寬譜大腸桿菌O157∶H7 CVCC4050噬菌體vB_EcoM_GXBP08的分離鑒定及特性分析

周雨晴，馬東鑫，吳 潔，王曉曄

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，南寧530004；2.防城港市行政審批服務中心，防城港 538000)

腸出血性大腸桿菌(EHEC)是近年來新發(fā)現(xiàn)的可引起較嚴重的健康危害的致病菌。大腸桿菌O157∶H7是EHEC中最常見的致病性大腸桿菌血清型，能引起人類出血性腹瀉，并發(fā)溶血性尿毒綜合征(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等，老人和兒童并發(fā)HUS時病死率可高達50%[1]。自20世紀80年代初，首起由大腸桿菌O157∶H7引發(fā)的食源性疾病暴發(fā)以來，大腸桿菌O157∶H7引起學者的廣泛關(guān)注。大腸桿菌O157∶H7在被污染的水、乳制品、果蔬中的檢出率較高，導致食源性疾病的頻繁發(fā)生[2]。近年來，由于抗生素的濫用，大腸桿菌O157∶H7對于抗生素的耐藥性日趨嚴重[3]，迫切需要開發(fā)一種有效的替代抗生素的新方法來控制大腸桿菌的污染和危害。目前，噬菌體的生物防治方法越來越被認為是減少細菌污染的前瞻性策略。與傳統(tǒng)的抗菌劑相比，噬菌體具有易獲得性、特異性、無毒性和對環(huán)境無害等優(yōu)點[4]，但大多數(shù)噬菌體只能抑制一株宿主菌的生長，從而限制了噬菌體的廣泛應用。因此，寬譜噬菌體的概念(即一株噬菌體能夠裂解多株細菌)被提出。目前，已知的寬譜大腸桿菌O157∶H7噬菌體相對較少。本研究分離并鑒定了1株寬譜大腸桿菌O157∶H7噬菌體vB_EcoM_GXBP08，并測定了該噬菌體的生物學特性和全基因組特征，為深入研究噬菌體與細菌的相互作用機制奠定理論基礎(chǔ)，為防治大腸桿菌O157∶H7在食品業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)中的感染提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和噬菌體來源 宿主菌大腸桿菌O157∶H7 CVCC4050和用于宿主譜測定的大腸桿菌O8∶K88 CVCC1527、腸炎沙門氏菌CVCC1806、鼠傷寒沙門氏菌CVCC3384均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)；用于宿主譜分析的其他菌株為廣西大學動物科學技術(shù)學院臨床實驗室保存；分離噬菌體的污水采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市某豬場。

1.1.2 主要試劑 LB固/液體培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、PEG8000、脫氧核糖核酸酶Ⅰ均購自北京索萊寶科技有限公司；NaCl和MgSO4均購自天津市科密歐化學試劑有限公司；細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；0.22 μm微孔濾膜購自天津津騰實驗設(shè)備有限公司；腸道致病性大腸桿菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離純化 采集豬場化糞池中污水樣品，利用不同濾膜孔徑大小除菌的方法獲得含有噬菌體的原液[5]。采用雙層瓊脂平板法檢測和篩選裂解性噬菌體，挑取單個噬菌斑反復進行多次單斑分離以純化噬菌體，直至雙層瓊脂平板上的噬菌斑透亮，形態(tài)、大小一致，即純化完成。采用雙層瓊脂平板法測定純化后噬菌體的效價[6]。

1.2.2 噬菌體透射電鏡觀察 噬菌體濃縮方法參考《分子克隆實驗指南》中的聚乙二醇沉淀法[7]。將純化濃縮后的噬菌體采用2%磷鎢酸(PTA，W/V)染色后，使用透射電子顯微鏡觀察形態(tài)學特征[8]。

