hnRNP A2/B1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達變化及其與患者預(yù)后的關(guān)系

王穎，王智娜 ，馬洪明，高鴻，張楠

1應(yīng)急總醫(yī)院應(yīng)急管理部醫(yī)務(wù)室，北京 100028；2應(yīng)急總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

目前結(jié)直腸癌的手術(shù)和輔助治療方面取得了相當(dāng)大的進步，但患者病死率仍然很高，5年總生存率低于65%[1]。結(jié)直腸癌的TNM分期系統(tǒng)與腫瘤分級對預(yù)測預(yù)后具有重要意義，但因其異質(zhì)性，仍需探尋不同蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。hnRNP家族是在可變剪接過程中發(fā)揮重要作用的RNA結(jié)合蛋白家族[2]。hnRNP幾乎參與mRNA代謝的全過程，這些hnRNP蛋白在mRNA的處理（RNA剪接、穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運和翻譯）、DNA修復(fù)、端粒、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上都有不同程度的作用。越來越多的證據(jù)表明，hnRNP極有可能參與腫瘤發(fā)生機制，如血管生成、細胞凋亡、細胞侵襲和上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化等[3]。hnRNP A2/B1是hnRNP家族的重要成員之一。本研究觀察了hnRNP A2/B1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達變化，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源 收集2017年3月—2020年3月我院根治性結(jié)腸切除術(shù)中留取的結(jié)腸癌患者腫瘤組織標本212例和與之相匹配的癌旁正常組織標本（距離切緣＞5 cm）58例。患者男116例、女96例，年齡21～87歲。排除術(shù)前新輔助治療（化療或放療）、復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌、遺傳性結(jié)直腸癌患者，合并其他已知惡性腫瘤的患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 腫瘤組織中hnRNP A2/B1蛋白檢測 采用免疫組化法和 Western blotting法。免疫組化法[4]：將結(jié)直腸癌組織和正常組織使用石蠟包埋、甲醛固定，做4μm厚切片，加入一抗（抗人hnRNP A2/B1多克隆抗體，1∶100）4℃過夜，加入二抗（辣根過氧化物酶結(jié)合的抗小鼠抗體）37℃下孵育15 min，最后用DAB染色試劑盒進行染色，蘇木精反染后密封，陰性對照用磷酸鹽緩沖鹽水代替一抗；由兩位高年資病理科醫(yī)生進行獨立雙盲閱片，hnRNP A2/B1表達于細胞核和細胞質(zhì)，以細胞核和（或）細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；采用H-score半定量方法[5]，根據(jù)染色強度（I）和陽性細胞百分比（PC）進行賦分，以∑（I×PC）計算最終得分，范圍為0～300分。根據(jù)免疫組化積分的近中位值將結(jié)直腸癌標本分為高表達組（積分≥100分）和低表達組（積分＜100分）。Western blotting法檢測操作步驟參考文獻[6]。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析條帶的IntDen值作為蛋白相對表達量。

1.3 預(yù)后隨訪 隨訪5年，記錄無病生存、疾病復(fù)發(fā)和因結(jié)直腸癌死亡情況，記錄總生存期（OS）和無病生存期（DFS）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。hnRNP A2/B1表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析采用Pearsonχ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank分析法。預(yù)后影響因素分析采用Cox回歸分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hnRNP A2/B1蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達比較 hnRNP A2/B1在結(jié)腸癌細胞和正常結(jié)腸腺細胞的細胞核和細胞質(zhì)中均有表達，hnRNP A2/B1在結(jié)直腸癌組織中主要在細胞核中表達。結(jié)直腸癌及癌旁組織中hnRNP A2/B1蛋白表達積分分別為（134.7±74.1）、（34.6±11.0）分，高表達組90例、低表達組122例；Western blotting法檢測結(jié)直腸癌及癌旁組織中hnRNP A2/B1蛋白相對表達量分別為227 254±45 678、34 987±4 509。hnRNP A2/B1在結(jié)直腸癌組織中的表達高于相應(yīng)正常結(jié)腸組織（P均＜0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌不同臨床病理特征患者hnRNP A2/B1蛋白表達比較 Ⅲ、Ⅳ期患者hnRNP A2/B1蛋白高表達者所占比例高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P均＜0.05），不同年齡、性別、術(shù)前CEA水平、原發(fā)腫瘤位置（結(jié)腸或直腸）、腫瘤大小、腫瘤病理分型、腫瘤分化程度的患者hnRNP A2/B1蛋白表達情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 結(jié)直腸癌不同臨床病理特征患者hnRNP A2/B1蛋白表達比較[例（%）]

