球孢白僵菌侵染普通齒蛉幼蟲(chóng)的顯微觀察和感病癥狀

袁靖澤，馮毅，曹成全，陳浩

（1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 吉首 416000;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,陜西 楊凌 712100;3.樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,四川 樂(lè)山 614004）

廣翅目Megaloptera齒蛉科Corydalidae巨齒蛉屬與大型齒蛉屬的幼體被通稱(chēng)為“爬沙蟲(chóng)”（曹成全，2014），是一類(lèi)珍稀的藥食兩用昆蟲(chóng)（楊冬梅等，2012；石晏丞等，2019），在四川攀西地區(qū)有上百年的食用歷史（曹成全等，2019），產(chǎn)業(yè)價(jià)值極高。但近年來(lái)，自然環(huán)境破壞和濫捕等因素造成了野生爬沙蟲(chóng)數(shù)量驟減，因此，人工繁育爬沙蟲(chóng)刻不容緩。

普通齒蛉為中國(guó)廣布種（劉星月，2008），具有個(gè)體大、分布地域廣、數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，成為人工繁育爬沙蟲(chóng)的重點(diǎn)種類(lèi)。普通齒蛉的生活史較長(zhǎng)，1～2年發(fā)生1代，幼蟲(chóng)期占整個(gè)生活史的絕大部分，需要經(jīng)過(guò)10～12個(gè)齡期才能化蛹和羽化成蟲(chóng)。在人工養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，普通齒蛉幼蟲(chóng)死亡率較高，被菌類(lèi)侵染是死亡原因之一，且普通齒蛉幼蟲(chóng)一旦相遇，極易發(fā)生打斗行為，進(jìn)而在蟲(chóng)體表面產(chǎn)生嚴(yán)重程度不一的創(chuàng)傷，這些創(chuàng)傷成為了菌類(lèi)侵染的易感區(qū)域。

前期養(yǎng)殖實(shí)踐和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，寄主范圍較廣的蟲(chóng)生寄生菌——球孢白僵菌易侵染普通齒蛉幼蟲(chóng)并造成蟲(chóng)體大量死亡。本文對(duì)球孢白僵菌侵染普通齒蛉幼蟲(chóng)體表與傷口進(jìn)行了詳細(xì)的研究，為了解侵染機(jī)理及防治球孢白僵菌侵染普通齒蛉幼蟲(chóng)進(jìn)而提高養(yǎng)殖成活率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和蟲(chóng)體

供試菌株購(gòu)自山西綠海農(nóng)藥科技有限公司。菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）的斜面上進(jìn)行分離并培養(yǎng)7 d左右，4℃儲(chǔ)存。供試普通齒蛉末齡幼蟲(chóng)由樂(lè)山師范學(xué)院昆蟲(chóng)資源研發(fā)基地提供。

1.2 球孢白僵菌孢子懸浮液的配置

將供試菌種轉(zhuǎn)接在PDA平板培養(yǎng)基上，在25℃、光周期12L∶12D的條件下培育至10 d，待大量產(chǎn)孢后，4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，用滴管向PDA培養(yǎng)器（直徑9 cm）中添加0.03%吐溫80無(wú)菌水3～5 mL，然后用滅菌后的接種環(huán)刮取平板表面上孢子，每次刮取3～4個(gè)平板。將得到的菌液注入250 mL燒杯中并用磁力攪拌器攪拌40 min。待孢子全部散開(kāi)后，再用雙層醫(yī)用方紗濾出菌液，得到孢子懸浮液母液。用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)每毫升母液的分生孢子含量，然后用0.03%吐溫80無(wú)菌水將其配制為1×10個(gè)/mL的供試孢子懸濁液。

1.3 普通齒蛉接菌方法

將普通齒蛉迅速置于底部直徑10 cm、頂部直徑12 cm、高8 cm的玻璃缸中，再用裝滿(mǎn)供試孢子懸濁液的自動(dòng)噴霧器，將菌液噴至供試蟲(chóng)體表（每只試蟲(chóng)均勻噴灑）。當(dāng)缸底菌液完全浸沒(méi)蟲(chóng)體后，快速地把經(jīng)過(guò)處理后的蟲(chóng)體置于底面墊有海綿的玻璃杯（底面口徑10 cm、頂端口徑12 cm、高9 cm），25℃、相對(duì)濕度85%培育，8 h后撿出死亡的蟲(chóng)體。