1.2.3 噬菌體宿主譜的測定 將35株大腸桿菌和4株沙門氏菌用于噬菌體宿主譜的分析，采用空斑試驗進行測定，具體方法為：將100 μL大腸桿菌菌液加入到3 mL LB半固體培養(yǎng)基中，顛倒混勻后均勻倒入LB固體培養(yǎng)基上，待其晾干后，吸取10 μL噬菌體懸液滴加在菌苔表面，滴加等量生理鹽水作為對照，待液滴干燥后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h[9]，觀察結(jié)果。

1.2.4 噬菌體生物學特性分析 取新鮮培養(yǎng)的宿主菌菌液，按照感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)分別為100、10、1、0.1、0.01和0.001加入噬菌體裂解液和宿主菌菌液，利用雙層瓊脂平板法測定效價并評估噬菌體最佳MOI[10]。參考Shende等[11]方法測定噬菌體的一步生長曲線；參考Zhang等[12]方法測定溫度穩(wěn)定性及不同pH條件下噬菌體的酸堿穩(wěn)定性。

1.2.5 噬菌體殺菌效力測定 根據(jù)Zhang等[13]方法研究不同MOI下噬菌體在液體培養(yǎng)基中的殺菌效果。以大腸桿菌O157∶H7 CVCC4050為宿主菌，培養(yǎng)過夜并稀釋到1×108CFU/mL，取無菌試管12根，對照組(無噬菌體組)加入4 mL菌液和4 mL培養(yǎng)液，試驗組按照MOI為1、0.1、0.01分別加入4 mL菌液和4 mL不同濃度的噬菌體懸液，混勻后置于搖床中(37 ℃、180 r/min)震蕩，每隔1 h測一次細菌濃度D600 nm值。每個MOI做3個平行，測16 h。

1.2.6 噬菌體全基因組分析 運用堿裂法提取噬菌體DNA[13]，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組的完整性?；蛭膸鞓?gòu)建和全基因測序均由北京化工大學實驗室完成。使用GeneMarkS軟件對噬菌體全基因組進行基因預測。非編碼RNA的預測主要通過與Rfam數(shù)據(jù)庫進行比對獲得；使用RAST server[14]和BLASTN[15]對開放閱讀框(ORF)和蛋白質(zhì)編碼(CDS)序列進行預測和注釋；通過毒力因子數(shù)據(jù)庫[16]和抗生素耐藥綜合數(shù)據(jù)庫[17]篩選假定的毒力因子和抗生素耐藥性基因等；使用CGView Server[18]軟件繪制噬菌體全基因組圈圖；基于包括分離噬菌體在內(nèi)的20個噬菌體的主要衣殼蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；利用MegaX軟件對噬菌體進行進化分析；利用Easyfig_2.2.5_win軟件繪制噬菌體基因組多重線性比對圖。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體形態(tài)鑒定

以大腸桿菌O157∶H7 CVCC4050為宿主菌分離得到1株噬菌體，經(jīng)過6～8次純化后能形成大小一致、清澈透亮、邊緣整齊無暈圈的噬菌斑，直徑約為4 mm(圖1A)。經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該噬菌體有1個呈多面體對稱的頭部，直徑約為72 nm；有一個長約140 nm、寬約10 nm的尾部，尾鞘可收縮(圖1B)。根據(jù)國際病毒分類委員會分類規(guī)則判定，該噬菌體屬于有尾病毒目肌尾病毒科T4-like噬菌體屬，將該噬菌體命名為vB_EcoM_GXBP08。

A，噬菌體vB_EcoM_GXBP08的噬菌斑；B，噬菌體vB_EcoM_GXBP08的透射電鏡圖(30 000×)

2.2 噬菌體vB_EcoM_GXBP08的宿主譜測定

通過35株大腸桿菌和4株沙門氏菌對噬菌體vB_EcoM_GXBP08進行裂解能力評估，結(jié)果顯示，噬菌體vB_EcoM_GXBP08可裂解14株大腸桿菌，且只對大腸桿菌起裂解作用，特異性較強(表1)。

