A：L1型鴨源多殺性巴氏桿菌滅活疫苗制備及免疫效力研究

田宇杰，李 婷，代國滔，蒲 齡，張亞楠，袁 超，楊茂生，陳 強(qiáng)，李美娟，徐景峨

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴陽 550006)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)隸屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬，為革蘭氏陰性兼性厭氧球桿狀菌，包含5個(gè)莢膜血清型，8個(gè)脂多糖基因型[1-3]。多殺性巴氏桿菌為條件致病菌，可引起野生動(dòng)物和各類畜禽產(chǎn)生以敗血癥和呼吸系統(tǒng)為主的疾病[4]，如牛出血性敗血癥[5]、禽霍亂[6-7]、豬萎縮性鼻炎[8]等。多殺性巴氏桿菌病的致病性、免疫原性、宿主特異性等與血清型相關(guān)，A型可以導(dǎo)致禽霍亂和豬肺疫，B型、E型可引起豬和牛出血性敗血病，而D型菌株則與豬萎縮性鼻炎有關(guān)[9-10]。該病的流行和暴發(fā)能夠?qū)︷B(yǎng)殖業(yè)造成難以估量的經(jīng)濟(jì)損失，威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[11]。

鴨多殺性巴氏桿菌病又稱為鴨出血性敗血癥、鴨霍亂等，各日齡鴨均易感，臨床上呈發(fā)病急、病程短、發(fā)病率及死亡率高的特點(diǎn)，傳統(tǒng)養(yǎng)殖過程中常通過抗生素等藥物來控制該病，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)和藥物殘留[12]。因此，通過疫苗免疫是從根本上實(shí)現(xiàn)防控該病的有效手段[13]。滅活疫苗因安全可靠、免疫效果良好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，常規(guī)滅活疫苗保護(hù)率為66.7%～83.3%[14]。研究表明，多殺性巴氏桿菌不同血清型菌株的生化特性、致病性、宿主嗜性和抗原性存在差異，不同血清型之間交叉保護(hù)力差[15]，給該病的防控造成了困難，所以利用地區(qū)流行的優(yōu)勢血清型多殺性巴氏桿菌分離株研制疫苗，能取得理想的預(yù)防效果。

近年來，貴州三穗麻鴨在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)多殺性巴氏桿菌病的發(fā)生和流行，在造成經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)也嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展[16]。在對貴州省多殺性巴氏桿菌的流行病學(xué)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，三穗麻鴨養(yǎng)殖場中主要流行多殺性巴氏桿菌A：L1型(莢膜基因型：脂多糖基因型)，本研究利用貴州地方流行的A：L1型多殺性巴氏桿菌菌株制備成滅活疫苗，通過與商品滅活疫苗的免疫效果及差異進(jìn)行研究，以保障貴州三穗麻鴨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 菌株及試驗(yàn)動(dòng)物

A：L1 ST128型鴨源多殺性巴氏桿菌貴州分離株由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室分離鑒定和保存。7日齡健康三穗麻鴨91只，購自貴州省三穗縣某養(yǎng)鴨場，血清母源抗體監(jiān)測均為陰性。其中25只用于半數(shù)致死量測定試驗(yàn)，18只用于疫苗安全性檢驗(yàn)，48只用于疫苗免疫試驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器

白油、司本-80和吐溫-80均由貴州福斯特生物科技有限公司饋贈(zèng)；卡波姆(971 P)購自北京國人逸康科技有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水乙醇、二甲苯均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4%多聚甲醛溶液、HE染液均購自Servicebio公司；禽多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗(批準(zhǔn)文號：獸藥生字151722015，生產(chǎn)批號201016，其佐劑為白油佐劑)購自山東濱州沃華生物工程有限公司。

臺式離心機(jī)(D3024)購自浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(THZ-98A)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-1F)購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50SII)購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 細(xì)菌生長曲線測定

取A：L1 ST128型鴨源多殺性巴氏桿菌分離株2.5 mL加入裝有60 mL含5% FBS的TSB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，混勻后分別吸取5 mL放入已編號的大試管中，分別標(biāo)記0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h；37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在相應(yīng)時(shí)間取出，同時(shí)以涂板法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)并繪制生長曲線[17]。

1.4 細(xì)菌半數(shù)致死量的測定

取多殺性巴氏桿菌分離株，于TSB液體培養(yǎng)基中增殖至菌液濃度為1.0×109CFU/mL后，分別按10倍倍比稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9共5個(gè)稀釋度，腿部肌內(nèi)注射7日齡三穗麻鴨，0.5 mL/只，每組各5只，攻毒后觀察并記錄1周內(nèi)發(fā)病死亡情況，應(yīng)用改良寇氏法[18]計(jì)算細(xì)菌半數(shù)致死量(LD50)。

