豬丁型冠狀病毒N蛋白原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備

劉 銘，張永寧

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

豬丁型(δ)冠狀病毒(Porcinedeltacoronavirus，PDCoV)是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，在分類上屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)[1]。PDCoV是一種新發(fā)的豬腸道冠狀病毒，主要感染仔豬，可導(dǎo)致仔豬腹瀉、嘔吐、脫水和消瘦等臨床癥狀，嚴(yán)重者發(fā)生死亡，其他年齡段的豬包括母豬也可被感染，但以腹瀉為主要癥狀，已成為影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的重要病原之一[2-3]。2012年，Woo等[1]從2009-2010年間采集的豬糞便拭子中首次測得PDCoV的全基因組序列。2014年，Wang等[4-5]從美國俄亥俄州患腹瀉豬的糞便和腸道內(nèi)容物中再次獲得PDCoV的全基因組序列。隨后，Hu等[6]利用LLC-PK1細(xì)胞從患腹瀉豬的糞便和腸道中成功分離到1株P(guān)DCoV，并證實(shí)PDCoV已在美國多個(gè)州的豬群中廣泛流行[7-8]。截至目前，加拿大、中國、韓國、泰國、老撾、越南、日本、墨西哥等國家已報(bào)道存在PDCoV感染[9]。研究表明，PDCoV除了感染豬之外，還能感染野鳥、雞、牛等不同種屬動物[10]，說明該病毒具有潛在的跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)。2021年，有研究從3名具有發(fā)熱和腹痛癥狀的海地兒童血液中檢出PDCoV，表明PDCoV具有潛在的公共衛(wèi)生意義[11]。

PDCoV基因組全長25.4 kb左右，從N-端到C-端依次為5′-UTR、ORF1a/1b、刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M、輔助蛋白NS6、核衣殼蛋白N、輔助蛋白NS7、3′-UTR和Poly(A)尾[12-13]。PDCoV N蛋白是一種磷酸化的蛋白，與病毒基因組RNA結(jié)合形成核衣殼，主要起包裝病毒基因組RNA的作用[14-15]，并與M蛋白共同構(gòu)成病毒的核心。N蛋白不僅在PDCoV感染的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量豐富，可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，且在不同毒株之間相對保守，因此N蛋白已成為PDCoV的重要診斷靶標(biāo)[16]。采用傳統(tǒng)免疫方法，將抗原物質(zhì)經(jīng)不同途徑注入動物體內(nèi)，經(jīng)數(shù)次免疫后采集動物血液，分離血清，由此獲得的抗血清即為多克隆抗體(polyclonal antibody,PcAb)[17]，多克隆抗體可適應(yīng)后續(xù)大多數(shù)的血清學(xué)檢測，便于建立穩(wěn)定性較好的檢測方法。鑒于PDCoV感染導(dǎo)致的臨床癥狀與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PRoV)等感染引起的主要病毒性腹瀉十分相似，因此確診PDCoV感染需依靠實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)。本研究在原核表達(dá)與純化PDCoV N蛋白的基礎(chǔ)上制備其多克隆抗體，旨在為PDCoV血清學(xué)檢測方法的優(yōu)化及開展PDCoV相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞和載體 PDCoV CHN-HN-1601毒株(GenBank登錄號：MG832584.1)、PEDV BJ-2011-C毒株(GenBank登錄號：KX066126.1)、豬腸道甲型冠狀病毒(PEAV)GDZQ-2018毒株(GenBank登錄號：MW727454)、TGEV Jms 毒株、LLC-PK1細(xì)胞、Vero細(xì)胞、ST細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET-28a(+)均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；MA104細(xì)胞、PRoV OSU毒株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.1.2 試驗(yàn)動物 2月齡體重約1.8 kg的雌性新西蘭白兔購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。