1.4 感染球孢白僵菌的普通齒蛉幼蟲(chóng)掃描電鏡樣品制備

每6 h在處理后的幼蟲(chóng)中選10頭活蟲(chóng)，經(jīng)3%戊二醛溶液固定過(guò)夜，再用PBS緩沖液浸洗3次，10 min/次；分別用50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐層脫水，每級(jí)10 min，其間用100%乙醇脫水處理2次。用醋酸正戊酯置換2次，每次停留15 min。最后用CO臨界點(diǎn)干燥2 h。取出試樣，噴金（李庚午，1994）。在掃描電子顯微鏡（S-3400N，Hatachi）下觀察并拍攝。

1.5 普通齒蛉幼蟲(chóng)感病癥狀

將30頭普通齒蛉末齡幼蟲(chóng)用1.3中的接菌方法侵染。每12 h觀察是否出現(xiàn)感病癥狀，記錄感病癥狀以及死亡時(shí)間，統(tǒng)計(jì)各感病癥狀出現(xiàn)時(shí)間以及蟲(chóng)體數(shù)量。

1.6 普通齒蛉幼蟲(chóng)傷口侵染與拍照

將30頭普通齒蛉末齡幼蟲(chóng)放入玻璃缸（長(zhǎng)40 cm×寬20 cm×高10 cm）中使其互相打斗，每隔30 min觀察1次，挑選出傷口在背部1～3腹節(jié)、長(zhǎng)度為2～4 mm的試蟲(chóng)，每拿出1頭蟲(chóng)就補(bǔ)充1頭新蟲(chóng)。將20頭受傷試蟲(chóng)平均分為2組，每隔24 h對(duì)其傷口進(jìn)行拍照，觀察并記錄其恢復(fù)情況。其中1組使用供試孢子懸浮液侵染傷口（受傷后立刻侵染），用膠頭滴管吸取供試孢子懸浮液，在每頭蟲(chóng)傷口部位滴5滴，每隔24 h對(duì)其傷口進(jìn)行拍照，觀察并記錄侵染與恢復(fù)情況。

因傷口脫水后會(huì)變形，無(wú)法進(jìn)行電鏡掃描，故使用LY-WN超清顯微系統(tǒng)進(jìn)行拍照。因拍照時(shí)需要?dú)⑺涝囅x(chóng)，故無(wú)法選取同一只蟲(chóng)進(jìn)行不同時(shí)間球孢白僵菌入侵狀態(tài)的拍攝，所以選擇傷口位置、大小盡量一致的不同試蟲(chóng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌侵染普通齒蛉幼蟲(chóng)體表的部位、時(shí)間和入侵方式

在普通齒蛉幼蟲(chóng)接種球孢白僵菌后，分生芽孢在節(jié)間膜處（圖1：A）、體壁凹陷處（圖1：B）、體壁管狀凸起處（圖1：C）、剛毛窩附近（圖1：D，E）粘附；8 h后，分生孢子就已開(kāi)始萌發(fā)并形成芽狀凸起，繼而形成芽管（圖 1：F，G）；接種后 12 h內(nèi)，已有較多芽管穿透幼蟲(chóng)的體壁（圖1：H）；而接種18 h后，幼蟲(chóng)體表位于節(jié)間的分生孢子已經(jīng)萌發(fā)侵入表皮（圖1：H～L）。

圖1 球孢白僵菌分生孢子在普通齒蛉幼蟲(chóng)體表的附著部位觀察Fig.1 Attachment sites of Beauveria bassiana conidia on the body surface of Neoneuromus ignobilis larvae

