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    四氫姜黃素經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)人血小板活化和聚集的調(diào)控作用

    2022-07-29 02:40:30馬永潔李瑋琪張春梅牙甫禮
    食品科學(xué) 2022年13期
    關(guān)鍵詞:凝血酶姜黃孵育

    馬永潔,李瑋琪,張春梅,普 俊,牙甫禮,3,*

    (1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,云南 大理 671000;2.河口海關(guān),云南 河口 661300;3.大理大學(xué)代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,云南 大理 671000)

    心血管疾病已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)致死率最高的疾病。血小板作為動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成的關(guān)鍵細(xì)胞介質(zhì),在心血管疾病的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。在某些病理情況下,如高脂血癥、冠心病等,患者循環(huán)血液中的血小板可被凝血酶和二磷酸腺苷等可溶性激動(dòng)劑激活,活化的血小板會(huì)釋放一系列的內(nèi)容物,進(jìn)而參與促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成和發(fā)展。這些內(nèi)容物主要分為3 類,包括α顆粒、致密顆粒和溶酶體顆粒。其中,血小板α顆粒的含量最為豐富,包括膜結(jié)合蛋白CD62P、CD40L等,以及可溶性蛋白如血小板因子-4(platelet factor-4,PF4)、趨化因子配體-5(chemokine ligand 5,CCL5)、-球蛋白等,這些炎癥分子可促進(jìn)血小板聚集,募集并活化白細(xì)胞。此外,ATP、二磷酸腺苷、鈣離子和焦磷酸鹽是致密顆粒的重要內(nèi)容物,對(duì)于介導(dǎo)血小板-白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間的炎癥反應(yīng)起重要作用。血小板溶酶體顆??赏ㄟ^膜蛋白(如CD63)和一些水解酶(如葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶等)參與血小板的活化和聚集。大量的研究證實(shí),控制血小板活化是抑制動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成、防治心血管疾病發(fā)生發(fā)展的有效策略之一。

    膳食營養(yǎng)干預(yù)是預(yù)防心血管疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵途徑之一。姜黃素是一種天然活性多酚類化合物,主要來源于姜科植物根莖。研究表明,姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗癌和保護(hù)心血管等多種生物學(xué)活性。然而,膳食補(bǔ)充姜黃素時(shí),其生物利用度較低(通常小于1%),這是限制其臨床應(yīng)用的主要因素之一。研究表明,姜黃素經(jīng)口攝入后,在腸道微生物的作用下迅速轉(zhuǎn)化為各種代謝物,例如二氫姜黃素、四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin,THC)、六氫姜黃素、八氫姜黃素等。其中,THC被認(rèn)為是最重要、也是活性最高的腸道代謝物,由于具有較高的生物利用度和穩(wěn)定性,THC可能有潛力開發(fā)成為預(yù)防或者治療許多慢性疾病的重要物質(zhì)。本課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明,膳食補(bǔ)充THC在緩解小鼠過敏性哮喘方面要優(yōu)于姜黃素。在血小板功能的調(diào)控方面,Mayanglambam等研究發(fā)現(xiàn),姜黃素在體外能抑制血小板的活化;本課題組前期的體外實(shí)驗(yàn)也表明姜黃素可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的血小板凋亡。但是,THC對(duì)血小板活化和聚集的影響尚不清楚,本研究旨在探討THC對(duì)人血小板活化和聚集的影響及其可能的分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    THC、凝血酶、Fluo-4/AM、熒光素酶試劑美國Sigma-Aldrich公司;FITC偶聯(lián)的鼠抗人CD62P抗體、FITC偶聯(lián)的鼠抗人CD63抗體、CCL5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 美國eBioscience公司;PF4商用ELISA試劑盒美國R&D Systems公司;細(xì)胞毒性檢測試劑盒美國Roche公司;磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、一抗phospho-PI3K(Tyr)、phospho-Akt(Ser)、Akt、-actin、二抗羊抗兔美國Cell Signaling Technology公司;PI3K的激動(dòng)劑740 Y-P 美國Selleck Chemical公司;瓊脂糖凝膠CL-2B美國Sigma公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    低溫冰箱 青島海爾有限公司;CytoFlex流式細(xì)胞儀 美國Beckman Coulter公司;低溫高速離心機(jī)德國Eppendorf公司;多功能酶標(biāo)儀 德國BMG LABTECH公司;血小板聚集儀 北京泰利康信科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 研究對(duì)象的篩選

