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    無(wú)毒性產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素重組蛋白的自誘導(dǎo)分泌表達(dá)及免疫原性分析

    2022-07-29 06:48:30魏后軍范志宇仇汝龍陳萌萌宋艷華徐為中
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年14期
    關(guān)鍵詞:莢膜產(chǎn)氣乳糖

    魏后軍, 范志宇, 胡 波, 仇汝龍, 陳萌萌, 宋艷華, 徐為中, 王 芳

    (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210014)

    產(chǎn)氣莢膜梭菌()也稱(chēng)魏氏梭菌,是引起各種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥、人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一。該菌的致病因子是其分泌的外毒素,主要是、、和毒素,據(jù)此將該菌分為A、B、C、D、E等5個(gè)毒素型;各毒素型均產(chǎn)生毒素,毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的毒力因子,其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌毒素最多。毒素基因位于染色體上,大小為1 194 bp,編碼的產(chǎn)物由398 個(gè)氨基酸殘基組成,其中前28 個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,成熟肽為 370 個(gè)氨基酸。毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶2種酶活性,能同時(shí)水解細(xì)胞膜上的磷脂酰膽堿和鞘磷脂,導(dǎo)致細(xì)胞裂解,因而具有細(xì)胞毒性、溶血活性和血小板聚集等特性。因此,研究者利用基因工程技術(shù)將毒素去毒性,作為抗原研制疫苗。

    Studier提出了外源基因表達(dá)自誘導(dǎo)(auto-induction)的方法。其原理是大腸桿菌首先以葡萄糖為碳源生長(zhǎng),葡萄糖消耗殆盡,達(dá)到一定活力后,開(kāi)始消耗培養(yǎng)基中的乳糖,在乳糖滲透酶(lactose permease)和-半乳糖苷酶(-galactosidase)的作用下,乳糖穿過(guò)細(xì)胞膜并部分轉(zhuǎn)化為異乳糖開(kāi)啟了T7表達(dá)系統(tǒng),乳糖的代謝產(chǎn)物葡萄糖和半乳糖也可作為碳源。與IPTG(isopropyl--thiogalactoside)相比,乳糖無(wú)細(xì)胞毒性、價(jià)格較低,自誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)劑,無(wú)需在培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)重組菌的生長(zhǎng)情況添加誘導(dǎo)劑。

    本研究對(duì)含信號(hào)肽的毒素基因進(jìn)行突變?nèi)ザ炯懊艽a子優(yōu)化,采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)自誘導(dǎo)分泌表達(dá)了無(wú)毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素重組蛋白,該方法具有安全、抗原免疫原性好、工藝簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn),研制的疫苗能有效避免現(xiàn)有疫苗生產(chǎn)工藝較復(fù)雜、成本較高等問(wèn)題。本研究為研制產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因工程疫苗提供了技術(shù)保障。

    1 材料與方法

    1.1 主要試驗(yàn)材料

    A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存;兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病(A型)滅活疫苗購(gòu)自山東華宏生物工程有限公司,主要成分為滅活的蘇84-A株全菌液,用量為2 mL/只;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司;高保真酶購(gòu)自 Invitrogen 公司;凝膠回收純化試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;大腸桿菌() BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司;A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)在肉肝胃膜湯中培養(yǎng)的濾液(16~20 g小鼠的毒素含量為50 MLD/mL),由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備、保存;A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的兔源多克隆抗體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備、保存;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;自誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方:10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L 甘油、0.25 g/L 葡萄糖、25 mmol/L NaHPO、25 mmol/L KHPO、50 mmol/L NHCl、5 mmol/L NaSO、2 mmol/L MgSO、1 g/L乳糖。