1.1.3 主要試劑 ClonExpress?Ⅱ非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒(Vazyme公司)；BamH Ⅰ和XhoⅠ(New England BioLabs公司)；NP-40裂解液、DAPI細(xì)胞核染色液和IPTG(Solarbio?Life Sciences公司)；Ni-NTA瓊脂糖樹脂(Qiagen公司)；病毒RNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；Protein A/G瓊脂糖樹脂(Beyotime公司)；一步法RT-PCR試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG、HRP-山羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；ECL發(fā)光液(Engreen公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)PDCoV CHN-HN-1601毒株N基因序列設(shè)計(jì)1對引物，并在上、下游引物5′-端分別引入BamH Ⅰ和XhoⅠ的識別位點(diǎn)。上游引物：5′-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATG-

GCCGCACCAGTAGTC-3′(下劃線序列為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn));下游引物:5′-GTGGTGGTGGTGGTG-

GTGCTCGAGCGCTGCTGATTCCTGCTT-3′(下劃線序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。下游引物中N基因的終止密碼子(TAG)已被去除，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 071 bp，其中N基因?yàn)? 026 bp(不含終止密碼子)，其他堿基為同源臂序列。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 PDCoVN基因擴(kuò)增 利用病毒RNA提取試劑盒提取CHN-HN-1601毒株的基因組RNA，借助一步法RT-PCR擴(kuò)增PDCoVN基因序列。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×Reaction Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，SuperScriptTMⅡ Ⅰ RT/PlatinumTMTaqMix 2 μL，PDCoV RNA 10 μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：55 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min；94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離PCR產(chǎn)物，切膠純化回收。

1.2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 利用BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切回收后的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體，對酶切產(chǎn)物再次進(jìn)行膠回收后，借助同源重組技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-PDCoV-N。反應(yīng)體系20 μL：線性化載體112 ng，目的片段41 ng，5×CE Ⅱ Buffer 4 μL，Exnase Ⅱ 2 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL；37 ℃連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于含卡那霉素的LB平板進(jìn)行培養(yǎng)。挑取單菌落接種含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)繁后，抽提重組質(zhì)粒分別進(jìn)行BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定、PCR鑒定和質(zhì)粒測序鑒定。

1.2.4 重組PDCoV-N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于10 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振搖過夜培養(yǎng)；按1∶150的比例接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振搖培養(yǎng)至D600 nm值達(dá)0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)12 h。于誘導(dǎo)前后各收集1 mL菌液，8 000 r/min離心10 min，對菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。另取150 mL誘導(dǎo)12 h的菌液，8 000 r/min離心10 min，利用裂解液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH 8.0)重懸菌體沉淀，超聲波破碎菌體(300 W，破碎5 s，間歇5 s，180次)，10 000 r/min離心30 min，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組PDCoV-N蛋白的純化 利用20 mL裂解液重懸600 mL菌液的菌體沉淀，置冰上進(jìn)行超聲波破碎后，10 000 r/min離心30 min，收集上清液，利用0.22 μm濾器去除雜質(zhì)；向?yàn)V液中加入1 mL Ni-NTA瓊脂糖樹脂，4 ℃緩慢混勻12 h；將N蛋白與樹脂的混合液裝柱，分別利用10倍柱體積的洗滌液(咪唑濃度依次為20、75和100 mmol/L)各洗滌1次，最后利用1 mL洗脫液(咪唑濃度為250 mmol/L)洗脫重組N蛋白，利用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.6 重組PDCoV-N蛋白多克隆抗體的制備 于免疫前經(jīng)心臟采集15 mL兔血液用于血清分離，作為陰性對照血清。初次免疫按照1 mg/只的劑量將重組PDCoV-N蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭白兔；2周后加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫3次，每次間隔2周，每次免疫劑量為1 mg/只，蛋白改用不完全弗氏佐劑乳化，背部皮下多點(diǎn)注射免疫；末次加強(qiáng)免疫劑量為1.5 mg/只，耳緣靜脈注射，7 d后心臟采血。