球孢白僵菌對(duì)普通齒蛉幼蟲(chóng)的入侵主要包含了孢子粘附、萌發(fā)、透過(guò)體壁和細(xì)胞發(fā)育與繁殖等階段。球孢白僵菌的分生孢子和試蟲(chóng)體表的接觸與粘附并非單純的物理接觸，而是一個(gè)生物相互作用的過(guò)程，在普通齒蛉幼蟲(chóng)體表各個(gè)區(qū)域，球孢白僵菌的入侵也具有一定差別，一般分為2種方式：（1）通過(guò)芽管直接入侵：分生孢子吸水膨脹開(kāi)始萌發(fā)，并在孢子的一端生成芽狀凸起，萌發(fā)后直接入侵節(jié)間膜以及體表有縫隙的薄弱部位（圖2：A）；（2）產(chǎn)生附著胞后進(jìn)行入侵（圖2：B，C）：這種情況一般是在體壁較厚的部位發(fā)生，分生孢子萌發(fā)后，伸出芽管沿體壁生長(zhǎng)（圖2：D），芽管生長(zhǎng)過(guò)程中如遇適宜部位，則會(huì)生成附著胞向體壁入侵。接種后48～60 h，附著在體壁較厚部位如背部凸起等的孢子均萌發(fā)并侵入表皮（圖2：E，F(xiàn)）；在接種96 h左右后，體表產(chǎn)生大量菌絲（圖2：H，I）。

圖2 分生孢子在普通齒蛉幼蟲(chóng)體表上不同部位的入侵Fig.2 Invasion of conidia on different parts of the body surface of Neoneuromus ignobilis larvae

同一時(shí)期侵染球孢白僵菌的普通齒蛉幼蟲(chóng)中，在體表節(jié)間膜部位的分生孢子首先萌發(fā)，而且比其他區(qū)域的芽管和菌絲更長(zhǎng)，說(shuō)明球孢白僵菌具有選擇性地對(duì)蟲(chóng)體表皮侵染，因蟲(chóng)體薄弱環(huán)節(jié)為節(jié)間膜，所以球孢白僵菌侵染的部位也大多在此。

2.2 普通齒蛉幼蟲(chóng)感染球孢白僵菌后的感病癥狀

正常普通齒蛉幼蟲(chóng)在感染球孢白僵菌24 h時(shí)，10.00%出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、身體麻痹的癥狀；48 h時(shí)，76.67%出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍的癥狀，且有少數(shù)死亡；72 h時(shí)，66.67%身體變?nèi)彳?，這種癥狀持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)（圖3：A）；96 h時(shí)，死亡數(shù)量逐步增多，且蟲(chóng)體僵硬數(shù)量最多，占50.00%；感染108 h后，開(kāi)始產(chǎn)生菌絲；感染120 h后，60.00%產(chǎn)生菌絲，此時(shí)死亡數(shù)量最大（83.33%）。帶有傷口的普通齒蛉幼蟲(chóng)在感染球孢白僵菌后，死亡數(shù)量高峰比沒(méi)有傷口的正常試蟲(chóng)提前約12 h，在108 h時(shí)，累計(jì)死亡數(shù)量達(dá)到總數(shù)的73.33%（圖3：B）。帶有傷口但未感染球孢白僵菌的試蟲(chóng)幾乎不會(huì)因?yàn)槭軅劳?，除了傷口超過(guò)5 mm時(shí)因體內(nèi)組織流出而死亡。

圖3 普通齒蛉幼蟲(chóng)感染球孢白僵菌感病的反應(yīng)（A）與死亡數(shù)（B）Fig.3 Response(A)and mortality(B)of Neoneuromus ignobilis larvae challenged by Beauveria bassiana

2.3 普通齒蛉幼蟲(chóng)傷口感染球孢白僵菌后的感病癥狀

接菌后24 h內(nèi)，試蟲(chóng)的外表和對(duì)觸碰的反應(yīng)與正常蟲(chóng)體均無(wú)差別（圖4：A，B）；48 h后，反應(yīng)遲鈍、麻痹；72～120 h后，開(kāi)始死亡，剛死去時(shí)軀體柔軟，但隨后身體漸漸僵硬，且隨著時(shí)間推移死亡率逐步上升。部分剛死去的蟲(chóng)體表面被密集生長(zhǎng)的白色菌絲所掩蓋，而部分蟲(chóng)體表層未見(jiàn)菌絲，但傷口部位有明顯的菌株且凸起明顯（圖4：C，D），與未感染球孢白僵菌的傷口有很大差異。