表1 噬菌體vB_EcoM_GXBP08的宿主譜

2.3 噬菌體vB_EcoM_GXBP08的生物學特性分析

MOI測定結(jié)果顯示，當MOI為1時，噬菌體的效價最高，為5.1×108PFU/mL，故噬菌體vB_EcoM_GXBP08的最佳MOI為1(圖2A)。一步生長曲線顯示，在0～20 min內(nèi)噬菌體效價基本不變，在20～70 min內(nèi)噬菌體迅速增長，之后效價基本維持在109PFU/mL，故噬菌體vB_EcoM_GXBP08的潛伏期約為20 min，爆發(fā)期約為50 min(圖2B)。經(jīng)計算，噬菌體vB_EcoM_GXBP08的爆發(fā)量約為154 PFU/cell。表明噬菌體vB_EcoM_GXBP08在感染宿主菌的過程中潛伏期較短、裂解期長、裂解能力強。酸堿穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示，噬菌體vB_EcoM_GXBP08的活性在pH 4.0～10.0時相對穩(wěn)定；在強酸性(pH 2.0～4.0)或強堿性(pH 10.0～12.0)條件下噬菌體的活性急劇下降；當pH≥11.0或pH≤3.0時，噬菌體處于失活狀態(tài)，即該噬菌體在強酸、強堿的條件下無法存活(圖2C)。熱穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示，當溫度在30～60 ℃時，噬菌體的效價可維持在108～109PFU/mL；當溫度≥60 ℃時，隨溫度的升高噬菌體活性逐漸下降；當溫度達到80 ℃時，培養(yǎng)1 h后噬菌體完全失活(圖2D)。

A，最佳感染復數(shù)；B，一步生長曲線；C，酸堿穩(wěn)定性；D，溫度穩(wěn)定性

2.4 噬菌體vB_EcoM_GXBP08的殺菌效力測定

通過將噬菌體vB_EcoM_GXBP08與宿主菌CVCC4050共培養(yǎng)測定D600nm值的方法來評估噬菌體在液體培養(yǎng)基中的殺菌效力，結(jié)果見圖3。由圖3可知，對照組即培養(yǎng)液中僅有宿主菌沒有噬菌體時，在培養(yǎng)16 h的過程中D600 nm值呈上升趨勢，并維持在一個較高水平；在培養(yǎng)液中加入噬菌體，當感染復數(shù)MOI為0.01和0.1時，D600 nm值先逐漸降低，培養(yǎng)5 h后又緩慢上升，最后維持在一個較低的水平，這可能是由于在最開始的5 h內(nèi)噬菌體發(fā)揮抑菌作用，細菌濃度降低；培養(yǎng)5 h后，由于噬菌體抗性菌株的生長，噬菌體不能很好地抑制細菌的生長繁殖，細菌濃度逐漸上升；當MOI為1時，細菌濃度先迅速下降再緩慢上升，最后維持在一個極低水平(D600 nm值≈0.3)，表明噬菌體能有效抑制細菌增殖，且殺菌效果明顯。相較于MOI為0.01和0.1，MOI為1時殺菌效果更為顯著。

圖3 噬菌體vB_EcoM_GXBP08的殺菌效果

2.5 噬菌體vB_EcoM_GXBP08全基因組分析

2.5.1 噬菌體vB_EcoM_GXBP08基因預測與功能注釋 噬菌體vB_EcoM_GXBP08具有雙鏈DNA的基因組，總長度為108 114 bp，GC含量為36.23%(圖4)。該噬菌體基因組中未發(fā)現(xiàn)與抗生素抗性、毒素、毒力因子有關(guān)的基因，說明噬菌體vB_EcoM_GXBP08在基因水平上是相對安全的。噬菌體vB_EcoM_GXBP08基因組共預測到177個CDS，有96個CDS(54.24%)編碼功能蛋白(圖4)。其中56個CDS編碼與DNA復制、修復、核苷酸修復有關(guān)的蛋白；14個CDS參與編碼噬菌體結(jié)構(gòu)、包裝相關(guān)蛋白；8個CDS與噬菌體裂解相關(guān)；7個CDS負責編碼與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的蛋白；11個CDS編碼其他功能蛋白(如硫氧還蛋白、谷氧還蛋白等)。