    1.2 α毒素基因序列的測(cè)定

    根據(jù)GenBank上公布的α毒素基因序列(GenBank:AY823400.1)設(shè)計(jì)引物,上游引物:5′-G C G G A A T T C A T G A A A A G A A A G A T T T G T A A G-3′,下游引物:5′-G C G C T C G A G T T A T T T T A T A T T A T A A G T T G-3′,由南京擎科生物科技有限公司合成。以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)DNA為模板,PCR反應(yīng)體系:模板1 μL,高保真酶0.2 μL,10×Buffer 5 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL,dNTPs(25 mmol/L)4 μL,MgSO(50 mmol/L)2 μL,ddHO 37 μL;反應(yīng)程序:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,62.0 ℃ 1 min,68 ℃ 1.5 min,30個(gè)循環(huán);68 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,用膠回收試劑盒回收目的片段?;厥盏哪康钠螠y(cè)序,獲得毒素基因序列(蘇84-A株)。

    1.3 重組菌的構(gòu)建

    根據(jù)毒素測(cè)序結(jié)果,將毒素的第176位組氨酸(CAT)突變?yōu)樘於0?AAT),同時(shí)對(duì)信號(hào)肽序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化;將化學(xué)合成的該序列插入到載體pET32a(RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)之間),獲得重組質(zhì)粒pET32a-αH176N。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐青霉素的抗性L(fǎng)B平板,37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的抗性L(fǎng)B液體培養(yǎng)基,37 ℃振搖過(guò)夜,菌液經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性,將該菌株命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株。

    1.4 重組蛋白的表達(dá)、鑒定

    將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含氨芐青霉素的抗性自誘導(dǎo)培養(yǎng)基,28 ℃振搖培養(yǎng)24 h后,6 000 r/min 離心15 min,收集上清,經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過(guò)濾后,獲得重組蛋白αH176N,在αH176N蛋白及100、50、25 μg/mL 的BSA中分別加入4×SDS上樣緩沖液混勻,煮沸 5~8 min,進(jìn)行SDS-PAGE分析;同時(shí)以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的兔源多克隆抗體為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗,對(duì)αH176N蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

    1.5 自誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

    將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含1、2、4 g/L乳糖的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每個(gè)乳糖濃度的培養(yǎng)基分別在16、28、37 ℃振搖培養(yǎng)24 h后,6 000 r/min 離心15 min,收集上清,經(jīng) 0.22 μm 孔徑濾膜過(guò)濾后,分別加入4×SDS上樣緩沖液混勻,煮沸5~8 min,進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

    1.6 重組蛋白的毒性測(cè)定

    1.6.1 卵磷脂酶活性試驗(yàn)毒素具有磷脂酶C活性,能將卵黃中的磷酸卵磷脂特異性的水解成磷酰膽堿和1,2-甘油二脂,產(chǎn)生白色混濁。將αH176N蛋白和野生型毒素,分別滴加2 μL到卵黃瓊脂平板,37 ℃靜置1 h后,觀(guān)察滴加的位置是否出現(xiàn)白色混濁斑。

    1.6.2 小鼠毒力試驗(yàn) 10只16~20 g小鼠,隨機(jī)分成2組,每組5只。其中1組作為對(duì)照組,將空載體大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a自誘導(dǎo)的全菌液,離心后取上清,經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜的濾液,尾靜脈注射小鼠0.3 mL/只;另1組小鼠,尾靜脈注射αH176N蛋白液0.3 mL/只,連續(xù)觀(guān)察7 d。

    1.7 與滅活疫苗效力試驗(yàn)比較

    將制備的αH176N蛋白(62.4 μg/mL),與氫氧化鋁膠按9 ∶1的比例加入氫氧化鋁膠佐劑,作為本次試驗(yàn)用基因工程疫苗;將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)在肉肝胃膜湯中培養(yǎng)的濾液(16~20 g小鼠的毒素含量為50 MLD/mL),用甲醛滅活后與氫氧化鋁膠按9 ∶1的比例加入氫氧化鋁膠佐劑,作為本次試驗(yàn)用自制類(lèi)毒素疫苗。分別將基因工程疫苗(1、0.25、0.125 mL)、自制類(lèi)毒素疫苗(2、1 mL)、商品化疫苗(2 mL)免疫1.5~2.0 kg健康易感家兔,每個(gè)劑量組各6只,21 d后,連同6只對(duì)照組,耳緣靜脈注射1 MLD的 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素,連續(xù)觀(guān)察3~5 d。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 α毒素基因序列的測(cè)定

