紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的抗炎活性

張馨方，楊亞蘭，張 慧，羅非君，任佳麗

（中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，林產(chǎn)可食資源安全與加工利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

萜類化合物是分子式為異戊二烯單位倍數(shù)的烴類及其衍生物，廣泛分布在植物、動物和大型真菌中，結(jié)構(gòu)多樣。目前已報(bào)道的萜類化合物的結(jié)構(gòu)大約有50 000種，其中絕大多數(shù)萜類物質(zhì)具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、抗人類免疫缺陷-1病毒、降血糖、降血脂等活性。食用菌中的萜類多為倍半萜、二萜和三萜。紅汁乳菇（）是一種美味的食藥用真菌，具有獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，廣泛分布在我國的湖南、安徽、福建、四川、湖北和廣西等地。目前對紅汁乳菇中萜類物質(zhì)的研究僅停留在初步的分離純化及結(jié)構(gòu)解析上，對其生物活性尤其是抗炎活性的研究較少。因此，紅汁乳菇中的萜類化合物具有巨大的研究價值和開發(fā)潛力。

炎癥是機(jī)體的自我防御反應(yīng)，主要的表現(xiàn)有局部紅腫、發(fā)熱、疼痛和功能性障礙，伴隨著白細(xì)胞數(shù)量增多和單核巨噬細(xì)胞增生等全身反應(yīng)，長時間的炎癥會使機(jī)體產(chǎn)生一系列的異常應(yīng)激反應(yīng)，對機(jī)體自身造成不同程度的傷害，如引起動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、糖尿病等多種疾病，嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致癌癥。大量研究表明多種食用菌具有抗炎的作用，主要是通過減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生來達(dá)到抗炎的效果。

巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用，致炎因子會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量的炎癥因子，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞模型常用于體外炎癥反應(yīng)模擬，主要是通過檢測炎癥因子基因和蛋白相對表達(dá)水平的變化來評價活性物質(zhì)的抗炎效果。當(dāng)LPS作用巨噬細(xì)胞后，炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin，IL）-1β、IL-6等表達(dá)量會顯著增加，并進(jìn)一步促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而引發(fā)炎癥。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的一種重要激酶，其信號傳導(dǎo)主要是三級激酶的傳遞模式，通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK（以下簡稱p38蛋白）等蛋白質(zhì)的磷酸化來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過程。因此，本研究以LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞為炎癥模型來評估紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，并初步探究紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對MAPK通路的影響，旨在為紅汁乳菇的精深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅汁乳菇 長沙市馬王堆市場；甲醇（分析純）、氯仿（分析純）、乙酸乙酯（分析純）、丙酮（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚天津恒興化學(xué)品有限公司；柱色譜硅膠200～300 目青島海洋化工有限公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶 美國Gibco公司；細(xì)胞增殖檢測（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2-tetrazolium，MTS）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 美國Promega公司；TransZol、Green qPCR SuperMix UDG試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；-actin抗體、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、IL-6、TNF-α、IL-1β一抗、磷酸化-MAPK（phospho-MAPK，P-MAPK）/MAPK抗體試劑盒、二抗抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、抗小鼠IgG1-辣根過氧化物酶顯色液試劑盒 美國CST公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LABORATA 4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國海道爾夫集團(tuán)；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；Bruker-100核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國布魯克公司；DNM-9602酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；XDS-10倒置生物顯微鏡 上海團(tuán)結(jié)儀器制造有限公司；JY-SPCT水平電泳槽、JY300C電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備儀器公司；721-BR10883凝膠成像儀、CFX96 Touch實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的提取與結(jié)構(gòu)分析

愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的提取：將新鮮的紅汁乳菇子實(shí)體用組織破碎機(jī)攪碎，室溫下靜置3 h后按照料液比1∶3（/）加入丙酮，室溫下靜置24 h進(jìn)行浸提，過濾收集濾液，按照此操作浸提3 次，合并3 次的提取液。然后按照料液比1∶3（/）在濾渣中加入甲醇-氯仿混合溶液（體積比1∶1），室溫靜置浸提24 h，過濾收集濾液，按照此操作浸提2 次。合并收集的濾液，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到黑色浸膏。將上述全部黑色浸膏溶于150 mL乙酸乙酯，然后加入等體積水，收集乙酸乙酯相（上層）后于35 ℃真空蒸發(fā)除去溶劑，得到浸膏。柱層析：稱取一定質(zhì)量（約為樣品質(zhì)量30～70 倍）的200～300 目硅膠，將浸膏用純石油醚進(jìn)行洗脫，收集藍(lán)色組分，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后將樣品凍干，得到愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物備用。

紫外-可見波段圖譜掃描：將0.1 mg愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物樣品溶于10 mL無水乙醇中，以無水乙醇為參比溶液進(jìn)行全波長（200～800 nm）掃描，確定紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的最大吸收波長。

高效液相色譜分析：稱取0.1 mg愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，加入10 mL無水甲醇（色譜級）溶解，然后用無水甲醇稀釋10 倍，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后備用。LC-20A高效液相色譜儀配備ODS C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相純甲醇（色譜級），流速1 mL/min，檢測波長289 nm。