    研究對(duì)象從大理大學(xué)校內(nèi)招募,要求是年齡在25~40 歲之間的健康成人。如果志愿者現(xiàn)在或曾經(jīng)患有心血管疾病、惡性腫瘤、免疫缺陷病等病史,或?yàn)E用藥物、酗酒、吸煙半年以上,或在兩周內(nèi)服用過抗血小板的藥物(如阿司匹林等),或補(bǔ)充維生素等膳食營養(yǎng)補(bǔ)充劑,則不被納入作為本研究的研究對(duì)象。所有志愿者均自愿參與該項(xiàng)目,并均簽署書面知情同意書。

    1.3.2 健康人血樣及純化血小板的制備過程

    在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下,通過靜脈穿刺的方法,抽取并制備枸櫞酸鈉抗凝全血,然后300×、22 ℃離心7 min,血液分3 層,從下往上依次為紅細(xì)胞層、白細(xì)胞層和富血小板血漿層,為了避免吸到白細(xì)胞層,小心吸取并收集上層約2/3的富血小板血漿。將富血小板血漿慢慢滴入裝有瓊脂糖凝膠CL-2B的層析柱,可從富血小板血漿中分離得到純度高(98%以上)、結(jié)構(gòu)完整的純化血小板(即血小板懸液),具體方法參照文獻(xiàn)[10,22-23]。本研究完全按照《赫爾辛基宣言》相關(guān)準(zhǔn)則進(jìn)行,并已通過大理大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

    1.3.3 血小板乳酸脫氫酶漏出率的測定

    采用細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定血小板乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的漏出率,并以該指標(biāo)來評(píng)價(jià)THC對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響。首先,取健康人純化血小板與不同濃度的THC(0.1、0.5、1、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L,溶劑為0.05%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)或溶劑對(duì)照(0.05%DMSO)預(yù)孵育40 min,然后離心(12 000×、5 min、22 ℃),用酶標(biāo)儀測定上清液在490 nm波長處的吸光度()。同時(shí),將10%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate,SDS)作為陽性對(duì)照組,也與血小板共同孵育40 min,用來刺激血小板全部釋放LDH,相同條件下測定490 nm波長處的吸光度()。血小板LDH漏出率按式(1)計(jì)算。

    1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組

    本研究涉及的實(shí)驗(yàn)組別有:1)靜息組:指不經(jīng)任何處理的血小板懸液,既不經(jīng)凝血酶激活,也不經(jīng)DMSO處理;2)模型組:即溶劑對(duì)照組(血小板懸液中加入0.05% DMSO,下同);3)THC組:血小板懸液中分別加入0.5、1、10 μmol/L THC。除了靜息組以外,模型組和THC組的血小板均經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)活化。

    1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)測定血小板表面CD62P和CD63的表達(dá)量

    純化血小板(5×10個(gè)/mL)與不同濃度的THC(0.5、1、10 μmol/L)或溶劑對(duì)照在室溫下共同孵育40 min,用FITC偶聯(lián)的鼠抗人CD62P抗體或CD63抗體標(biāo)記血小板20 min,然后在1 mmol/L Ca存在的條件下,用凝血酶(酶活力不低于2 000 NIH Units/mg蛋白)激活血小板2 min,而靜息組血小板無需凝血酶激活,然后用體積分?jǐn)?shù)1%的多聚甲醛溶液固定,最后利用CytoFLEX流式細(xì)胞儀測定血小板表面CD62P和CD63的表達(dá)量。