2.3 hnRNP A2/B1蛋白表達與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系 高表達組無病生存、疾病復(fù)發(fā)和因結(jié)直腸癌死亡的患者比例分別為31.1%（28/90）、27.8%（25/90）、41.4%（37/90），低表達組分別為 86.1%（105/122）、6.5%（8/122）、7.4%（9/122），高表達組無病生存患者比例低于低表達組，疾病復(fù)發(fā)和因結(jié)直腸癌死亡的患者比例高于低表達組（P均＜0.05）。高表達組平均OS（45.36±3.96）月、中位OS 41月，DFS（29.51±2.00）月、中位DFS 26月；低表達組OS（65.94±2.08）月、中位OS未到達（OS中死亡者未達到本組病例的50%），DFS（62.36±2.32）月、中位DFS未到達（DFS中出現(xiàn)疾病進展者未達到本組病例的50%）。高表達組OS和DFS短于低表達組（P均＜0.05）。進一步去除侵襲范圍淺、無轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后較好的Ⅰ期患者及已經(jīng)有遠處轉(zhuǎn)移的Ⅳ期患者，分析發(fā)現(xiàn)，hnRNP A2/B1表達與154例Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的生存時間相關(guān)，高表達組OS[分別為（46.97±3.08）、（54.78±2.08）月]和DFS[分別為（33.49±2.29）、（52.03±2.22）月]短于低表達組（P均＜0.05）。在90例Ⅱ期結(jié)直腸癌患者中，高表達組OS[分別為（50.10±5.20）、（58.69±1.30）月]和DFS[分別為（35.26±2.18）、（54.83±2.67）月]短于低表達組（P均＜0.05）。但在64例Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中，高表達組和低表達組OS和DFS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，hnRNP A2/B1蛋白表達與TNM分期是結(jié)直腸癌患者OS和DFS的獨立影響因素。見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者OS和DFS影響因素回歸分析結(jié)果

3 討論

人hnRNP A2/B1基因位于染色體7p15上，編碼蛋白異構(gòu)體hnRNP A2和B1，在細胞核和細胞質(zhì)之間穿梭來發(fā)揮作用[7]。hnRNP A2/B1在胰腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均有表達，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等多種疾病有關(guān)[8]。此外，hnRNP A2/B1高表達與一些腫瘤細胞的侵襲行為有關(guān)。然而，hnRNP A2/B1在結(jié)直腸癌中的表達情況及與患者臨床預(yù)后的關(guān)系尚不明確。本研究采用免疫組化法和Western blotting法進行定性和半定量分析，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常結(jié)腸組織相比，hnRNP A2/B1蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達，與其他腫瘤相關(guān)研究結(jié)果相似。我們發(fā)現(xiàn)，hnRNP A2/B1蛋白在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)腸組織的細胞核和細胞質(zhì)中均有表達。然而，在結(jié)直腸腫瘤組織中，其主要定位于細胞核，尤其是中、高分化的結(jié)直腸癌組織，而在低、中分化的結(jié)直腸癌組織中，其同時也在細胞質(zhì)中表達。原發(fā)性肝細胞肝癌相關(guān)研究表明，hnRNP A2/B1表達位置的變化（同時在細胞核、細胞質(zhì)中表達與僅在細胞核中表達相比）可能與腫瘤進展相關(guān)，這與我們的研究結(jié)果相似[9]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，hnRNP A2/B1高表達與結(jié)直腸癌TNM分期相關(guān)。生存分析顯示，hnRNP A2/B1表達變化與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，高表達組預(yù)后差。Cox多因素分析進一步表明，hnRNP A2/B1高表達和TNM分期都是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立影響因素，這與胰腺癌[10]、肺癌[11]、肝細胞癌[12]相關(guān)研究結(jié)果相似。結(jié)直腸癌患者的群體異質(zhì)性大，預(yù)后差異較大，尤其是Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌。本研究除去侵襲范圍淺、無轉(zhuǎn)移且臨床預(yù)后較好的Ⅰ期結(jié)直腸癌患者及已經(jīng)有遠處轉(zhuǎn)移的Ⅳ期結(jié)直腸癌患者，生存分析結(jié)果顯示，在Ⅱ～Ⅲ期患者、Ⅱ期患者中，高表達組OS和DFS均短于低表達組。約有一半的結(jié)直腸癌患者確診時處于Ⅱ～Ⅲ期[13-14]，這些患者即使已行結(jié)直腸癌根治術(shù)，仍會有15%～30%的Ⅱ期患者及50%～60%的Ⅲ期患者由于局部和（或）遠處轉(zhuǎn)移而在術(shù)后死于結(jié)直腸癌[14-15]。本研究結(jié)果提示，hnRNP A2/B1表達可以在一定程度上預(yù)測Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。

作為一種多功能蛋白，hnRNP A2/B1通過多種機制參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，hnRNP A2/B1通過與癌基因和抑癌基因相互作用（如 k-Ras[8]和 p53[16]）來調(diào)節(jié)腫瘤細胞分化和發(fā)展。在肝癌細胞中，hnRNP A2/B1蛋白能夠激活snail的轉(zhuǎn)錄，從而抑制snail的關(guān)鍵靶基因E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，使E-cadherin表達減少，導(dǎo)致上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。在宮頸癌中，hnRNP A2/B1蛋白可通過PI3K/Akt通路來調(diào)節(jié)細胞周期，抑制細胞凋亡[18]，也可通過影響Ras-MAPK-ERK 通路 起作 用[19]。 結(jié)直 腸癌 中 ，hnRNP A2B1與長鏈非編碼RNA相互作用，上調(diào)Zeb1表達，促進結(jié)腸癌發(fā)展[20]；其與TRA2B啟動子相互作用，可促進TRA2B mRNA在人結(jié)腸癌細胞中的轉(zhuǎn)錄[21]。上述研究結(jié)果提示，hnRNP A2/B1作為調(diào)控mRNA可變剪切的重要分子，可通過影響許多上游通路的功能，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望作為腫瘤治療靶點之一。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中hnRNP A2/B1蛋白呈高表達，hnRNP A2/B1蛋白高表達與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。hnRNP A2/B1可作為預(yù)測結(jié)直腸患者的預(yù)后指標，為臨床工作提供參考。未來可以進一步研究hnRNP A2/B1參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)信號通路和潛在機制。