質(zhì)譜條件：取液相色譜分析中制備的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜離子源為正離子ESI掃描，電離電壓3.5 kV，分辨率70 000，質(zhì)量范圍100～1 500/。

NMR分析：稱取愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物10 mg，溶于0.5 mL氘代二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），進(jìn)行氫譜、碳譜檢測，共振頻率400 MHz。

1.3.2 巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活性的測定

將RAW264.7細(xì)胞在含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清和1%（體積分?jǐn)?shù)）雙抗（青霉素和鏈霉素）的1640細(xì)胞培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中，每2 d進(jìn)行換液、傳代。取對數(shù)生長期的RAW246.7細(xì)胞，經(jīng)0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胰蛋白酶消化后吹打均勻，用1640培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞密度為6×10個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入含紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物（終質(zhì)量濃度為0、25、50、100 μg/mL）的1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個平行，重復(fù)3 次，輕輕振蕩，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，每孔加入20 μL MTS溶液（5 mg/mL）。再次培養(yǎng)4 h后，采用酶標(biāo)儀測定每個孔490 nm波長處的吸光度，以表征細(xì)胞活性；同時采用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況（放大倍數(shù)為400×）。

1.3.3 LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為5 組：空白對照組、LPS模型組、不同質(zhì)量濃度（25、50、100 μg/mL）紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物組。參照1.3.2節(jié)方法將處于對數(shù)生長期的RAW246.7細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，以10個/mL接種于6 孔板中，每孔1 mL，待細(xì)胞貼壁完全后吸棄培養(yǎng)液，然后按照分組加入不同培養(yǎng)基。紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物組：分別加入1 mL含不同質(zhì)量濃度（25、50、100 μg/mL）紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的完全培養(yǎng)基后在培養(yǎng)箱中孵育3 h，加入LPS使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL；LPS模型組：加入1 mL含LPS（終質(zhì)量濃度為1 μg/mL）的完全培養(yǎng)基；空白對照組：加入1 mL完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞做進(jìn)一步分析。

1.3.4 熒光定量PCR檢測相關(guān)炎癥因子的mRNA相對表達(dá)水平

取1.3.3節(jié)收集的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.2～7.4，下同）清洗2 次，用1 mL TransZol提取細(xì)胞總RNA，0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖膠電泳分析RNA的完整性和濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后進(jìn)行PCR。引物序列如表1所示，PCR反應(yīng)條件：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，60 ℃，40 s，72℃，1 min，40個循環(huán)。采用2法計(jì)算相關(guān)炎癥因子的mRNA相對表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.3.5 Western blot法檢測蛋白相對表達(dá)水平

取1.3.3節(jié)各組的細(xì)胞，用磷酸緩沖液清洗2 次，加入0.3 mL含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，然后4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液，BCA法測蛋白濃度，取20 μg的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%牛血清白蛋白封閉液在室溫下封閉 1 h，然后與一抗在4 ℃下孵育12 h，TBST清洗3 次，膜與二抗在室溫下孵育 1 h 后，再用TBST清洗3 次，最后用曝光儀曝光拍照，并采用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的結(jié)構(gòu)解析

對分離純化所得的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，圖1為紫外-可見波段掃描圖譜，在244、289、376 nm有3個吸收峰，最大吸收波長在289 nm處，根據(jù)Woodward-Fieser經(jīng)驗(yàn)規(guī)則，推測所得的化合物可能存在4個共軛雙鍵。由圖2可知，在6.5 min處有一高強(qiáng)度峰，根據(jù)面積歸一法初步推導(dǎo)其純度為96.7%。由圖3可知，在正離子模式下，所得的化合物的分子離子峰為/197.172 8。H NMR（圖4）和C NMR（圖5）的解析結(jié)果為，H NMR（DMSO-d6，400 MHz）：8.36（1H，d，＝2.0 Hz，H-8），7.69（1H，dd，＝10.9 Hz，2.0 Hz，H-6），7.64（1H，d，＝3.8 Hz，H-2），7.30（1H，d，＝3.8 Hz，H-3），7.07（1H，d，＝10.9 Hz，H-5），5.37（1H，brs，H-13a），5.20（1H，brs，H-13b），2.79（3H，s，H-14），2.62（3H，s，H-15），2.26（3H，brs，H-12）；C NMR（DMSO-d6，100 MHz）：146.4（s，C-4），145.1（s，C-11），136.9（s，C-7），136.5（d，C-8），135.0（s，C-10），134.0（d，C-6），132.8（s，C-9），131.7（d，C-5），127.1（s，C-1），124.5（d，C-2），114.4（t，C-13），113.8（d，C-3），23.5（q，C-14），22.9（q，C-12），12.8（q，C-15）。圖4和圖5結(jié)果與文獻(xiàn)[30]報(bào)道基本一致，故可以得出該化合物分子式為CH，結(jié)構(gòu)式如圖6所示，為愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物。

圖1 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的紫外-可見波段掃描圖譜Fig. 1 UV-Vis spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖2 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的高效液相色譜圖Fig. 2 High performance liquid chromatogram of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖3 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖4 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的1H NMR圖Fig. 4 1H NMR spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖5 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的13C NMR圖Fig. 5 13C NMR spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

