火炭母緩解鼠傷寒沙門菌致小鼠肝損傷的機(jī)制研究

沈幸玲，丁康寧，王幽叢，張易安，劉逸雷，劉涵笑，唐陸平，何永明

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,佛山 528225)

鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium)是一種食源性病原體，可經(jīng)消化道、呼吸道等途徑傳播[1]，主要侵害人和動物的腸道。其通過復(fù)雜的途徑入侵宿主并進(jìn)行復(fù)制[2]，易導(dǎo)致一系列病癥，包括胃腸炎、菌血癥和局部感染，也會引起肝損傷，主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤、嚴(yán)重充血、肝細(xì)胞凋亡和肝臟氧化損傷、變性和壞死等[3-4]。沙門菌的血清型眾多且菌株復(fù)雜，因環(huán)境不同而產(chǎn)生差異菌株，防控極其困難[5]。中國中獸藥資源豐富，應(yīng)用歷史悠久，且毒副作用小、安全有效，在細(xì)菌和病毒感染疾病防治方面取得了顯著成績[6]?；鹛磕?PolygonumchinenseL.,PCL)是一種蓼科植物，主要分布于中國的西南地區(qū)，含有多種多酚，如槲皮素、沒食子酸、表兒茶素、綠原酸等，具有良好的抗氧化、抗菌、消炎、止瀉作用，常用于治療腹瀉、腸炎、痢疾和肝炎等疾病[7]。鑒于火炭母具有良好的抗菌消炎功效，且對小鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用，本研究擬建立鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型，探討火炭母對其肝臟的保護(hù)作用及可能的機(jī)制，以期開發(fā)一款中藥制劑，用于預(yù)防或治療鼠傷寒沙門菌所致的肝損傷。

1 材料與方法

1.1 菌株及試驗動物

鼠傷寒沙門菌菌株(編號：14028，半數(shù)致死量(LD50)為5×104CFU/mL)由廣東省微生物菌種保藏中心提供。48只3～5周齡，體重14～16 g的雄性健康SPF級BALB/c小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：44007200083689。所有動物飼養(yǎng)于佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物室，室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，12 h光/暗循環(huán)。提供嚙齒動物標(biāo)準(zhǔn)飲食，小鼠自由飲水、飲食。所有動物工作均按照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部制定的《實驗動物護(hù)理和使用指南》(批準(zhǔn)文號：2006—398)進(jìn)行，并經(jīng)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

火炭母(批號：190501,北京同仁堂中藥有限公司)；慶大霉素(Sigma公司)；亮綠瓊脂培養(yǎng)基(Solarbio公司)；α干擾素(IFN-α)抗體、IFN-β抗體、IFN-γ抗體、腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體、白介素1β(IL-1β)抗體、TANK結(jié)合激酶1(TBK1)抗體、磷酸化TANK結(jié)合激酶1(P-TBK1)抗體、干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)抗體、磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(P-IRF3)抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Cell Signaling Technology公司)；ECL(增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑)發(fā)光底液(Bio-Rad公司)。

1.3 火炭母口服液制備與主要成分測定

火炭母藥材以藥液比1∶20加入超純水，浸泡0.5 h，煎煮1 h，收集藥液，共煎煮3次，合并藥液，紗布過濾，蒸發(fā)濃縮至分別含生藥0.8、0.4和0.2 g/mL的火炭母口服液，置于4 ℃密封保存。

利用高效液相色譜法(HPLC)檢測火炭母主要化學(xué)成分。主要材料為Ecosil C18 5 μm,4.6×250 mm色譜柱，使用梯度程序：A液為0.1%磷酸水溶液，B液為乙腈；50 min內(nèi)從15% A液到30% A液的線性梯度，15% A液持續(xù)25 min，以0.5 mL/min的流速洗脫火炭母中的化合物，在260 nm處檢測，柱溫控制在40 ℃，進(jìn)樣量20 μL。檢測前色譜柱先用流動相平衡10～30 min，所有檢測樣品進(jìn)樣前均先經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