    1.3.6 血小板PF4和CCL5釋放量的測定

    用PF4和CCL5的商業(yè)ELISA試劑盒測定血小板PF4和CCL5的釋放水平,具體方法參照制造商提供的說明書進(jìn)行。純化血小板(1×10個(gè)/mL)與不同濃度的THC(0.5、1、10 μmol/L)或溶劑對(duì)照預(yù)孵育40 min,然后在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板2 min。在12 000×、4 ℃的條件下離心5 min,收集上清液,用ELISA試劑盒的方法測定上清液中PF4和CCL5水平。當(dāng)探討PI3K/Akt信號(hào)通路在THC調(diào)控PF4和CCL5釋放中的作用時(shí),實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)組,即靜息組、模型組、THC(10 μmol/L)組以及THC+740 Y-P組,其中THC+740 Y-P組為THC(10 μmol/L)和PI3K的激動(dòng)劑740 Y-P(25 μg/mL)與血小板共同孵育40 min,除了靜息組外,各組血小板用凝血酶激活,然后分別檢測這4個(gè)組中血小板PF4和CCL5的釋放水平。

    1.3.7 血小板ATP釋放量和血小板最大聚集率的測定

    將人純化血小板(2.5×10個(gè)/mL)與不同濃度的THC(0.5、1、10 μmol/L)或溶劑對(duì)照預(yù)處理40 min,然后加入熒光素酶試劑與血小板共同孵育2 min,在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板,利用血小板聚集儀記錄ATP釋放量和血小板最大聚集率,THC組聚集抑制率按公式(2)計(jì)算,由自帶軟件生成THC組聚集抑制率(與模型組相比)隨THC濃度變化的曲線并計(jì)算出血小板最大聚集的半數(shù)抑制率。具體方法參照文獻(xiàn)[24]。探討PI3K/Akt信號(hào)通路在THC調(diào)控血小板聚集中的作用時(shí),實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)組,即靜息組、模型組、THC(10 μmol/L)組、740 Y-P組以及THC+740 Y-P組,其中740 Y-P組為血小板懸液用PI3K的激動(dòng)劑740 Y-P(25 μg/mL)孵育40 min,THC+740 Y-P組為THC(10 μmol/L)和740 Y-P(25 μg/mL)一同與血小板共同孵育40 min,除了靜息組外,各組血小板用凝血酶激活,然后檢測血小板最大聚集率。

    1.3.8 血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的測定

    將純化血小板懸液與Fluo-4/AM(0.2 μg/mL)在37 ℃避光孵育30 min 后,離心(3 000×、5 min、37 ℃)沉淀血小板,洗滌后重懸血小板,調(diào)整血小板濃度至3×10個(gè)/mL,然后與不同濃度的THC在37 ℃避光孵育40 min,使用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板2 min,然后利用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為520 nm的條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測定,并計(jì)算各組的熒光強(qiáng)度與靜息組的熒光強(qiáng)度的比值(即Fluo-4熒光強(qiáng)度比值),以此表征血小板內(nèi)鈣離子濃度。

    1.3.9 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

    將人純化血小板(2.5×10個(gè)/mL)與不同濃度的THC(0.5、1、10 μmol/L)或溶劑對(duì)照在體外共同孵育40 min,在1 mmol/L Ca存在的條件下用0.5 U/mL的凝血酶激活血小板5 min后,離心(12 000×、15 min、4 ℃),棄上清液,在冰上用細(xì)胞裂解液對(duì)血小板裂解30 min,然后離心(12 000×、15 min、4 ℃),收集上清液得到血小板蛋白,測定蛋白濃度后,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,檢測血小板PI3K、Akt蛋白及其磷酸化表達(dá)水平。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件通過單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,采用Newman-Keuls test法進(jìn)行組間兩兩比較,雙側(cè)<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同時(shí)采用GraphPad Prism 5.0軟件制圖。所有實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果至少來自3個(gè)獨(dú)立的志愿者樣本。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 THC對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響