圖4 普通齒蛉幼蟲(chóng)感染后的傷口愈合情況Fig.4 Wound healing of Neoneuromus ignobilis larvae after infection

2.4 普通齒蛉幼蟲(chóng)傷口愈合情況

普通齒蛉幼蟲(chóng)打斗受傷后24 h，傷口不再有液體流出并開(kāi)始結(jié)痂（圖5：A）；48 h后，傷口黑色變淡，并開(kāi)始出現(xiàn)1層半透明薄膜（圖5：B）；72 h后，傷口逐漸恢復(fù)，凹陷逐漸減輕（圖5：C）；120 h后，傷口幾乎復(fù)原，只有受傷后的痕跡和1個(gè)很小的黑色疤痕（圖5：D）。這類(lèi)傷口在恢復(fù)期幾乎全是凹陷，隨著時(shí)間推移，傷口逐漸平整。

圖5 普通齒蛉幼蟲(chóng)的傷口愈合情況Fig.5 Wound healing of uninfected Neoneuromus ignobilis larvae

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果和之前的研究都表明節(jié)間膜是蟲(chóng)生真菌侵入的主要部位（張愛(ài)文等，1994；王曉紅等，2009；鄧彩萍等，2012），這可能是因?yàn)楣?jié)間膜較薄，有利于菌絲的穿透。球孢白僵菌孢子在各種幼蟲(chóng)蟲(chóng)體表面平緩的體壁區(qū)產(chǎn)生附著胞，而有的則以粗度和菌絲大小一致的芽管形式進(jìn)入，進(jìn)入后還帶有主動(dòng)尋求適合侵染位點(diǎn)的功能，在不適合的體表部位又進(jìn)行了平行繁殖，直到遇到適合的侵染位點(diǎn)才發(fā)生侵染，說(shuō)明球孢白僵菌對(duì)進(jìn)入普通齒蛉幼蟲(chóng)的表皮部位存在一定的選擇性，這或許與各個(gè)部位的表面構(gòu)造不同有關(guān)。研究結(jié)果表明，正常蟲(chóng)體分生孢子萌發(fā)的時(shí)間大約為12 h，在24 h左右時(shí)，大部分分生孢子侵入蟲(chóng)體，感染傷口的普通齒蛉幼蟲(chóng)與感染正常蟲(chóng)體的試蟲(chóng)死亡時(shí)間提前約12 h。在傷口的位置，球孢白僵菌侵入速度更快，可能是與傷口部位較為粗糙、適合分生孢子的附著，以及不需要再尋找較薄的表皮即可侵入蟲(chóng)體有關(guān)。

應(yīng)用球孢白僵菌進(jìn)行生物防治時(shí)發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)蟲(chóng)齡越小，越易感?。鞠阍疲瑮铋L(zhǎng)舉，2003；仝亞娟等，2010；賀然等，2020）。普通齒蛉生活史較長(zhǎng)，可達(dá)1～2年（劉星月，2008），易成為白僵菌的寄主。學(xué)者對(duì)球孢白僵菌侵染昆蟲(chóng)寄主過(guò)程的研究一般著眼于如何殺滅昆蟲(chóng)，用于生物防治，且研究對(duì)象多為陸生昆蟲(chóng)（王曉紅等，2008；王龍江等，2010；王雅卉等，2011；張艷梅等，2011；曹慶杰等，2015；申宇等，2018；劉忱，郭志紅，2019），但旨在避免球孢白僵菌侵染昆蟲(chóng)（尤其是水生昆蟲(chóng)），從而提高資源昆蟲(chóng)養(yǎng)殖成活率的研究鮮有。本文選取具有代表性的水生資源昆蟲(chóng)——普通齒蛉為研究對(duì)象，研究了球孢白僵菌侵染正常試蟲(chóng)體表和傷口的過(guò)程和感病情況，對(duì)降低普通齒蛉人工養(yǎng)殖過(guò)程中因球孢白僵菌侵染而造成的死亡提供了理論依據(jù)，也豐富了球孢白僵菌侵染不同生態(tài)類(lèi)型昆蟲(chóng)的研究。