老年2型糖尿病合并牙周炎患者牙周病原菌檢測情況分析

謝 芬,孫小春,周美燕,陳向瓊,鄭 旭

(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 口腔科,海南 海口570102)

牙周炎是由牙周病原菌引發(fā)的牙周組織感染性疾病，是人體失牙的主要因素之一[1-2]。相關研究表明，牙周炎與2型糖尿病(T2DM)能夠相互促進，這是由于T2DM會在一定程度改變患者口腔免疫功能及微生態(tài)情況[3-6]?；颊啐l下菌斑病原菌最為常見的有具核梭桿菌(Fn)、牙齦卟啉單胞菌(Pg)等，但老年T2DM合并牙周炎患者血糖水平是否能影響其齦下菌斑病原菌情況還未有確切定論[7]。本研究通過檢測老年T2DM合并牙周炎患者牙周病原菌情況，分析患者牙周病原菌感染與T2DM的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年4月-2021年9月海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院收治的61例單純性牙周炎老年患者作為單純組，納入標準：(1)患者存在明顯的菌斑；(2)出現(xiàn)牙齦炎癥情況；(3)探診深度(PD)≥4 mm，附著喪失≥1 mm。排除標準：(1)患者存在全身系統(tǒng)性疾??；(2)侵襲性牙周炎；(3)參與本研究前3個月內使用過抗生素，或1年內實施基礎牙周治療者。另選取同期37例T2DM合并牙周炎老年患者歸為合并組，納入標準：(1)患者空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或糖化血紅蛋白(HbAlc)≥6.5%；(2)口服糖耐量試驗2 h血糖≥11.1 mmol/L；(3)并符合單純組的其他納入標準。排除標準：(1)伴有其他全身系統(tǒng)性疾??；(2)哺乳期或妊娠期婦女；(3)參與本研究前3個月內使用過抗生素或激素類藥物。兩組患者對本研究知情且自主同意參與。其中單純組男27例，女34例，年齡65-78(68.47±3.15)歲；合并組男17例，女20例，年齡66-79(68.49±3.18)歲。兩組患者的基線資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究符合并得到本院倫理委員會審批批準。

1.2 方法

標本采集：使用Gracey無菌刮治器刮取受檢者上下頜第一磨牙頰舌側齦下菌斑，將取樣點隔濕后去除齦上菌斑，再以刮治器刮取患者齦下菌斑，并置于PBS緩沖液中，在-80℃狀態(tài)下保存。

細菌裂解與DNA提?。簩吮驹?2 000 rpm下進行離心處理，時間為2 min，棄去上清液，加入20L Proteinase K、180 μl Buffer GL、10 μl RNase A充分振蕩后，在56℃水浴中溫育10 min。加入200 μl乙醇(100%)、200 μl Buffer GB充分混勻，在12 000 rpm下進行離心處理，時間為2 min，棄去濾液；加入500 μl Buffer WA，在12 000 rpm下進行離心處理，時間為1 min，棄去濾液；加入700 μl Buffer WB，在12 000 rpm下進行離心處理，時間為1 min，棄去濾液；再次加入700 μl Buffer WB，在12 000 rpm下進行離心處理，時間為1 min，棄去濾液；12 000 rpm下再次2 min離心處理后，置于1.5 ml離心管，加入200 μl Elution Buffer，于室溫下靜置5 min，于12 000 rpm下離心處理后2 min，洗脫DNA。

引物合成：病原菌印務來自16S rRNA對菌斑總DNA進行擴增，包括伴放線放線桿菌(Aa)、直腸彎曲桿菌(Cr)、Fn、Pg、微小消化鏈球菌(Pm)、中間普氏菌(Pi)、變黑普氏菌(Pn)、福塞氏坦氏菌(Tf)，由大連寶生物工程有限公司合成，見表1。

表1 齦下菌斑病原菌引物序列、退火溫度、擴增片段

細菌16SrRNA定性檢測，多重PCR擴增：于50 μl體系Qiagen熱啟動PCR中加入10L標本。所有PCR反應重復3次。陰性對照以同體積的三蒸水代替DNA樣品。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 兩組患者齦下菌斑病原菌檢出率對比

合并組齦下菌斑除Fn外，其余病原菌檢出率高于單純組Aa(24.32%vs.0.00%)、Cr(100.00%vs.81.97%)、Pg(100.00%vs.83.61%)、Pm(29.73%vs.4.92%)、Pi(59.46%vs.37.70%)、Pn(78.38%vs.42.62%)、Tf(94.59%vs.55.74%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者齦下菌斑病原菌檢出率對比[例(%)]

2.2 兩組患者齦下菌斑病原菌數量對比

合并組齦下菌斑Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf病原菌數量高于單純組(P<0.05)，兩組齦下菌斑Fn病原菌數量對比無差異(P>0.05)，見表3。