圖6 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的結(jié)構(gòu)式Fig. 6 Structural formula of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

2.2 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對巨噬細(xì)胞形態(tài)和活性的影響

分別利用完全培養(yǎng)基（空白對照組）和含紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物（25、50、100 μg/mL愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞24 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長情況，如圖7所示，空白對照組和實(shí)驗(yàn)組的巨噬細(xì)胞形態(tài)均完整無缺。MTS法檢測愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對巨噬細(xì)胞活性的影響，如圖8所示，空白對照組和實(shí)驗(yàn)組（25、50、100 μg/mL愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物）的吸光度分別為0.861±0.03、0.849±0.034、0.845±0.028、0.844±0.029，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光度沒有顯著差異（＞0.05），說明質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL的紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物不會影響巨噬細(xì)胞的活性，因此選擇這3個質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖7 顯微鏡觀察紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響（400×）Fig. 7 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on morphology of macrophage RAW264.7 cells (400 ×)

圖8 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對巨噬細(xì)胞活性的影響Fig. 8 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the viability of RAW264.7 cells

2.3 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA相對表達(dá)水平的影響

為了在基因水平上確定紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，采用PCR測定各組細(xì)胞中、、和mRNA的相對表達(dá)水平，結(jié)果如圖9所示。通過對比空白對照組、LPS模型組和實(shí)驗(yàn)組（25、50、100 μg/mL愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物）細(xì)胞炎癥因子mRNA的相對表達(dá)水平可知：和空白對照相比，LPS模型組的、、和mRNA相對表達(dá)水平明顯升高，說明LPS成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，且這些細(xì)胞因子與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)；和LPS模型組相比，實(shí)驗(yàn)組中、、、mRNA表達(dá)水平均極顯著下降（＜0.01），且隨著愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物質(zhì)量濃度不斷升高，表達(dá)量均不斷降低，呈現(xiàn)較好的濃度依賴性，說明該愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物能極顯著降低由LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中、、、mRNA相對表達(dá)水平（＜0.01）。

圖9 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA相對表達(dá)水平的影響Fig. 9 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the relative mRNA expression level of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells

2.4 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子蛋白相對表達(dá)水平影響

為了在蛋白質(zhì)水平上確定紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，采用Western blot法檢測相應(yīng)炎癥因子蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果如圖10所示。和空白對照組相比，模型組的COX-2、IL-1β、iNOS、TNF-α、IL-6的相對表達(dá)水平均明顯升高，說明LPS成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。與已經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的模型組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組的COX-2、TNF-α、iNOS的蛋白相對表達(dá)水平均隨著該愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物質(zhì)量濃度的升高而遞減，對于IL-1β和IL-6，僅有高質(zhì)量濃度的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物（100 μg/mL）能夠使其相對表達(dá)水平極顯著降低（＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明一定質(zhì)量濃度的紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物能降低LPS刺激的巨噬細(xì)胞中炎癥因子COX-2、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的表達(dá)。

圖10 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子蛋白相對表達(dá)水平的影響Fig. 10 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the relative protein expression levels of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells

2.5 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中通路MAPK磷酸化的影響

為進(jìn)一步研究紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物抵抗炎癥發(fā)生的機(jī)制，研究了其對MAPK信號通路變化的影響，結(jié)果如圖11所示。與空白對照組相比，LPS可以刺激巨噬細(xì)胞中磷酸化-JNK（phospho-JNK，p-JNK）、磷酸化-p38（phospho-p38，p-p38）、磷酸化-p44/42（phospho-p44/42，p-p44/42）蛋白相對表達(dá)水平明顯升高；與LPS模型組相比，不同質(zhì)量濃度的紅汁乳菇愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對p-p38蛋白表達(dá)的抑制效果較小且較為相近，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時，樣品會使p-JNK蛋白的表達(dá)明顯降低，而經(jīng)梯度質(zhì)量濃度的該愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物處理后，巨噬細(xì)胞中p-p44/42蛋白相對表達(dá)水平逐漸下降。結(jié)果表明一定劑量的紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物處理能極顯著降低p44/42、p38和JNK 3種蛋白激酶的磷酸化水平（＜0.01），從而抑制MAPK炎癥通路的活化。

圖11 紅汁乳菇中愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞MAPK通路中蛋白磷酸化水平的影響Fig. 11 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the phosphorylation of proteins involved in the MAPK signaling pathway in LPS-induced RAW264.7 cells

3 結(jié) 論

本研究從新鮮紅汁乳菇子實(shí)體中提取愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，發(fā)現(xiàn)該化合物在0～100 μg/mL不會影響巨噬細(xì)胞的活性，采用LPS誘導(dǎo)RAW.264.7巨噬細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)該化合物可以抑制炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS的分泌與表達(dá)；同時，可以降低p44/42、p38和JNK 3種蛋白激酶的磷酸化水平，通過抑制MAPK通路的活性，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，具有良好的抗炎活性。本研究對紅汁乳菇精深加工產(chǎn)品的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。