1.4 試驗動物飼養(yǎng)與給藥

將48只試驗小鼠隨機(jī)分為6組：空白對照組(NC)、模型組(MOD)、陽性藥物組(PC,鼠傷寒沙門菌+20 mg/kg慶大霉素(GM))、火炭母高劑量組(PCL-H,鼠傷寒沙門菌+16 g/kg火炭母)、火炭母中劑量組(PCL-M,鼠傷寒沙門菌+8 g/kg火炭母)和火炭母低劑量組(PCL-L,鼠傷寒沙門菌+4 g/kg火炭母)，每組8只。給藥體積為2 mL/100 g，陽性藥物組灌胃給予慶大霉素溶液，火炭母高、中、低劑量組分別灌胃給予0.8、0.4和0.2 g/mL火炭母口服液，模型組和空白對照組小鼠灌胃等體積的PBS，預(yù)防性給藥2 d后，除空白對照組外，其他組小鼠一次性灌胃0.2 mL 5×104CFU/mL鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)感染，空白對照組灌胃等體積PBS，繼續(xù)給藥6 d，采用乙醚麻醉再頸椎脫臼處死所有小鼠，解剖取肝臟組織備用。

1.5 肝臟組織病理檢查

取各組小鼠肝臟的相同部位，在4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，進(jìn)行切片，厚度3～5 μm，展片、脫蠟后，采用HE染色，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下鏡檢，觀察小鼠肝臟組織病理學(xué)特征及變化。

1.6 鼠傷寒沙門菌細(xì)菌負(fù)荷測定

稱取約0.02 g肝臟組織于1 mL預(yù)冷的PBS中，經(jīng)組織破碎儀破碎，進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取各濃度勻漿液100 μL至亮綠瓊脂無菌培養(yǎng)板中，每個梯度3個重復(fù)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄培養(yǎng)基表面的單個菌落數(shù)，計算載菌量。

1.7 Western blotting分析小鼠肝臟蛋白表達(dá)量

將細(xì)胞組織快速裂解液(RIPA Lysis Buffer)與苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制劑(PMSF)100∶1混合，用于提取小鼠肝臟的總蛋白；經(jīng)SDS-PAGE分離，低溫下濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；TBST清洗PVDF膜；將PVDF膜分別與IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IRF3、P-IRF3、TBK1、P-TBK1一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST清洗3次，每次10 min；用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min；ECL發(fā)光底液進(jìn)行顯色，通過 Image J軟件分析蛋白質(zhì)的相對強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 火炭母口服液主要成分及其含量測定結(jié)果

火炭母的HPLC指紋圖見圖1。沒食子酸(峰1)、綠原酸(峰2)和金絲桃苷(峰3)是火炭母的主要化學(xué)成分，試驗中火炭母口服液的3種指示成分質(zhì)量控制如下：沒食子酸≥0.9 mg/g，綠原酸≥2.5 mg/g，金絲桃苷≥4.7 mg/g。

峰1，沒食子酸；峰2，綠原酸；峰3，金絲桃苷

2.2 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟病理變化的影響

空白對照組小鼠肝臟中肝小葉結(jié)構(gòu)完整；肝細(xì)胞以中央靜脈為中心放射狀排列，胞質(zhì)染色不均勻，HE染色可見大量空泡，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，呈不等數(shù)量分葉，細(xì)胞膜染成紅色，細(xì)胞邊界清晰；竇狀隙中存在少量炎癥細(xì)胞(圖2A)。模型組小鼠肝臟中央靜脈邊界不清，血管通透性增加，大量炎性細(xì)胞進(jìn)入血管(以淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主)，肝臟組織有紅細(xì)胞滲出；肝細(xì)胞排列紊亂，明顯腫脹，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，胞質(zhì)染色加深，空泡減少，可見肝細(xì)胞壞死和凋亡，邊界不清晰；肝竇炎性細(xì)胞增多(圖2B)。陽性藥物組小鼠肝臟組織中炎癥反應(yīng)明顯減少，少量紅細(xì)胞滲出，肝細(xì)胞壞死的情況明顯減輕，肝細(xì)胞輕度腫脹，排列紊亂(圖2C)?；鹛磕父邉┝拷M小鼠肝臟組織中肝細(xì)胞腫脹、排列紊亂、胞質(zhì)染色深，部分肝細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，輕微淤血(圖2D)；火炭母中劑量組小鼠肝細(xì)胞輕微腫脹、排列紊亂，少量炎癥細(xì)胞浸潤、紅細(xì)胞滲出、肝細(xì)胞及凋亡的情況得到極大的改善(圖2E)；火炭母低劑量組小鼠肝細(xì)胞輕微腫脹、排列紊亂、胞質(zhì)染色深，少量炎癥細(xì)胞浸潤，未見明顯的淤血和肝細(xì)胞壞死(圖2F)?；鹛磕钢?、低劑量組的恢復(fù)程度較高劑量組好，與陽性藥物組差別不大。