表3 兩組患者齦下菌斑病原菌數量對比

2.3 兩組患者HbAlc、FPG水平對比

合并組HbAlc、FPG水平高于單純組(P<0.05)，見表4。

表4 兩組患者HbAlc、FPG水平對比

2.4 齦下菌斑病原菌數量與患者HbAlc、FPG水平的相關性分析

經Pearson分析結果顯示，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf數量與HbAlc水平存在正相關(r=0.523、0.674、0.406、0.514、0.662、0.447、0.470，P<0.05)，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf數量與FPG水平存在正相關(r=0.679、0.307、0.624、0.450、0.453、0.387、0.695，P<0.05)，見圖1。

圖1 齦下菌斑病原菌數量與患者HbAlc、FPG水平的相關性分析

3 討論

牙周炎作為口腔常見疾病之一，患者牙周病原菌及其代謝產物在炎癥反應過程中起到重大作用[8-9]。而T2DM與機體代謝紊亂存在密切聯(lián)系，且近幾年來T2DM的患病率在不斷提升，年齡偏大的牙周炎患者患病率也呈現(xiàn)出上升趨勢，病原菌感染、炎癥反應是牙周炎與T2DM相同的病理基礎，因此可能存在雙向促進關系[10-11]。

牙菌斑是一種細菌性生物膜，齦下菌斑病原菌在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重大作用，牙菌斑生物膜為一種復雜性生態(tài)群體，有著較為獨特的病原菌生理學功能及生物膜結構[12-13]。有相關研究表明，齦下病原菌的聚集存在一定的規(guī)律，依據其聚集特點及患者牙周情況，口腔病原菌可按照顏色進行分級，其中Pg、Tf等為紅色復合體，在牙周炎的發(fā)展過程中息息相關，而橙色第二復合體包括Fn牙周亞種、Pm、Pi、Pn等，也均參與牙周炎的發(fā)展[14-15]。齦下病原菌的優(yōu)勢菌主要以革蘭陰性厭氧菌，如Cr、Pg、Pi、Tf等，病原菌在患者牙周袋內形成，最后致使牙周炎的發(fā)生[16-17]。本研究結果顯示，雖兩組齦下菌斑Fn病原菌檢出率對比無差異(P>0.05)，但其余病原菌檢出率高于單純組Aa(24.32%vs.0.00%)、Cr(100.00%vs.81.97%)、Pg(100.00%vs.83.61%)、Pm(29.73%vs.4.92%)、Pi(59.46%vs.37.70%)、Pn(78.38%vs.42.62%)、Tf(94.59%vs.55.74%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明老年T2DM合并牙周炎患者多數齦下菌斑病原菌檢出率更高，提示患者出現(xiàn)T2DM可能與牙周炎存在相互促進作用，這是由于牙周病原菌可從損傷的牙周袋內壁進入機體血液循環(huán)或其他器官，進而導致血管發(fā)生炎癥反應，刺激牙周膜上的成纖維細胞分泌更多的炎癥因子，進而通過體循環(huán)運送至機體各處，影響患者血糖血脂的正常代謝[18-19]。

孟琳[20]等學者的研究探討牙周炎合并T2DM患者血清炎性因子、糖脂代謝的變化，結果顯示牙周炎伴T2DM患者FPG、空腹胰島素(Fins)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平與PD SBI水平存在正相關(r=0.533、0.574、0.649、0.628、0.594、0.614、0.633、0.671，P<0.05)。而本研究通過檢測兩組齦下菌斑病原菌數量及HbAlc、FPG水平，探討牙周病原菌與T2DM的關系，結果顯示，合并組齦下菌斑Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf病原菌數量及HbAlc、FPG水平均高于單純組(P<0.05)，再經Pearson分析結果顯示，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf數量與HbAlc水平存在正相關(r=0.523、0.674、0.406、0.514、0.662、0.447、0.470，P<0.05)，Aa、Cr、Pg、Pm、Pi、Pn、Tf數量與FPG水平存在正相關(r=0.679、0.307、0.624、0.450、0.453、0.387、0.695，P<0.05)，提示老年T2DM合并牙周炎患者齦下菌斑病原菌與其血糖水平存在明顯相關性，患者血糖水平越高，其病原菌越多，出現(xiàn)牙周炎的幾率就越大。這是由于T2DM為一種先天性免疫性疾病，而炎癥反應在該病的發(fā)病機制中起著媒介作用，炎癥又是牙周炎的啟動因子，并可通過胰島素受體活性的抑制加重牙周炎[21-22]。

綜上所述，老年T2DM合并牙周炎患者相較于單純牙周炎患者具有更高的齦下菌斑病原菌檢出率，且多數病原菌數量較高，其病原菌數量與患者血糖水平存在明顯相關性，說明血糖水平能影響老年牙周炎患者病原菌情況，為臨床診治提供一定依據。