    以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(蘇84-A株)DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明:擴(kuò)增出約1 200 bp的片段,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)?;厥漳康钠危瑴y(cè)序獲得α毒素基因序列。

    2.2 重組αH176N蛋白的表達(dá)與鑒定

    大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),SDS-PAGE電泳分析顯示,蛋白分泌到培養(yǎng)基中 (圖2-A),通過(guò)QuantiyOne軟件,計(jì)算蛋白含量為50.1 μg/mL。Western blot結(jié)果顯示,αH176N蛋白有約42.5 ku大小的目的條帶,空載體大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a經(jīng)誘導(dǎo)的全菌液無(wú)條帶,表明目的蛋白已得到分泌表達(dá)。

    2.3 自誘導(dǎo)條件的優(yōu)化結(jié)果

    將大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-αH176N株以1%接種于含1、2、4 g/L乳糖的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每個(gè)乳糖濃度的培養(yǎng)基分別在16、28、37 ℃振搖培養(yǎng)24 h后,收獲蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分析,在含1~2 g/L 乳糖的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基及28 ℃誘導(dǎo)條件下,可以獲得較多分泌表達(dá)的目的蛋白(圖3)。

    2.4 重組αH176N蛋白的毒性

    野生型α毒素在卵黃瓊脂平板上出現(xiàn)白色混濁斑,而αH176N蛋白不出現(xiàn)白色混濁斑,說(shuō)明αH176N蛋白已不具備毒素的磷脂酶C活性。將αH176N蛋白尾靜脈注射小鼠,觀(guān)察期內(nèi),連同對(duì)照組小鼠均健活且無(wú)不良反應(yīng),說(shuō)明重組蛋白αH176N是無(wú)毒的。

    2.5 免疫保護(hù)試驗(yàn)

    分別將基因工程疫苗、自制類(lèi)毒素疫苗、商品化疫苗免疫試驗(yàn)兔,21 d后攻毒,結(jié)果顯示,基因工程疫苗0.25 mL/只免疫保護(hù)效果優(yōu)于類(lèi)毒素疫苗 2 mL/只 及商品化疫苗2 mL/只的免疫保護(hù)效果(表1)。

    表1 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果

    3 討論與結(jié)論

    目前商品化的產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗是將厭氧培養(yǎng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液或外毒素滅活制備而成,存在抗原成分復(fù)雜、穩(wěn)定性差、副作用大以及滅活不徹底等安全隱患問(wèn)題。而有關(guān)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因工程疫苗的研究大多采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、以截短表達(dá)或多點(diǎn)突變的方法使毒素去毒性。毒素蛋白通常在胞內(nèi)以不可溶性的包涵體或胞內(nèi)的可溶性蛋白表達(dá)。包涵體形式表達(dá)影響了毒素的天然結(jié)構(gòu),使其失去生物活性,需進(jìn)行復(fù)性處理;胞內(nèi)的可溶性蛋白具有生物活性,但含雜蛋白較多,需進(jìn)行復(fù)雜的純化過(guò)程;且重組大腸桿菌采用IPTG作為誘導(dǎo)劑,需要依據(jù)檢測(cè)重組菌的生長(zhǎng)情況添加誘導(dǎo)劑。

    本研究通過(guò)基因工程技術(shù)突變毒素蛋白的1個(gè)氨基酸,使其失去毒性,同時(shí)保留其天然結(jié)構(gòu)和分子特征。此外,本研究采用自誘導(dǎo)分泌表達(dá)技術(shù),以培養(yǎng)基中天然成分乳糖作為誘導(dǎo)劑,并對(duì)信號(hào)肽序列進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)重組毒素“胞外分泌”,直接以可溶的形式分泌釋放到培養(yǎng)基中,無(wú)需添加化學(xué)誘導(dǎo)劑。將制備的αH176N蛋白液與氫氧化鋁膠配制成的疫苗,免疫0.25 mL/只就能達(dá)到100%(6/6)保護(hù)的效果,且具有抗原成分單一、安全性好、工藝簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn),可為多聯(lián)苗、多價(jià)苗的研究奠定基礎(chǔ)。

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