①A，空白對照組；B，模型組；C，陽性藥物組；D，火炭母高劑量組；E，火炭母中劑量組；F，火炭母低劑量組。②a，肝細(xì)胞腫脹；b，炎癥細(xì)胞浸潤；c，血細(xì)胞滲出；d，肝細(xì)胞壞死和凋亡

2.3 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟載菌量的影響

由圖3可知，相對于空白對照組，模型組小鼠肝臟中鼠傷寒沙門菌負(fù)荷顯著增加(P<0.05)。與模型組小鼠相比，陽性藥物組和火炭母各劑量組小鼠肝臟中鼠傷寒沙門菌生長明顯受到抑制(P<0.05)；其中陽性藥物組和火炭母中、低劑量組小鼠肝臟中未能檢測到鼠傷寒沙門菌的菌落，而火炭母高劑量組仍有鼠傷寒沙門菌附著，但比模型組小鼠肝臟的載菌量顯著減少(P<0.05)。

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.4 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟IRF3及TBK1表達(dá)的影響

由圖4可知，與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟中IRF3蛋白及其磷酸化蛋白P-IRF3的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組小鼠相比，陽性藥物組和火炭母各劑量組小鼠IRF3蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05)；陽性藥物組和火炭母高、中劑量組小鼠肝臟中P-IRF3表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05)，火炭母低劑量組P-IRF3表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)。

圖4 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟IRF3和TBK1蛋白表達(dá)的影響

模型組小鼠肝臟中TBK1和P-TBK1蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。與模型組對比，陽性藥物組的TBK1和P-TBK1蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)；而火炭母各劑量組小鼠肝臟中TBK1的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，P-TBK1表達(dá)量則顯著上升(P<0.05)。

2.5 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟中干擾素表達(dá)水平的影響

由圖5可知，與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠肝臟中IFN-α、IFN-β和IFN-γ水平均顯著下降(P<0.05)。與模型組小鼠相比，陽性藥物組及火炭母高、中劑量組小鼠肝臟中IFN-α、IFN-β和IFN-γ表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05)；火炭母低劑量組則較模型組顯著下降(P<0.05)。

圖5 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟干擾素表達(dá)的影響

2.6 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟中TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)的影響

由圖6可知，與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟中TNF-α和IL-1β蛋白水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，陽性藥物組小鼠肝臟中TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；火炭母各劑量組小鼠肝臟中TNF-α表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；火炭母中、低劑量組小鼠IL-1β水平表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而火炭母高劑量組中IL-1β表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

圖6 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟中TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

3 討 論

中藥化學(xué)成分是保肝藥物的研究熱點之一[8]，多糖、苷類、黃酮、生物堿等可對肝臟進(jìn)行有效保護(hù)[9-10]。中藥在抗微生物感染領(lǐng)域的研究較多，如中藥黃連、大黃、柴胡等對金黃色葡萄球菌有較好的消除作用[11]；而以金銀花、連翹和黃芩配伍的雙黃連可溶性粉的黃酮組分可發(fā)揮抑菌作用[12]。若能合理使用中藥，減少抗生素的使用頻率，將有助于減少耐藥菌的產(chǎn)生。火炭母有酚酸類、甾體類、黃酮類、揮發(fā)油等化學(xué)成分，可發(fā)揮抗炎止痛、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腹瀉等藥理作用[13]。本實驗室首次對廣東產(chǎn)火炭母的主要化學(xué)成分沒食子酸、綠原酸(酚酸類)和金絲桃苷(黃酮醇苷類)同時進(jìn)行含量測定，以保證藥材品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸具有護(hù)肝、抑菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、止血、保護(hù)心血管等多種生物活性[14-15]；綠原酸對多種細(xì)菌表現(xiàn)出明顯的抗菌活性[16]，且對肝臟疾病也有治療作用[17-18]；金絲桃苷對酒精性肝炎和非酒精性脂肪肝疾病都有一定的療效[19-20]，火炭母或許可通過這些化學(xué)成分抗微生物感染，對肝臟起保護(hù)作用。