1.5 疫苗的制備

取多殺性巴氏桿菌分離株于含5% FBS的TSB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至終濃度為1×1010CFU/mL后，加入甲醛至終濃度為0.2%，37 ℃、180 r/min振蕩24 h滅活備用。①白油佐劑滅活疫苗：取47 mL白油與3 mL司本-80混勻，作為油相；另取1.5 mL吐溫-80加入25 mL抗原中攪拌均勻，作為水相；油相經(jīng)乳化儀低速攪拌后加入水相，體積比為2∶1，再高速攪拌充分乳化后，制備成白油佐劑滅活疫苗(含菌量1010CFU/mL)，分裝保存于4 ℃?zhèn)溆?。②卡波姆佐劑疫苗：用超純水將稱取的卡波姆粉末膨脹過夜，調(diào)節(jié)pH至7.0，滅菌PBS定容至6 mg/mL，高壓滅菌后即為母液，將卡波姆母液與抗原按體積比2∶1混勻，制備成卡波姆終濃度為4 mg/mL的卡波姆佐劑滅活疫苗(含菌量1010CFU/mL)。

1.6 疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)

1.6.1 疫苗無菌檢驗(yàn) 將制備好的兩種滅活疫苗分別接種于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

1.6.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 取10 mL白油佐劑滅活疫苗于離心管中，3 000 r/min離心10 min，檢查有無分層現(xiàn)象。由于卡波姆佐劑為水佐劑離心檢驗(yàn)其穩(wěn)定性無意義，所以未做穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

1.6.3 疫苗保質(zhì)期檢驗(yàn) 將制備的白油佐劑滅活疫苗和卡波姆佐劑滅活疫苗4 ℃放置3個(gè)月，觀察外觀、性狀有無變化及有無分層現(xiàn)象。

1.6.4 疫苗安全性檢驗(yàn) 將18只20日齡健康三穗麻鴨隨機(jī)3組，6只/組，分別為白油佐劑滅活疫苗組、卡波姆佐劑滅活疫苗組和空白對照組，2個(gè)疫苗組分別腿部肌內(nèi)注射1 mL/只對應(yīng)滅活疫苗，空白對照組腿部肌內(nèi)注射1 mL/只無菌生理鹽水。免疫后連續(xù)7 d觀察各組鴨有無發(fā)病死亡情況和臨床癥狀，第7天剖解免疫鴨觀察是否有器官病變以及是否能分離出細(xì)菌。

1.7 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

1.7.1 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將32只健康試驗(yàn)鴨隨機(jī)分為4組，8只/組，分別為自制白油佐劑滅活疫苗組、卡波姆佐劑滅活疫苗組、商品滅活疫苗組和空白對照組。7日齡時(shí)，3個(gè)疫苗組分別注射對應(yīng)疫苗0.3 mL/只；空白對照組注射生理鹽水0.3 mL/只。21日齡對3個(gè)疫苗組進(jìn)行腿部肌內(nèi)注射相應(yīng)疫苗0.5 mL/只，加強(qiáng)免疫。分別于一免后10 d(17日齡)和二免后10 d(31日齡)按每只10 CFU劑量通過腿部肌內(nèi)注射A：L1 ST128型多殺性巴氏桿菌活菌進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，攻毒后觀察并記錄1周內(nèi)試驗(yàn)鴨發(fā)病死亡情況。

1.7.2 組織病理學(xué)變化 將16只健康三穗麻鴨隨機(jī)分為4組，4只/組，分別為自制白油佐劑滅活疫苗組、卡波姆佐劑滅活疫苗組、商品滅活疫苗組和空白對照組，參照1.7.1中免疫程序免疫雛鴨。按每只10 CFU劑量分別于一免后10 d(17日齡)和二免后10 d(31日齡)通過腿部肌內(nèi)注射A：L1 ST128型多殺性巴氏桿菌活菌進(jìn)行攻毒，分別于一免及二免后第3天攻毒后并撲殺試驗(yàn)鴨，每組2只，取肺臟、脾臟及肝臟組織，將采集的組織保存于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后進(jìn)行常規(guī)處理，石蠟包埋切片，蘇木素和伊紅(HE)染色后觀察病理組織學(xué)變化，觀察記錄病理性損傷情況。

2 結(jié) 果

2.1 多殺性巴氏桿菌的生長曲線和LD50測定結(jié)果

由圖1可知，A：L1 ST128型多殺性巴氏桿菌在0～4 h細(xì)菌生長緩慢，從8 h開始細(xì)菌快速生長，12～14 h為對數(shù)生長期，至18 h到達(dá)峰值，此時(shí)的D600 nm值為0.91，活菌數(shù)為1.0×1010CFU/mL，18 h后多殺性巴氏桿菌的生長進(jìn)入平臺期。按照改良寇氏法計(jì)算其LD50為5 CFU。

