的酒精度較4 個月提高了1.7%，較1 個月提高了32.02%。添加1 個月大曲、酵母菌劑和霉菌菌劑的酒醅其正丙醇含量最高（圖2b），較4 個月提高了29.2 %，較1 個月提高了82.6%。添加1個月大曲＋Scc7菌劑＋霉菌菌劑的酒醅其乙酸乙酯含量最高（圖2c），較4 個月提高了25.8%。

圖2 大曲、Scc7和根霉功能菌劑混合固態(tài)發(fā)酵后關(guān)鍵參數(shù)的比較

3 總結(jié)

對酒醅中分離得到的7 株不同種的優(yōu)勢菌株進(jìn)行比較，畢赤酵母Pic3、東方伊薩酵母Isc5、釀酒酵母Sac5 和粟酒裂殖酵母Scc7 可以耐受42 ℃的高溫，以高粱糖化液為發(fā)酵培養(yǎng)基，Scc7 的產(chǎn)乙醇能力最強(qiáng)，同市售的安琪釀酒酵母相當(dāng)，同時產(chǎn)正丙醇最低。同標(biāo)準(zhǔn)菌株1056 相比，Scc7 耐乙醇能力更強(qiáng)，在以高粱糖化液為發(fā)酵培養(yǎng)基時酒精度提高了8.7%，乙酸乙酯含量提高了22.2%，正丙醇含量降低了9.9%，同時產(chǎn)3-羥基丁酮。將Scc7 菌劑按總添加量30 %的比例同1 個月大曲混合添加到模擬白酒發(fā)酵過程中，酒精度較只添加1 個月大曲提高了55.5 %，較只添加4 個月大曲提高了20.8 %；正丙醇含量較只添加1 個月大曲降低了48.49 %，較只添加4 個月的大曲降低了57.78 %。實驗結(jié)果表明，以該菌株制備的功能菌劑顯示了在白酒釀造中具有潛在的應(yīng)用價值。