圖4 噬菌體vB_EcoM_GXBP08全基因組圈圖

2.5.2 噬菌體vB_EcoM_GXBP08基因組進化分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTN比對，噬菌體vB_EcoM_GXBP08的基因組DNA與大腸桿菌噬菌體vB_EcoM_JS09的基因組DNA(登錄號：NC_024124.2)具有高度相似性(96.88%)；與腸桿菌噬菌體phiC600P9的基因組DNA(登錄號：MZ681930.1)也具有較高的相似性(89.99%)?；诰幋a尾纖維蛋白的CDS112構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果顯示，噬菌體vB_EcoM_GXBP08與噬菌體vB_EcoM_JS09和phiC600P9位于同一分支，都屬于有尾噬菌體目肌尾噬菌體科(圖5)，與BLASTN比對結(jié)果一致。

圖5 噬菌體vB_EcoM_GXBP08系統(tǒng)進化樹

2.5.3 噬菌體vB_EcoM_GXBP08基因組多重線性比對 將大腸桿菌噬菌體vB_EcoM_GXBP08與腸桿菌噬菌體phiC600P9、大腸桿菌噬菌體vB_EcoM_JS09進行基因組多重線性比對，結(jié)果顯示，在大腸桿菌噬菌體vB_EcoM_GXBP08基因組中，共有176個保守蛋白與腸桿菌噬菌體phiC600P9基因組中的相應蛋白具有較高的相似性(>64%)；有154個保守蛋白與大腸桿菌噬菌體vB_EcoM_JS09基因組中的相應蛋白具有較高的相似性(>64%)。同源的蛋白主要包括DNA連接酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶、噬菌體尾纖維蛋白和主要衣殼蛋白(圖6)。

圖6 噬菌體vB_EcoM_GXBP08基因組的多重線性比對圖

3 討 論

噬菌體廣泛應用的主要限制之一是宿主范圍窄，較難獲得能夠有效裂解多個菌株的噬菌體，因此噬菌體雞尾酒和寬譜噬菌體被提出解決這一問題。然而，多個噬菌體聯(lián)合使用可能產(chǎn)生頡頏作用，導致復雜的藥理作用，從而影響抑菌效果。因此，分離寬譜噬菌體是一種較為可行的策略。本研究分離得到1株大腸桿菌O157∶H7 CVCC4050寬譜噬菌體vB_EcoM_GXBP08，可裂解不同來源(包括人源、豬源、牛源、禽源、犬貓源)和不同血清型(包括O157∶H7、O127a∶K63(B8)、O8∶K88)的大腸桿菌，但不能裂解不同種屬的細菌如沙門氏菌，表現(xiàn)出明顯的宿主特異性。也有研究報道了能夠同時裂解沙門氏菌和大腸桿菌的多價寬譜噬菌體[19-21]，這可能與噬菌體吸附細菌的尾纖維結(jié)構(gòu)有關(guān)。單株噬菌體能夠同時侵染不同種屬的細菌可能是由于具有共同受體導致的[22]。

噬菌體利用其受體結(jié)合蛋白(RBPs)與細菌表面的特定受體結(jié)合，包括尾纖維蛋白和尾刺蛋白。噬菌體vB_EcoM_GXBP08基因組中有8個負責編碼RBPs的CDS。由于RBPs與抗原的結(jié)合具有高度的特異性，噬菌體編碼不同的RBPs以匹配O抗原的多樣性[23]。這些RBPs使噬菌體能夠與脂多糖(LPS)的不同O抗原結(jié)合，使它們能夠識別不同的受體[24]，這可能是噬菌體vB_EcoM_GXBP08能夠裂解多種血清型大腸桿菌的重要原因之一。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTN比對結(jié)果，vB_EcoM_GXBP08基因組中編碼RBPs的8個CDS與大腸桿菌噬菌體對應蛋白的相似性較高(98.98%)，與沙門氏菌對應蛋白的相似性較低(69.07%)，這或許可以解釋該噬菌體為什么只能感染大腸桿菌，而不能感染沙門氏菌。