圖1 多殺性巴氏桿菌生長曲線

2.2 疫苗檢驗(yàn)

2.2.1 疫苗無菌檢驗(yàn)結(jié)果 將自制白油佐劑滅活疫苗和卡波姆佐劑滅活疫苗分別無菌接種于TSA平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后，平板無細(xì)菌生長，表明疫苗滅活完全。

2.2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 取自制的白油佐劑滅活疫苗滴于水面上不擴(kuò)散，離心后無分層現(xiàn)象，外觀性狀均無變化，表明乳化效果良好。

2.2.3 疫苗保質(zhì)期檢驗(yàn) 白油佐劑滅活疫苗和卡波姆佐劑滅活疫苗4 ℃條件下放置3個(gè)月，觀察發(fā)現(xiàn)，2種疫苗外觀、性狀無變化、無分層現(xiàn)象。

2.2.4 疫苗安全性檢驗(yàn) 將制備的2種滅活疫苗免疫鴨進(jìn)行安全性檢驗(yàn)，連續(xù)觀察7 d，各免疫組鴨精神狀況及食欲均正常，均無臨床癥狀和發(fā)病死亡情況；免疫后第7天解剖觀察，各組鴨內(nèi)臟器官無明顯病變；用臟器組織無菌接種TSA平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后均無菌生長。表明自制的2種疫苗安全性良好。

2.3 動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 一免后卡波姆佐劑滅活疫苗組、白油佐劑滅活疫苗組、商品滅活疫苗組和空白對照組保護(hù)率分別為62.5%(5/8)、50.0%(4/8)、50.0%(4/8)、0(0/8)；二次加強(qiáng)免疫后，卡波姆佐劑滅活疫苗組、白油佐劑滅活疫苗組、商品滅活疫苗組和空白對照組保護(hù)率分別為87.5%(7/8)、75.0%(6/8)、62.5%(5/8)、0(0/8)(表1)，疫苗通過二次加強(qiáng)免疫后能明顯提高保護(hù)率，且卡波姆佐劑滅活疫苗組保護(hù)率明顯高于自制白油佐劑滅活疫苗組和商品滅活疫苗組。

表1 鴨免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 不同組織病理學(xué)變化 由圖2可知，一免后10 d(17日齡)攻毒后各組試驗(yàn)鴨肝臟多處均出現(xiàn)明顯肝細(xì)胞灶性壞死，細(xì)胞核固縮碎裂；其中白油佐劑滅活疫苗組和商品滅活疫苗組出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞點(diǎn)狀浸潤，大量的肝竇淤血擴(kuò)張，卡波姆佐劑滅活疫苗組胞質(zhì)中可見微小的圓形空泡。各組試驗(yàn)鴨肺臟均出現(xiàn)明顯的毛細(xì)血管淤血現(xiàn)象，其中白油佐劑滅活疫苗組肺組織毛細(xì)血管的管腔內(nèi)可見明顯紅細(xì)胞；商品滅活疫苗組多見小灶性壞死；卡波姆組未見其他明顯異常。各組試驗(yàn)鴨脾臟均可見明顯壞死細(xì)胞胞核碎裂溶解現(xiàn)象，其中白油佐劑滅活疫苗組脾臟組織可見大面積的壞死，內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞明顯減少；商品滅活疫苗組白髓中淋巴細(xì)胞灶性壞死；卡波姆佐劑滅活疫苗組可見紅髓中實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，排列疏松。對照組各臟器均出現(xiàn)細(xì)胞壞死、細(xì)胞核溶解等現(xiàn)明顯病理變化。

①A，白油佐劑滅活疫苗組；B，商品滅活疫苗組；C，卡波姆佐劑滅活疫苗組；CK，空白對照組。②1，肝臟，2，肺臟，3，脾臟。下同

由圖3可知，二免后10 d(31日齡)各組攻毒后試驗(yàn)鴨肝臟均可見彌漫性的肝細(xì)胞氣球樣變，核居中，胞質(zhì)空泡化，其中白油佐劑滅活疫苗組出現(xiàn)大量肝竇淤血擴(kuò)張；商品滅活疫苗組匯管區(qū)周圍多見炎性細(xì)胞小灶性浸潤；卡波姆佐劑滅活疫苗組未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。各組試驗(yàn)鴨肺臟少量的副支氣管周圍可見炎性細(xì)胞小灶性浸潤，白油佐劑滅活疫苗組可見副支氣管出血，商品滅活疫苗組肺臟組織邊緣可見炎性細(xì)胞灶性浸潤，卡波姆組未見其他明顯異常。各組試驗(yàn)鴨脾臟均可見組織白髓中輕度出血，其中白油佐劑滅活疫苗組紅髓出現(xiàn)重度淤血；商品滅活疫苗組出現(xiàn)壞死細(xì)胞胞核固縮碎裂；卡波姆佐劑滅活疫苗組紅髓出現(xiàn)輕度淤血。對照組各臟器均出現(xiàn)細(xì)胞壞死、細(xì)胞核溶解等現(xiàn)明顯病理病變。