    如圖1所示,與陽性對(duì)照組(10% SDS)相比,溶劑對(duì)照組(0.05% DMSO)以及不同濃度的THC(0.1~320 μmol/L)組中血小板的LDH漏出率高度顯著降低(<0.001)。THC在0.1~80 μmol/L的濃度范圍內(nèi)LDH漏出率與溶劑對(duì)照組相比無顯著差異(>0.05),因此可以認(rèn)為,在這個(gè)濃度范圍內(nèi),THC對(duì)健康人純化血小板無明顯的細(xì)胞毒性作用。但是160 μmol/L和320 μmol/L濃度的THC呈現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性作用,因?yàn)槠銵DH漏出率與對(duì)照組相比顯著或極顯著升高(<0.05、<0.01)。另外,綜合對(duì)比其他研究報(bào)道中所用THC濃度,最終選擇0.5、1 μmol/L和10 μmol/L進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

    圖1 THC對(duì)血小板細(xì)胞毒性的影響Fig. 1 Cytotoxic effect of THC on platelets

    2.2 THC對(duì)血小板CD62P的表達(dá)量以及PF4和CCL5釋放量的影響

    如圖2A所示,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,與模型組相比,1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC可分別顯著(<0.05)和高度顯著(<0.001)抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板表面CD62P的表達(dá),低濃度(0.5 μmol/L)的THC并不能顯著抑制CD62P的表達(dá)(>0.05)。如圖2B、C所示,與模型組相比,凝血酶誘導(dǎo)的血小板PF4的釋放水平也被1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC顯著抑制(<0.05、<0.001);10 μmol/L濃度的THC可極顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板CCL5的分泌(<0.01)。以上實(shí)驗(yàn)說明中、高濃度THC可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板α顆粒的釋放。

    圖2 THC對(duì)血小板表面CD62P表達(dá)量(A)以及PF4(B)和CCL5(C)釋放的影響Fig. 2 Effect of THC on platelet surface expression of CD62P (A) and the release of PF4 (B) and CCL5 (C)

    2.3 THC對(duì)血小板ATP釋放量和胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

    如圖3所示,與模型組相比,1 μmol/L和10 μmol/L濃度的THC可極顯著降低凝血酶誘導(dǎo)的血小板ATP釋放水平和胞內(nèi)鈣離子濃度(<0.01),但是0.5 μmol/L的THC并不能顯著降低ATP釋放量和胞內(nèi)鈣離子濃度(>0.05)。THC對(duì)ATP釋放水平和胞內(nèi)鈣離子的抑制作用在1 μmol/L濃度組和10 μmol/L濃度組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(>0.05)。以上結(jié)果說明中、高濃度THC可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板致密顆粒的釋放。

    圖3 THC對(duì)血小板ATP釋放量(A)和胞內(nèi)鈣離子濃度(B)的影響Fig. 3 Effect of THC on platelet ATP release (A) and intracellular calcium concentrations (B)

    2.4 THC對(duì)血小板CD63表達(dá)的影響

    如圖4所示,流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,凝血酶可明顯促進(jìn)血小板表面CD63的表達(dá),10 μmol/L濃度的THC高度顯著抑制血小板表面CD63的表達(dá)(<0.001),但是0.5 μmol/L和1 μmol/L濃度的THC并不能顯著抑制CD63的表達(dá)(>0.05)。以上結(jié)果說明10 μmol/L THC可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板溶酶體顆粒的釋放。

    圖4 THC對(duì)血小板表面CD63表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of THC on platelet surface expression of CD63