全基因組分析表明，裂解性噬菌體vB_EcoM_GXBP08屬于肌病毒科Tevenvirinae亞科Tequatrovirus屬。噬菌體vB_EcoM_GXBP08的基因組中未發(fā)現(xiàn)與毒力、溶源性和耐藥性相關(guān)的基因，反映了噬菌體vB_EcoM_GXBP08在病原菌生物防控應用中的安全性。噬菌體vB_EcoM_GXBP08的基因組巨大，共預測了177個CDS，其中96個CDS可編碼功能性蛋白。噬菌體vB_EcoM_GXBP08基因組編碼多種裂解蛋白，包括尾纖維蛋白(由CDS112、CDS113、CDS114、CDS115和CDS146編碼)、基板樞紐亞基(由CDS116編碼)、溶菌酶(由CDS148編碼)和穿孔素(由CDS111編碼)。穿孔素在裂解過程中與誘導宿主細胞膜去極化有關(guān)，并負責調(diào)節(jié)裂解時間[25]。這些蛋白與噬菌體裂解密切相關(guān)，協(xié)助噬菌體完成吸附、入侵、裂解和去除生物被膜，它們的存在使得噬菌體vB_EcoM_GXBP08具有廣泛的宿主范圍，并能夠高效抵抗浮游生物和生物被膜細胞[26]。在DNA復制、修復和核苷酸代謝方面，CDS54和CDS64編碼DNA連接酶，CDS65、CDS80、CDS120和CDS173編碼DNA解旋酶等。核酸內(nèi)切酶在DNA復制和調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，該酶由CDS175編碼。

研究表明，在60 ℃、pH 4.0～10.0范圍內(nèi)一些噬菌體仍然具有活性[27-28]。本研究中，噬菌體vB_EcoM_GXBP08在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，與前人研究結(jié)果一致。同時，vB_EcoM_GXBP08具有較強的熱穩(wěn)定性，在80 ℃高溫條件下培養(yǎng)0.5 h時仍能檢測到。相比之前報道的許多噬菌體而言，該噬菌體具有更強的耐熱性。這有利于將該噬菌體添加到高溫條件下滅菌，如與巴氏殺菌法結(jié)合應用于乳制品滅菌，應用前景廣泛。一步生長曲線反映了噬菌體的潛伏期和爆發(fā)量，是評價噬菌體應用潛力最有價值的指標之一。噬菌體vB_EcoM_GXBP08的潛伏期較短、爆發(fā)量較大，說明該噬菌體的感染和增殖速度快，而潛伏時間較短的噬菌體在一定時間內(nèi)能夠裂解更多的細菌，更適合于生物防治應用[29]。

4 結(jié) 論

本研究從豬場污水中分離到1株寬譜噬菌體vB_EcoM_GXBP08，能夠高效裂解14株大腸桿菌，對于不同宿主菌的裂解效價可達109～1010PFU/mL。噬菌體vB_EcoM_GXBP08熱穩(wěn)定性強、pH耐受范圍較寬、潛伏期短、爆發(fā)量大，全基因組中不含與抗生素抗性、毒素、溶源性和毒力因子相關(guān)的基因。此外，噬菌體vB_EcoM_GXBP08在MOI為1時能有效抑制液體培養(yǎng)基中大腸桿菌O157∶H7 CVCC4050的增殖，殺菌效果明顯，表明噬菌體vB_EcoM_GXBP08作為一種新型抗菌劑具有很大的應用潛力。