1.2.7 多克隆抗體的純化與保存 利用Protein A/G瓊脂糖樹脂親和層析法純化多克隆抗體。將5 mL兔抗血清用0.22 μm濾器去除雜質(zhì)后過2遍柱子，經(jīng)TBS緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4)徹底洗滌后，利用甘氨酸洗脫液(pH 2.7)進(jìn)行洗脫，并借助Tris-HCl緩沖液(1 mol/L，pH 8.0)將洗脫液的pH調(diào)至7.4，防止抗體變性。利用TBS對純化后的多克隆抗體過夜透析，經(jīng)BCA法測定抗體濃度后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 多克隆抗體效價(jià)測定 利用間接ELISA測定多克隆抗體效價(jià)[18]。將重組PDCoV-N蛋白以200 ng/孔的劑量4 ℃過夜包被ELISA板；經(jīng)PBST洗滌后，利用含5%脫脂乳的PBS進(jìn)行封閉，200 μL/孔，37 ℃封閉1 h；經(jīng)PBST洗滌后，向孔內(nèi)分別加入多克隆抗體2倍系列稀釋液(1∶100至1∶204 800)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，同時(shí)設(shè)置同等稀釋度的非免疫兔血清作為陰性對照；經(jīng)PBST洗滌后，向各孔加入100 μL 1∶4 000稀釋的HRP-山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；經(jīng)PBST洗滌后，向各孔加入100 μL TMB底物溶液，室溫避光反應(yīng)15 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；利用Thermo Multiskan FC型酶標(biāo)儀測定D450 nm值。

1.2.9 多克隆抗體的Western blotting鑒定 取10 μL純化后的重組PDCoV-N蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過濕式轉(zhuǎn)印法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)含5%脫脂乳的PBST 4 ℃過夜封閉后，將膜與多克隆抗體稀釋液(1∶1 000)于37 ℃孵育1 h；經(jīng)PBST徹底洗滌后，將膜與HRP-山羊抗兔IgG稀釋液(1∶8 000)于37 ℃孵育1 h；經(jīng)PBST徹底洗滌后，向膜上滴加ECL發(fā)光液顯色，利用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系統(tǒng)拍照。

為進(jìn)一步驗(yàn)證制備的多克隆抗體能否識別PDCoV，將PDCoV CHN-HN-1601毒株接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的LLC-PK1細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)MOI為1)，同時(shí)設(shè)置不接毒的陰性細(xì)胞對照。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，利用NP-40裂解液裂解細(xì)胞(150 μL/孔)，10 000×g離心10 min，取上清液進(jìn)行Western blotting分析。

1.2.10 多克隆抗體的間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定 待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的LLC-PK1細(xì)胞長至80%匯合度時(shí)，接種PDCoV CHN-HN-1601毒株(MOI=1)，同時(shí)設(shè)置陰性對照細(xì)胞，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。利用預(yù)冷無水甲醇4 ℃固定細(xì)胞30 min，經(jīng)PBS洗滌后，向細(xì)胞中加入1∶1 000稀釋的多克隆抗體，置于37 ℃孵育1 h。利用PBS洗滌3次，向細(xì)胞中加入1∶1 000稀釋的Alexa Fluor 488-山羊抗兔IgG，置于37 ℃孵育1 h。經(jīng)PBS 3次洗滌后，DAPI染細(xì)胞核，利用Nikon ECLIPSE Ts2-FL型熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.11 多克隆抗體的特異性試驗(yàn) 利用IFA分析PDCoV-N蛋白多克隆抗體與PEDV、TGEV、PRoV可引起腹瀉的豬腸道冠狀病毒的交叉反應(yīng)情況，具體操作同1.2.10。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-PDCoV-N的構(gòu)建與鑒定