    2.5 THC對(duì)血小板聚集的影響

    如圖5A所示,與模型組相比,1 μmol/L和10 μmol/L的THC均可高度顯著降低凝血酶誘導(dǎo)的血小板最大聚集率(<0.001),而且兩組的血小板最大聚集率之間無顯著差異(>0.05)。0.5 μmol/L的THC對(duì)血小板最大聚集率與模型組相比無顯著差異(>0.05)。THC在0.1~20 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)血小板最大聚集抑制率的影響見圖5B,THC在0.5~10 μmol/L濃度范圍內(nèi),血小板最大聚集抑制率隨著濃度的增加而升高,THC抑制血小板最大聚集的半數(shù)抑制濃度為(0.74±0.03)μmol/L。

    圖5 THC對(duì)血小板聚集的影響Fig. 5 Effect of THC on platelet aggregation

    2.6 THC對(duì)血小板PI3K/Akt信號(hào)通路活化的影響

    如圖6所示,凝血酶可明顯促進(jìn)血小板PI3K(Tyr)和Akt(Ser)發(fā)生磷酸化。與模型組相比,0.5、1 μmol/L和10 μmol/L的THC均可顯著下調(diào)凝血酶誘導(dǎo)的血小板PI3K的磷酸化水平(<0.01、<0.001、<0.001),其中1 μmol/L和10 μmol/L THC兩組間則無顯著差異(>0.05)。與模型組相比,凝血酶誘導(dǎo)的血小板Akt磷酸化水平可被1 μmol/L和10 μmol/L的THC所抑制(<0.05、<0.001),而且兩組之間無顯著差異(>0.05)。以上結(jié)果說明THC可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板PI3K/Akt信號(hào)通路的活化。

    圖6 THC對(duì)血小板PI3K/Akt信號(hào)通路活化的影響Fig. 6 Effect of THC on platelet PI3K/Akt signaling pathway

    2.7 THC經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)血小板活化和聚集的影響

    如圖7所示,PI3K的特異性激動(dòng)劑740 Y-P可部分逆轉(zhuǎn)THC對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板PF4和CCL5的釋放和血小板聚集的抑制作用,因?yàn)門HC+740 Y-P組相對(duì)于單獨(dú)的THC(10 μmol/L)組血小板PF4和CCL5的釋放水平以及血小板最大聚集率顯著或極顯著升高(<0.05、<0.01),但是相對(duì)于模型組顯著降低(<0.05、<0.01)。說明THC對(duì)血小板活化和聚集的影響與其下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

    圖7 THC經(jīng)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)血小板活化和聚集的影響Fig. 7 THC regulated platelet activation and aggregation through PI3K/Akt signaling pathway

    3 討 論

    血小板異?;罨途奂纱龠M(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成,在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。膳食補(bǔ)充姜黃素可發(fā)揮抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成和保護(hù)心血管疾病的作用,但是具體機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),姜黃素的主要腸道代謝物THC在體外可顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化和聚集,提示THC在抗血小板高反應(yīng)性方面具有潛在的實(shí)用價(jià)值。

    研究已經(jīng)證實(shí),心血管疾病患者循環(huán)血液中高濃度的凝血酶和二磷酸腺苷等可直接激活血小板,活化的血小板分泌大量的顆粒物質(zhì),內(nèi)含有重要的炎癥因子,這些因子是介導(dǎo)血小板-白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)。例如,活化的血小板表面可表達(dá)大量的CD62P,CD62P是α顆粒中最重要的分子之一,它可通過與白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)相結(jié)合發(fā)揮直接與白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附的作用,進(jìn)而使白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生活化,并促進(jìn)其凋亡,這對(duì)于血小板促進(jìn)早期的動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成極為關(guān)鍵。研究表明,血小板基因敲除小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成量顯著減少,這與基因敲除小鼠中血小板-白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間的相互黏附受到抑制密切相關(guān)。另外,血小板分泌的PF4和CCL5可促進(jìn)血小板活化和聚集,并能募集單核細(xì)胞到達(dá)損傷的血管內(nèi)皮處,并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化和分化。Mayanglambam等通過體外研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可顯著抑制膠原誘導(dǎo)的血小板表面CD62P的表達(dá)和血小板聚集反應(yīng),但是其腸道代謝物THC對(duì)血小板活化和聚集的影響尚鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果表明,THC可顯著抑制血小板活化,如抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板表面CD62P和CD63的表達(dá),同時(shí)抑制血小板PF4、CCL5和ATP的釋放。這些對(duì)于THC抑制動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成,以及防治心血管疾病發(fā)展可能具有重要意義,但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,THC對(duì)血小板活化和聚集、血小板-白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用和動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的影響仍值得進(jìn)一步探討。