肝臟具有一定的免疫功能，在炎癥的發(fā)生、維持和消退方面具有重要作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門菌感染后小鼠肝臟出現(xiàn)明顯病變，表現(xiàn)為肝臟組織淤血，炎癥明顯，肝細(xì)胞染色加深、明顯腫脹、排列紊亂，可見區(qū)域性的肝細(xì)胞壞死和凋亡。從肝臟病理切片的結(jié)果來看，火炭母的抗炎效果雖不及慶大霉素，但仍能有效改善鼠傷寒沙門菌感染小鼠肝臟中的炎癥反應(yīng)，且能減少肝臟組織淤血、肝細(xì)胞壞死及凋亡。載菌量結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟中鼠傷寒沙門菌負(fù)荷極高，空白對照組、陽性藥物組、火炭母中、低劑量組均未檢測出菌落生長，火炭母高劑量組有少量鼠傷寒沙門菌。以上結(jié)果提示，火炭母口服液對鼠傷寒沙門菌引起的小鼠肝損傷起到很好的治療效果，其作用效果與火炭母的使用濃度有關(guān)，其中高劑量的火炭母在改善肝損傷及抑制鼠傷寒沙門菌生長方面不如中、低劑量的火炭母效果好，可能是此藥物作用范圍較窄，超過最佳劑量后隨著濃度升高藥物作用效果反而下降了。

機(jī)體的固有免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(PRR)識別病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，可經(jīng)過由IFN-β TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白聯(lián)接的信號通路(TRIF依賴性通路)，激活TBK1復(fù)合物，進(jìn)一步促進(jìn)IRF3的活化與磷酸化[22]。當(dāng)IRF3被磷酸化激活后易位到細(xì)胞核并啟動IFN-Ⅰ的表達(dá)[23-24]。IFN是一類糖蛋白，有廣譜的抗病毒作用，可激活免疫細(xì)胞、干擾病原體復(fù)制，提高IFN的產(chǎn)生可改善鼠傷寒沙門菌引起的疾病[25-26]。鼠傷寒沙門菌感染通常能導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，伴隨著炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的分泌，如TNF-α和IL-1β[27]。促炎細(xì)胞因子的生物合成和分泌與動物肝損傷相關(guān)，機(jī)體中TNF-α和IL-1β表達(dá)水平在一定程度上體現(xiàn)了機(jī)體中炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱[28]。Li等[29]研究結(jié)果表明，肉雞感染鼠傷寒沙門菌后，空腸的TBK1、IRF3、IFN-α、IFN-γ含量均降低，而TNF-α、IL-1β水平增高。本研究同樣發(fā)現(xiàn)小鼠感染鼠傷寒沙門菌后肝臟中P-TBK1與TBK1的比例顯著降低，IRF3和P-IRF3的表達(dá)水平也明顯下降，IFN的表達(dá)水平明顯降低，而TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平則顯著升高。提示鼠傷寒沙門菌可能通過抑制TBK1的磷酸化及IRF3蛋白的產(chǎn)生和磷酸化，減少IFN的產(chǎn)生，降低機(jī)體抵御微生物感染的能力，增加受感染小鼠肝臟的炎癥反應(yīng)。中劑量的火炭母進(jìn)行干擾后，顯著提高了感染鼠傷寒沙門菌小鼠肝臟中的P-TBK1與TBK1的比例，激活產(chǎn)生IRF3和P-IRF3，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IFN，抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá)；而火炭母低劑量組P-IRF3、IFN水平較模型組低，可能是濃度較低不足以激活TBK1-IRF3通路，而通過其他途徑抑制沙門菌感染小鼠肝損傷；火炭母高劑量組IL-1β水平增高，可能是高濃度的火炭母口服液本身具有一定的肝毒性，影響其治療效果，具體原因尚待進(jìn)一步研究。Zhao等[30]研究結(jié)果表明，抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運體1(TAP1)可通過激活TBK1-IRF3介導(dǎo)的IFN-Ⅰ產(chǎn)生廣泛的抗病毒活性，其作用機(jī)制與本研究結(jié)果相似，推測火炭母可能通過增強(qiáng)TBK1磷酸化以激活I(lǐng)RF3，誘導(dǎo)大量IFN的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用，抵御鼠傷寒沙門菌的侵害，從而發(fā)揮保肝作用。但火炭母是否通過TRIF途徑、線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)途徑、干擾素基因刺激分子(STING)途徑調(diào)控TBK1-IRF3通路還有待驗證。

4 小 結(jié)

火炭母可通過上調(diào)TBK1-IRF3途徑誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用，改善鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，以8 g/kg使用劑量效果最佳。