以PDCoV RNA為模板，基于設(shè)計(jì)的N基因引物利用RT-PCR擴(kuò)增獲得1條約1 071 bp的片段(圖1)，與預(yù)期大小一致。對重組質(zhì)粒pET-28a-PDCoV-N進(jìn)行BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定，獲得約1 036 bp的目的片段和pET-28a(+)載體片段，大小均與理論值相符；對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增出約1 071 bp的目的片段(圖2)。質(zhì)粒測序結(jié)果進(jìn)一步表明，N基因序列、插入位置及閱讀框都準(zhǔn)確無誤。

M，Trans 2K? Plus Ⅱ DNA Marker；1，PDCoV RNA；2，陰性對照

M，Trans 2K? Plus Ⅱ DNA Marker；1，pET-28a-PDCoV-N BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切鑒定；2，pET-28a-PDCoV-N PCR鑒定

2.2 重組PDCoV-N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與可溶性分析

轉(zhuǎn)化pET-28a-PDCoV-N的大腸桿菌BL21經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)12 h后，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在約42 ku處出現(xiàn)一條明顯表達(dá)的蛋白條帶，其大小與重組PDCoV-N蛋白的理論值相符，且重組PDCoV-N蛋白在上清和包涵體中均有表達(dá)(圖3)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，誘導(dǎo)的pET-28a-PDCoV-N；2，未誘導(dǎo)的pET-28a-PDCoV-N；3，誘導(dǎo)的pET-28a(+)；4，未誘導(dǎo)的pET-28a(+)；5，誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)；6，未誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21(DE3)；7，誘導(dǎo)pET-28a-PDCoV-N上清；8，誘導(dǎo)pET-28a-PDCoV-N沉淀

2.3 重組PDCoV-N蛋白的純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，上清可溶性N蛋白純化后的純度可達(dá)90%(圖4)，經(jīng)BCA法測定其終濃度為0.45 mg/mL。

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，未純化的重組PDCoV-N蛋白；2，純化的重組PDCoV-N蛋白

2.4 抗體純化效果鑒定

將兔血清用0.22 μm濾器去除雜質(zhì)經(jīng)TBS緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4)徹底洗滌后，利用甘氨酸洗脫液(pH 2.7)進(jìn)行5次洗脫，經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，第2、3次洗脫得到的抗體量最大，純化后PDCoV-N蛋白多克隆抗體的重鏈和輕鏈清晰可見(圖5)，純化過程中抗體損失較少，抗體純度較高。

2.5 多克隆抗體的效價(jià)測定

以純化后的重組PDCoV-N蛋白為包被抗原，利用間接ELISA測定多克隆抗體的效價(jià)，并以多克隆抗體孔與陰性血清對照孔D450 nm的比值(P/N)>2.1時(shí)，對應(yīng)多克隆抗體的最高稀釋度定義為多克隆抗體的效價(jià)。結(jié)果表明，純化后的兔抗PDCoV-N蛋白多克隆抗體的ELISA效價(jià)達(dá)1∶6 400(圖6)。

圖6 PDCoV-N蛋白多克隆抗體效價(jià)的ELISA測定

2.6 多克隆抗體的Western blotting鑒定

以純化的多克隆抗體為一抗，利用Western blotting檢測多克隆抗體與原核表達(dá)的PDCoV-N蛋白及PDCoV感染的LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)天然N蛋白的反應(yīng)情況。結(jié)果表明，制備的多克隆抗體能識別原核表達(dá)的PDCoV-N蛋白，在約42 ku處產(chǎn)生1條蛋白條帶(圖7A)，其大小與重組PDCoV-N蛋白的理論值相符(包括N-端和C-端的6×His標(biāo)簽及與N蛋白融合表達(dá)的部分載體序列)。此外，該多克隆抗體也能識別PDCoV感染細(xì)胞內(nèi)的天然N蛋白，在38 ku處產(chǎn)生一條蛋白條帶(圖7B)，與PDCoV天然N蛋白的理論值相符。

M，預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，純化的重組PDCoV-N蛋白；2，陰性對照LLC-PK1細(xì)胞總蛋白；3，PDCoV感染的LLC-PK1細(xì)胞總蛋白