    調(diào)控血小板活化和聚集的分子機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,研究表明,PI3K/Akt信號(hào)通路在其中起重要作用。當(dāng)血小板受到激動(dòng)劑激活時(shí),引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高,進(jìn)而促進(jìn)下游PI3K/Akt信號(hào)通路的活化,從而進(jìn)一步激活血小板整合素αIIbβ3的活化,引起血小板顆粒物的釋放和血小板聚集增加。通過敲除血小板基因或者,則使血小板不能很好地發(fā)生活化和聚集。PI3K/Akt信號(hào)通路在THC抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化中起重要作用,但是其在THC調(diào)控血小板功能方面的機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)THC可顯著降低模型組胞內(nèi)鈣離子濃度,并下調(diào)PI3K和Akt的磷酸化水平,而且PI3K的特異性激動(dòng)劑740 Y-P可部分逆轉(zhuǎn)THC對(duì)血小板活化和聚集的抑制作用,證明THC抑制血小板活化和聚集與其下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān),同時(shí)也說明其他信號(hào)通路也可能參與其中。之前的研究表明,姜黃素可通過糖蛋白VI(glycoprotein VI,GPVI)/脾源性酪氨酸蛋白激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)/磷脂酶Cγ(phospholipase Cγ,PLCγ)信號(hào)通路抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化和聚集,而THC是否也對(duì)這條信號(hào)通路起調(diào)控作用需要今后的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

    本課題組之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),每天以800 mg/kg飼料的劑量給小鼠膳食補(bǔ)充姜黃素和THC,喂養(yǎng)25 d后,姜黃素組和THC組小鼠血漿中THC的濃度分別為0.2 μmol/L和0.9 μmol/L,而且在這個(gè)劑量下,小鼠未觀察到明顯的毒副反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中小鼠血漿的THC濃度,選擇的THC濃度范圍為0.5~10.0 μmol/L,該濃度范圍涵蓋生理劑量和藥理劑量,并且與其他報(bào)道的體外研究中所使用的THC濃度接近。日常生活中經(jīng)常食用咖喱的人群中,姜黃素的日攝入量可達(dá)10 g,而THC作為姜黃素的主要腸道代謝物,其對(duì)人體的安全性可以確定。本研究發(fā)現(xiàn)THC可抑制血小板活化和聚集,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,膳食補(bǔ)充THC是否影響凝血過程仍值得深入探討;另外,THC是否有望開發(fā)成為安全的抗血小板藥物也需更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。目前國內(nèi)外在THC量化生產(chǎn)方面進(jìn)行了不斷地探索,其體外合成途徑主要有化學(xué)合成和生物合成。在化學(xué)合成方法中,主要是通過利用姜科植物姜黃根莖中分離出的姜黃素進(jìn)行氫化而得到,或者采用新型催化劑在室溫下直接將姜黃素還原為THC,此方法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。在生物合成方法中,有酵母生物轉(zhuǎn)化法和大腸桿菌合成法等。目前微生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行THC的生產(chǎn)已成為研究的熱點(diǎn),它可能成為今后提高THC工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑。

    本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素的腸道代謝物THC能夠顯著抑制凝血酶誘導(dǎo)的人血小板活化和聚集,其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。總之,本研究從營養(yǎng)膳食或從功能食品途徑為姜黃素和THC防治心血管疾病提供了一定的理論依據(jù)。

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