圖3 二免后試驗(yàn)鴨肝臟、肺臟、脾臟病理組織學(xué)變化(200×)

3 討 論

全球范圍內(nèi)流行的禽源多殺性巴氏桿菌血清型主要為A：L1型[19]，中國部分地區(qū)禽源多殺性巴氏桿菌流行情況與此相同，LPS流行基因型有L1、L2、L3和L6，禽源主要為A：L1型[20-22]，貴州地區(qū)報(bào)道的多殺性巴氏桿菌流行血清型也多為莢膜A型[23-25]。多殺性巴氏桿菌的感染具有宿主偏好的特性，A：L1型感染主要發(fā)生于禽類，A：L3型感染主要發(fā)生于兔，D：L6型感染主要發(fā)生于豬[26]。

莢膜和脂多糖與致病性和抗原性密切相關(guān)，是研發(fā)疫苗的重要免疫學(xué)基礎(chǔ)。本研究前期在三穗縣某鴨場病死鴨中分離鑒定得到血清型為A：L1型的多殺性巴氏桿菌分離株，分離株對氨芐西林、阿莫西林、左氧氟沙星和林可霉素產(chǎn)生耐藥性，其耐藥性的產(chǎn)生對貴州養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展造成潛在威脅[27]。加之多殺性巴氏桿菌血清型眾多，各血清型之間交叉保護(hù)力較弱，生產(chǎn)上難以選擇合適的疫苗，因此通過以地區(qū)流行血清型菌株制備疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，是有效防控該病的關(guān)鍵。

佐劑能夠顯著提高動(dòng)物機(jī)體對多殺性巴氏桿菌抗原特異性應(yīng)答水平，但是不同的佐劑對免疫效力的增強(qiáng)具有明顯差異[28],有研究表明菊粉作為佐劑可增強(qiáng)禽多殺性巴氏桿菌DNA疫苗的免疫效果，提高Th1型免疫應(yīng)答水平[29]，為佐劑的應(yīng)用提供了參考依據(jù)。不同佐劑的理化性質(zhì)不同，導(dǎo)致疫苗免疫后機(jī)體抗體水平和免疫副反應(yīng)也存在較大差異，通過佐劑的篩選可提高滅活疫苗的保護(hù)效果，減少免疫副反應(yīng)造成的損失。傳統(tǒng)滅活苗一般是以白油為主的油佐劑疫苗，保護(hù)期短、易造成免疫副反應(yīng)的發(fā)生?？ú窞槎嗑畚镱愖魟?，具有良好的安全性和穩(wěn)定性，作為疫苗佐劑可以通過儲庫作用增強(qiáng)疫苗免疫能力，目前已有多種商品化疫苗采用卡波姆作為水性佐劑或佐劑成分之一使用；卡波姆作為水佐劑可有效減少副反應(yīng)的發(fā)生，所制備疫苗能取得理想的免疫效果[30]。本試驗(yàn)選取貴州地區(qū)主要流行的A：L1型多殺性巴氏桿菌分離株，通過以卡波姆、白油為佐劑分別制備A：L1型多殺性巴氏桿菌滅活疫苗。試驗(yàn)結(jié)果表明，一免后卡波姆佐劑滅活疫苗組保護(hù)率最高，為62.5%。二次加強(qiáng)免疫后，各疫苗組保護(hù)率顯著提高，其中卡波姆佐劑滅活疫苗效果最佳，二次加強(qiáng)免疫后可使試驗(yàn)鴨獲得87.5%的保護(hù)率，而白油佐劑滅活疫苗組保護(hù)率為75.0%，商品滅活疫苗組保護(hù)率僅為62.5%。病理組織學(xué)結(jié)果顯示，卡波姆佐劑滅活疫苗能對主要組織器官提供更好的保護(hù)效果，表明自制多殺性巴氏桿菌滅活疫苗較市售商品疫苗更適于貴州省養(yǎng)鴨過程中對多殺性巴氏桿菌的免疫防控，卡波姆作為新型佐劑制備的滅活疫苗免疫效果最佳，可作為免疫防控該病的首選疫苗。

4 結(jié) 論

本研究針對貴州地區(qū)面臨的多殺性巴氏桿菌防控風(fēng)險(xiǎn)，采用當(dāng)?shù)亓餍械腁：L1型多殺性巴氏桿菌菌株制備卡波姆佐劑疫苗，免疫保護(hù)力最好，加強(qiáng)免疫后保護(hù)率可達(dá)87.5%，免疫副作用小，能有效防控該病在鴨群中的流行，具有廣闊的應(yīng)用前景。