2.7 多克隆抗體的IFA鑒定及特異性分析

以制備的多克隆抗體為一抗，利用IFA分析其與PDCoV的反應(yīng)情況。結(jié)果表明，PDCoV感染的LLC-PK1細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了特異性的綠色熒光信號，而陰性對照細(xì)胞內(nèi)未見熒光信號(圖8)，表明制備的多克隆抗體能很好地識別PDCoV。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該多克隆抗體與PEDV、TGEV、PRoV致腹瀉的豬腸道冠狀病毒無交叉反應(yīng)(圖8)，說明該多克隆抗體具有良好的特異性。

A，PDCoV感染的LLC-PK1細(xì)胞(400×)；B，LLC-PK1細(xì)胞陰性對照(400×)；C，PEDV感染的Vero細(xì)胞(200×)；D，TGEV感染的ST細(xì)胞(200×)；E，PRoV感染的MA104細(xì)胞(200×)

3 討 論

作為一種新發(fā)現(xiàn)的豬腸道致病性冠狀病毒，PDCoV已在全球主要的生豬生產(chǎn)國家和地區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[19]?？焖俸蜏?zhǔn)確地診斷對于控制PDCoV的進(jìn)一步傳播與蔓延至關(guān)重要。臨床上，PDCoV感染引起的仔豬腹瀉、嘔吐、脫水和消瘦等癥狀與PEDV、TGEV、PRoV等主要病毒性腹瀉病原感染等極其相似，因此，確診PDCoV感染離不開實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)。

目前，國內(nèi)外已研發(fā)了基于PDCoVN或M基因的RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、恒溫?zé)岣艚^式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR)和重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)等分子生物學(xué)檢測方法，可用于患病豬糞便及組織樣本中PDCoV核酸的檢測[20]。相較于分子生物學(xué)方法，PDCoV血清學(xué)檢測方法的研發(fā)工作相對滯后。多克隆抗體高度異質(zhì)，可與多種抗原表位結(jié)合，難避免非特異性反應(yīng)，但穩(wěn)定性較好。用人工方法將產(chǎn)生特異性抗體的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤，由克隆化的B細(xì)胞雜交瘤所產(chǎn)生的的抗體即為單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)。單克隆抗體高度同質(zhì)，與特定抗原表位結(jié)合，交叉反應(yīng)不常見，但穩(wěn)定性較差[17]。Chen等[2]建立了基于PDCoV M蛋白兔抗血清的IFA和免疫組化(IHC)檢測方法；Wang等[21]在制備PDCoV N蛋白鼠源特異性單克隆抗體和兔源多克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了可檢測PDCoV及其N蛋白的雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA);Su等[22]利用原核表達(dá)載體pET-32a(+)制備了PDCoV-N的His融合蛋白，并建立了基于該蛋白的PDCoV抗體的間接ELISA檢測方法；Okda等[16]借助原核表達(dá)載體pET-28a(+)也獲得了PDCoV-N的His融合蛋白，進(jìn)而建立了基于N蛋白的熒光微球免疫學(xué)檢測方法(FMIA)，可實(shí)現(xiàn)豬血清中PDCoV抗體的高通量篩查。上述研究表明，PDCoV血清學(xué)檢測方法的成功建立離不開診斷抗原的表達(dá)、純化及其多克隆抗體和單克隆抗體的制備。為了研發(fā)一種適于現(xiàn)場診斷且具有更多識別位點(diǎn)、檢測更敏感的PDCoV免疫層析檢測方法，有必要進(jìn)一步制備純度高、抗原性好的重組PDCoV-N蛋白，并制備其特異性的多克隆抗體。

本研究利用原核表達(dá)載體pET-28a(+)對PDCoV-N蛋白進(jìn)行了表達(dá)，并借助載體多克隆位點(diǎn)兩端攜帶的His標(biāo)簽對重組PDCoV-N蛋白進(jìn)行了親和純化。Okda等[16]研究發(fā)現(xiàn)，利用pET-28a(+)表達(dá)的PDCoV-N蛋白主要存在于包涵體中，需經(jīng)過蛋白質(zhì)復(fù)性后才能用作間接ELISA和FMIA的包被抗原。由于從包涵體中純化蛋白質(zhì)需進(jìn)行復(fù)性而難以保證重組蛋白的抗原性，因此，本研究在誘導(dǎo)表達(dá)PDCoV-N蛋白時(shí)對誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇0.5 mmol/L IPTG在37 ℃誘導(dǎo)12 h獲得了可溶性的PDCoV-N蛋白。由于重組PDCoV-N蛋白的N-端和-C端均攜帶6×His標(biāo)簽，故選擇在非變性條件下使用Ni-NTA瓊脂糖樹脂從菌體裂解液的上清中純化N蛋白。為提高PDCoV-N蛋白的純度，本研究在純化蛋白的過程中逐漸提高了洗滌緩沖液中的咪唑濃度(由20 mmol/L提高至100 mmol/L)，最終獲得了純度90%左右的重組PDCoV-N蛋白。純化后的重組N蛋白具有良好的抗原性，成功誘導(dǎo)免疫的家兔產(chǎn)生了特異性的免疫應(yīng)答。借助Protein A/G樹脂從免疫兔的血清中成功純化出抗PDCoV-N蛋白的多克隆抗體，其效價(jià)達(dá)1∶6 400。鑒于PDCoV與PEDV、TGEV、PRoV等致腹瀉病毒同屬于冠狀病毒科，因此有必要分析所制備的PDCoV-N蛋白多克隆抗體的特異性。本研究用IFA檢測了多克隆抗體與PEDV、TGEV和PRoV的交叉反應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然這幾種病毒的親緣關(guān)系較近，但本研究所制備的多克隆抗體僅識別PDCoV-N蛋白和PDCoV毒株，與PEDV、TGEV、PRoV不存在交叉反應(yīng)，說明制備的多克隆抗體具有良好的特異性。本試驗(yàn)結(jié)果與Su等[22]報(bào)道的研究結(jié)果一致，即基于PDCoV-N的His融合蛋白的間接ELISA與PEDV豬抗血清無交叉反應(yīng)。Ma等[23]研究發(fā)現(xiàn)，美國的PEDV VBS2毒株與PDCoV Michigan/8977/2014毒株的N蛋白之間可能存在1個(gè)或多個(gè)共同的抗原表位，具體表現(xiàn)為這2個(gè)毒株與對方的豬抗血清之間存在雙向交叉反應(yīng)；2個(gè)毒株之間的交叉反應(yīng)僅出現(xiàn)在間接ELISA和Western blotting試驗(yàn)中，而在IFA或IHC檢測病毒感染細(xì)胞、攻毒豬的腸道組織以及病毒中和試驗(yàn)中未出現(xiàn)；然而，該研究并未進(jìn)一步闡明該表位在N蛋白中的具體位置。因此，目前本研究無法分析中國豬場中PDCoV流行毒株及本研究中所使用的CHN-HN-1601毒株的N蛋白中是否也存在一個(gè)類似的抗原表位，仍有待于進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié) 論

本研究借助原核表達(dá)系統(tǒng)與鎳柱親和層析純化方法，在獲得高純度重組PDCoV-N蛋白的基礎(chǔ)上，制備了N蛋白的兔源多克隆抗體。該多克隆抗體能特異性識別重組的PDCoV-N蛋白及PDCoV的天然N蛋白，與PEDV、TGEV、PRoV 3種主要致腹瀉的豬腸道冠狀病毒無交叉反應(yīng)。重組PDCoV-N蛋白及其多克隆抗體的成功制備，可為PDCoV免疫層析方法的建立及開展PDCoV相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考借鑒。